蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性及其對策

1、蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性1、物理不穩(wěn)定性變性、聚集、吸附、大分子的可溶性2、化學不穩(wěn)定性水解、氧化、消旋、與溶質(zhì)及表面間的反應蛋白質(zhì)分子與小分子物質(zhì)穩(wěn)定性比較蛋白質(zhì)小分子大量潛在的反應位點很少反應位點大量離子化位點很少離子化位點緩沖作用通常是唯一的酸/堿催化緩沖作用通常是廣泛的酸/堿催化有二級、三級、四級高級結(jié)構(gòu)沒有高級結(jié)構(gòu)分散（膠體）水相溶液中為單一相和連續(xù)相溫度效應是間斷的（變性）溫度效應是連續(xù)的易支持微生物生長蛋白質(zhì)藥品中添加劑的作用 1.抗微生物保藏劑 2.可溶性增強劑 3.凍干產(chǎn)品填充劑 4.等滲溶液添加劑蛋白質(zhì)中常見的穩(wěn)定性與相容性問題及解決方法穩(wěn)定性問題可能的解決方案水解、脫氨（如天冬酰

2、胺）控制PH、緩沖液、低離子強度氧化（如甲硫氨酸氧化）抗氧化劑、螯合劑、低PH、無氧加工與包裝過程-消除反應低PH、螯合劑轉(zhuǎn)肽作用控制PH、低濃度外消旋作用控制PH、緩沖液二硫鍵交換硫醇的消除（如半胱氨酸）冷凍干燥過程中的變性防凍劑/防失水劑凝集、沉淀控制PH、表面活性劑、減低機械壓力表面吸附表面活性劑、白蛋白、預飽和化學穩(wěn)定性 1.PH、水解和緩沖液 2.氧化、抗氧化劑和其他抗氧化方法 3.其它化學不穩(wěn)定性及制劑方法1.PH、水解和緩沖液 穩(wěn)定性、可溶性和PH遵循一個規(guī)律： 高溶解度導致低化學穩(wěn)定性；低溶解度導致低物理穩(wěn)定性。 例子：胰島素溶解度與脫氨反應 1.水解和脫氨反應 氨基酸：天冬酰

3、胺和谷氨酰胺 影響因素：極端PH、溫度和離子強度 最明顯的例子：中性和堿性條件下提高蛋白質(zhì)的脫氨速度（主要是Asn-Gly），脫氨速率高于水解速率 改善方法：降低PH。酸性PH條件下脫氨速率低于中性和堿性PH，但是PH的降低可能導致Asp-X（小分子側(cè)鏈，甘氨酸或絲氨酸）殘基處的裂解或環(huán)化。緩沖液 目的：用于防止溶液中小的PH值改變，這些改變影響著蛋白質(zhì)可溶性和穩(wěn)定性。 注意的問題： 1.放大及生產(chǎn)規(guī)模中找到滿足要求的緩沖系統(tǒng)可能困難，需要借助于酸堿調(diào)節(jié)。它們可能改變緩沖系統(tǒng)的緩沖能力，離子強度。 2.為更好的控制PH，增強緩沖能力將顯著提高離子強度。 3.普通的酸和/或堿催化可能加速蛋白質(zhì)的

4、降解。 4.冷凍干燥過程中緩沖液的結(jié)晶化可能改變?nèi)芤豪鋬鰸饪s時的PH，影響藥物穩(wěn)定性。2.氧化、抗氧化劑和其他抗氧化方法 1.甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、組氨酸、色氨酸和酪氨酸對氧化和光解敏感，與蛋白質(zhì)構(gòu)型及氨基酸最終溶劑和環(huán)境條件相關，如氧、光、熱、金屬離子及各種自由基激活劑。 2.巰基氨基酸的氧化（蛋氨酸和半胱氨酸）可能導致二硫鍵的形成和生物活性的喪失。 3.游離巰基可能氧化形成不正確的二硫鍵，而且可能導致其它降解反應，如烷基化、雙鏈加成作用和與重金屬發(fā)生配位作用。 4.空氣中的氧會引發(fā)蛋氨酸殘基的氧化反應。 蛋白質(zhì)制劑中的抗氧化劑和螯合劑試劑制劑中的使用濃度/%抗氧化劑（所以水溶液）抗壞

5、血酸（異抗壞血酸、抗壞血酸鈉）0.1-1.0亞硫酸鹽（亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉）0.1-0.5硫甘油0.1-0.5巰基乙酸0.05-0.2半胱氨酸鹽酸鹽0.1-0.5螯合劑（所有水溶液）乙二胺四乙酸（EDTA）（通常為鈉鹽） 0.05-0.1檸檬酸/檸檬酸鹽0.02-1制劑中使用抗氧化劑常出現(xiàn)的問題 1.Fe3+和氧存在時，抗壞血酸誘導蛋氨酸氧化 2.與其它緩沖液相比（Tris、HEPES、MOPS ），磷酸鹽緩沖液在有抗壞血酸存在時加速蛋氨酸氧化 3.抗壞血酸-蛋氨酸氧化的氧化強化劑作用具濃度依賴性，多數(shù)發(fā)生在PH6-7 4.亞硫氨酸氫鹽導致的蛋白穩(wěn)定性問題：亞硫酸氫鹽加速胰島素破壞防止氧化降解的措施 1.低溫下制備與儲藏 2.使用螯合劑消除金屬催化反應 3.提高離子強度，減少二硫鍵的形成 4.消除過氧化物和金屬污染物 5.避光 6.注意光反應和磷酸鹽緩沖液條件下可能形成游離基的反應 7.生產(chǎn)過程中用氮或氬代替氧 8.當需維持所需蛋白質(zhì)的可溶性和抗水解穩(wěn)定性時，盡可能在低PH下進行，因為抗氧化穩(wěn)定性與PH呈負相關。 9.為抑制游離基形成和微量金屬離子所導致的蛋白氧化，使用螯合劑其它蛋白質(zhì)化學不穩(wěn)定性及制劑方法 1.消除：發(fā)生在低溫和高PH，堿性條件下顯著加速； 氨基酸包括半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和賴氨酸 對策：降低PH 2.二硫鍵斷裂 原因：溫度過高 對策：降