凋亡素基因重組腺病毒的構(gòu)建

1、凋亡素基因重組腺病毒的構(gòu)建【摘要】 目的 構(gòu)建攜凋亡素基因的腺病毒載體，為進(jìn)一步研究凋亡素基因功能及其作用機(jī)制建立基礎(chǔ)。方法 Pmel酶切線性化已經(jīng)構(gòu)建好的含凋亡素基因的穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMVVP3，然后電轉(zhuǎn)化到BJ5183AD1細(xì)胞中進(jìn)行同源重組。Pac酶切出含凋亡素基因的腺病毒DNA，然后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行包裝獲得重組腺病毒，運(yùn)用RTPCR鑒定重組腺病毒。用氯化銫梯度離心純化病毒。用物理和生物方法確定病毒的滴度。結(jié)果 Pac酶切證實(shí)同源重組成功。綠色熒光觀察證實(shí)病毒包裝成功并且具有感染力，RTPCR證實(shí)了重組腺病毒具有凋亡素蛋白的編碼。重組腺病毒的濃度為84.52×109

2、 VP/ml，滴度為6.561×109 PFU/ml。結(jié)論 成功構(gòu)建含凋亡素基因的重組腺病毒，它的滴度足以滿足體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)。 【關(guān)鍵詞】 凋亡素基因 腺病毒載體 基因治療 【Abstract】 Objective To construct a recombinant adenovirus carrying Apoptin gene so as to provide basis for further studying Apoptin gene functions and ascertaining corresponding mechanism. Methods The shuttle

3、vector pAdTrackCMVVP3 containing Apoptin gene was linearized with Pmel and subsequently electrotransformed into BJ5183AD1 cells for homologous recombination. The DNA containing Apoptin gene of the recombinant adenovirus was obtained by digesting with PacI and then transfected into 293 cells, where t

4、he recombinant adenovirus containing Apoptin gene was identified by RTPCR and purified by cesium choride density centrifugation. Finally, the titre of the recombinant adenovirus was determined by biological and physical assays. Results Digestion with PacI proved successful homologous recombination.

5、Green fluorescence showed successful recombinant adenovirus with infectiveness. RTPCR confirmed that the recombinant adenovirus had coding of Apoptin gene proteins. The titre of the recombinant adenovirus was 84.52×109 VP/ml and 6.561×109 PFU/ml. Conclusion The recombinant adenovirus vecto

6、r containing Apoptin gene is successfully constructed, with its titre sufficient for in vivo and in vitro experiment. 【Key words】 Apoptin gene; Adenovirus vector; Gene therapy 凋亡素，又稱Apoptin(apoptosis induction)1，是來源于雞貧血病毒(chicken anemia virus,CAV)的小分子蛋白質(zhì)。它能引發(fā)一些腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而對正常細(xì)胞無此作用。在腫瘤的治療上具有巨大潛力1。由

7、于凋亡素是外來物質(zhì)，在發(fā)揮作用前必須進(jìn)入細(xì)胞，所以我們選擇腺病毒作為載體來運(yùn)載它，以期能探索它的作用機(jī)制，為腫瘤的治療提供新的途徑。 1 材料與方法 1.1 含凋亡素基因的穿梭質(zhì)粒PAdtrackCMVVP3的獲得2我們已經(jīng)成功構(gòu)建了含凋亡素基因的穿梭質(zhì)粒，并且通過了酶切和測序鑒定，為下一步實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行奠定了基礎(chǔ)2。 1.2 含凋亡素基因的腺病毒基因組(PAdVP3)質(zhì)粒的構(gòu)建 1.2.1 同源重組 pAdTrackCMVVP3用Pmel酶切，線性化，再用堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)進(jìn)行去磷酸化處理，最后電轉(zhuǎn)化(BioRad Gene Pulser Electr

8、opoerator 2 500 V 200 max)到BJ5183AD1細(xì)胞中，與其內(nèi)的pAd Easy1進(jìn)行同源重組。設(shè)置陰性對照組為空載體pAdTrackCMV，經(jīng)過以上處理后同樣進(jìn)行同源重組。 1.2.2 酶切鑒定 只有重組成功才能用Pac酶切出兩個不同長度的條帶：長的為23 kb，短的根據(jù)重組位點(diǎn)不同而不同，可以為3.0或4.5 kb條帶。無論在何位點(diǎn)重組均不影響pAdVP3腺病毒基因組的功能。 1.3 含凋亡素基因腺病毒DNA的獲得 從含pAdVP3腺病毒基因組的質(zhì)粒中使用Pac酶切，然后用膠回收23 kb的DNA片段，即重組腺病毒基因組。 1.4 重組腺病毒在293細(xì)胞內(nèi)的包裝、擴(kuò)

