余甘子提取物對小鼠免疫功能的影響

1、余甘子提取物對小鼠免疫功能的影響 作者：崔炳權， 何震宇， 楊澤民， 林元藻【摘要】 目的探討余甘子對小鼠免疫功能的影響。方法用不同劑量余甘子提取物給正常小鼠連續(xù)灌胃,檢測血清溶血素含量、腹腔巨噬細胞吞噬功能、遲發(fā)型變態(tài)反應、T淋巴細胞增殖和NK細胞活性。結果余甘子提取物能增加小鼠血清溶血素含量、明顯增強小鼠巨噬細胞吞噬功能、改善遲發(fā)型變態(tài)反應，促進T淋巴細胞增殖，提高NK細胞活性。結論余甘子能顯著增強小鼠免疫功能。 【關鍵詞】 余甘子; 免疫功能; 溶血素; T淋巴細胞; 巨噬細胞; NK細胞; 遲發(fā)型變態(tài)反應余甘子Phyllanthus emblica L.又名山油柑、油甘子、余甘果等，為

2、大戟科葉下珠屬植物余甘子的成熟果實，廣泛分布在廣東、福建、臺灣、貴州、湖南、廣西、四川、浙江和云南等省區(qū)。余甘子果入藥，中醫(yī)學認為，余甘子性味甘、酸、澀、涼, 歸肺、胃經(jīng)。其功能與主治為清熱涼血，消炎, 消食健胃, 生津止咳;用于血熱血瘀、消化不良、腹脹、咳嗽、喉痛及口干1。明本草