9、增及鑒定 1.4.1 重組腺病毒的包裝 將獲得的重組腺病毒DNA轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。6孔細(xì)胞培養(yǎng)板種入2×105細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到60%，除去培養(yǎng)基，用不含小牛血清的DMEM洗滌細(xì)胞(5 min)，加入500 l不含小牛血清的DMEM與5 g 重組腺病毒DNA和5 l Lipofectamine reagent的混合物(混合10 min后加入)，空白對照用不含目的基因的腺病毒DNA轉(zhuǎn)染。37 孵育箱中孵育3 h，吸取培養(yǎng)基，加入4 ml培養(yǎng)基重新孵育67 h后，再次更換培養(yǎng)基37 孵育57 d，此期間細(xì)胞長滿后可以傳代至大的培養(yǎng)瓶內(nèi)繼續(xù)生長。每天用熒光顯微鏡觀察有否熒光蛋白以判斷有無病

10、毒的產(chǎn)生。當(dāng)50%細(xì)胞出現(xiàn)熒光蛋白時不再傳代和換液，只是加液，直到病毒的繼續(xù)產(chǎn)生。此時收集培養(yǎng)液和細(xì)胞，將上述細(xì)胞懸液移入5 ml的離心管中，并在-80 和37 水浴中反復(fù)凍融3次，每次凍融后，旋轉(zhuǎn)離心管1次，以使細(xì)胞懸液充分凍融，室溫下，12 000×g離心10 min，沉淀細(xì)胞碎屑，將上清液(主要成分為病毒原液)移入新的離心管中于-80 保存。 1.4.2 重組腺病毒的擴(kuò)增 將AD293細(xì)胞接種于6孔板上，使每孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)達(dá)到(78)×105。吸去培養(yǎng)液，然后加入1 ml新鮮培養(yǎng)液，同時加入200 l病毒原液混勻，37 孵育2 h，再加入2 ml培養(yǎng)液繼續(xù)孵育。每日用熒光

11、顯微鏡觀察情況。當(dāng)有病毒產(chǎn)生后即按上述方法收集病毒液。 1.4.3 重組腺病毒的鑒定 由于我們已經(jīng)通過觀察熒光蛋白的情況證實(shí)了重組腺病毒是包裝出來的，并且具有感染能力。下一步需證實(shí)的是該腺病毒是否有目的蛋白的編碼。采用RTPCR方法鑒定。轉(zhuǎn)染后48 h，用Trizol抽提各孔細(xì)胞的總RNA，以O(shè)ligo(dT)為引物合成cDNA。然后以cDNA為模板，用人工合成的凋亡素基因上下游引物行PCR檢測。 1.5 重組腺病毒的純化及滴度測定 我們將擴(kuò)增的病毒送成都基因治療腫瘤藥物工程技術(shù)研究中心純化和滴度測定。 1.5.1 純化 采用氯化銫梯度離心方法純化。 1.5.2 滴度測定 1.5.2.1 物理

12、檢測：物理檢測指腺病毒蛋白和DNA(主要是DNA)能吸收紫外線的特性來測定，其對應(yīng)公式為：1OD=1.1×1012病毒數(shù)。根據(jù)這個線性關(guān)系能測出病毒的實(shí)際病毒數(shù)。 1.5.2.1 生物檢測：我們采用嗜斑形成單位(plaque forming units,PFU)來描述病毒的感染力。既通過觀察細(xì)胞病變(cytopathic effect,CPE)來確定病毒的感染能力。用5% FBSDMEM將待測樣本稀釋至其106倍，再在盛2 ml 5% FBSDMEM培養(yǎng)液離心管(5 ml)中進(jìn)行3倍倍比稀釋(12)，共12管，各管有病毒液2 ml。用5% FBSDMEM培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞密度為1×

13、;105/ml，在96孔培養(yǎng)板中每孔加入此細(xì)胞懸液100 l，置于37 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)液，將倍比稀釋的第1管病毒液加入第1列，第2管病毒液加入第2列，100 l/孔，直至第12管。培養(yǎng)后第12天顯微鏡下觀察各孔，以培養(yǎng)孔中發(fā)生病變細(xì)胞數(shù)多于50為陽性，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞孔數(shù)。并以下式計(jì)算所測樣本病毒顆粒滴度3： 腺病毒載體滴度 =稀釋倍數(shù)×稀釋度(CPE陽性細(xì)胞孔數(shù)-4)/8 =106×3(CPE陽性細(xì)胞孔數(shù)-4)/8(PFU/ml) 2 結(jié)果 2.1 含凋亡素基因的腺病毒基因組(PAdVP3)質(zhì)粒的獲得(見圖1) 圖1 含凋亡素基因腺病毒基因組質(zhì)

14、粒的Pac酶切圖 M: Hind,DNA Marker； 1：含腺病毒DNA的質(zhì)粒Pac酶切電泳 從圖1中可以看出：Pac酶切能切出兩個條帶：大于23 kb和4.5 kb的條帶。表示同源重組成功。 2.2 重組腺病毒的包裝 當(dāng)感染病毒后293細(xì)胞增大，細(xì)胞絲狀結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞核增大，到第3天時，可觀察到細(xì)胞已崩解成熒光碎片。由于有新病毒的產(chǎn)生，可使受感染的293細(xì)胞數(shù)目增多，到第5天，細(xì)胞全部出現(xiàn)熒光蛋白，隨后熒光減弱，表示病毒已開始從多數(shù)的細(xì)胞內(nèi)釋放。到第7天時大部分細(xì)胞脫落，可看到細(xì)胞有發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，并且細(xì)胞脫壁，漂浮在培養(yǎng)液中出現(xiàn)細(xì)胞崩解釋放病毒。此時收集病毒液。見圖2。 2.3

15、 重組腺病毒的鑒定(見圖3) 從圖3可看出：含凋亡素基因的腺病毒具有編碼凋亡素蛋白的活性。而不含凋亡素基因的腺病毒不具有。 2.4 重組腺病毒的滴度測定 2.4.1 物理檢測 重組腺病毒的濃度為84.52×109 VP/ml，見圖4。不含凋亡素基因的腺病毒的濃度為67.14×109 VP/ml，見圖5。 2.4.2 生物檢測 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，重組腺病毒及不含凋亡素基因的腺病毒均可見68個陽性孔(發(fā)生細(xì)胞病變率大于50%)，故滴度均為：106×3(68-4)/8=6.561×109 PFU/ml。 圖3 重組腺病毒的RTPCR M: DL2000 DNA Mar

16、ker； 1： 不含凋亡素基因的腺病毒感染293細(xì)胞后的RTPCR結(jié)果； 2： 含凋亡素基因的腺病毒感染293細(xì)胞后的RTPCR結(jié)果。 3 討論 腺病毒載體是目前基因治療研究和臨床應(yīng)用中采用最多的載體，它具有不整合入細(xì)胞基因組，毒性低，致病性小，宿主范圍廣，對分裂及非分裂期細(xì)胞有較高的感染率和滴度，裝載容量大等特點(diǎn)。已廣泛用于基因治療研究4，且已被美國FDA批準(zhǔn)作為基因治療載體應(yīng)用于臨床試驗(yàn)。 本實(shí)驗(yàn)的AdEasy系統(tǒng)為Johns Hopkins大學(xué)癌癥研究中心He博士構(gòu)建5。與以前的腺病毒構(gòu)建相比，它有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)腺病毒基因組是以超螺旋形式存在大腸桿菌中，而非哺乳細(xì)胞內(nèi)，可使同源重組效率

17、由傳統(tǒng)方法的20%提高到80%90%，并且方便酶切鑒定；(2)在產(chǎn)生含目的基因的腺病毒基因組過程中，沒有連接步驟，增加了目的基因?qū)胂俨《净蚪M的效率和準(zhǔn)確性；(3)能接入高達(dá)10 kb的目的基因，并且允許導(dǎo)入多個基因；(4)腺病毒基因組中含有綠色熒光蛋白基因，便于直接觀察轉(zhuǎn)染和感染的效率，使實(shí)驗(yàn)可靠和準(zhǔn)確；(5)該系統(tǒng)使用的是人的腺病毒屬和人的宿主細(xì)胞系，故其能表達(dá)多種蛋白質(zhì)并能正確進(jìn)行翻譯后的修飾和折疊。因此用此構(gòu)建產(chǎn)生的病毒可以不用嗜斑純化就能獲得含目的基因的腺病毒，從而大大減少了復(fù)制活性病毒的產(chǎn)生。我們在構(gòu)建含凋亡素基因的腺病毒過程中，在熒光蛋白的指示下，能充分觀察到含目的基因的腺病毒

18、基因組轉(zhuǎn)染293細(xì)胞的情況，在第7天觀察到大量293細(xì)胞脫落、崩解，與文獻(xiàn)報(bào)道的一致5。與沒有熒光蛋白指示的轉(zhuǎn)染靠主觀判斷來決定病毒產(chǎn)生時間相比，充分保證了最高滴度病毒的獲取，為病毒的純化創(chuàng)造了條件。 病毒顆粒(viral particles,VP)或光學(xué)顆粒(optical partical unit,OPU)是物理方法檢測的結(jié)果。它不能區(qū)別傳染型和缺陷型病毒，但它的結(jié)果從一個實(shí)驗(yàn)室到另一個實(shí)驗(yàn)室都很恒定。而基因轉(zhuǎn)移單位(gene transfer unit,GTU)和PFU是生物方法檢測的結(jié)果。他們能具體說明病毒感染細(xì)胞的能力，但不同實(shí)驗(yàn)室給出的結(jié)果是各不相同的，使交流受限6。所以我們同時

19、采用以上兩種方法來說明病毒的量和活力，為以后的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。 293細(xì)胞是轉(zhuǎn)染腺病毒E1A基因的人胚腎上皮細(xì)胞系，有致瘤性，是轉(zhuǎn)化細(xì)胞。由于凋亡素基因具有引發(fā)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤細(xì)胞凋亡的特性，那么它會引發(fā)293細(xì)胞的凋亡，從而阻止病毒顆粒的包裝嗎?答案是否定的。因?yàn)榈蛲鏊鼗蚓幋a的凋亡素蛋白需定位到細(xì)胞核，并且有量的積累才能引發(fā)細(xì)胞的凋亡，那么在這一過程中病毒已經(jīng)包裝成功并且釋放出來7。Pietersen等8用PCMVVP3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293、911和PER.C6細(xì)胞(均是腺病毒的包裝細(xì)胞)，在不同時間點(diǎn)收集這些細(xì)胞檢測凋亡率，發(fā)現(xiàn)在48 h，包裝細(xì)胞的凋亡率為25%；5 d達(dá)到80%。而腺病毒的包裝

20、到釋放一共才需48 h8。因此凋亡素蛋白的作用并不影響腺病毒的包裝和釋放。我們的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了凋亡素基因的功能并不影響腺病毒的包裝和釋放。細(xì)胞感染病毒后會出現(xiàn)一些不同于凋亡的形態(tài)變化，這些變化稱為CPE。首先是細(xì)胞形態(tài)的變化，由于病毒能增強(qiáng)細(xì)胞膜的滲透性，細(xì)胞外的離子如鈉離子流入胞內(nèi)，細(xì)胞可從原來的形態(tài)變?yōu)閳A形，然后由于細(xì)胞支架的降解或破裂導(dǎo)致細(xì)胞從基質(zhì)上脫落，最后破裂。也可出現(xiàn)臨近細(xì)胞的膜融合形成一個含有多個核的大細(xì)胞，稱為多核體。多核體細(xì)胞生存短暫，隨即裂解，釋放出病毒6。我們從293細(xì)胞的熒光照片觀察到如下現(xiàn)象：細(xì)胞由原來的梭形變?yōu)閳A形，細(xì)胞核增大，核質(zhì)比例明顯增大，細(xì)胞逐漸從貼壁生長中松

21、脫，漂浮于培養(yǎng)液中，約到第7天細(xì)胞崩解釋放出病毒。以上這些變化充分說明了含凋亡素基因的腺病毒能在293細(xì)胞內(nèi)包裝成熟后釋放。 本研究成功的構(gòu)建了凋亡素基因重組腺病毒。我們希望能夠以腺病毒載體為介導(dǎo)，進(jìn)一步研究凋亡素基因?qū)ο滥[瘤的作用機(jī)制，為消化道腫瘤的基因治療提供候選基因，并為臨床前研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Rohn J L, Noteborn M H. The viral death effectou Apoptin reveals tumorspecific processesJ. Apoptosis, 2004,9(3):315-337.2 陳健，王曙光.凋亡素基因轉(zhuǎn)染對人

22、膽管癌細(xì)胞凋亡作用的研究J.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，27(15)：1593-1595.3 Keriel A, Rene C, Galer C, et al. Canine adenovirus vectors for lungdirected gene transfer: efficacy, immuneresponse, and duration of transgene expression using helperdependent vectorsJ. J of Virology,2006,80(3):1487-1496.4 Bernt K M, Ni S, Tieu A T, et al. Assessment of a combined adenovirusmediated oncolytic a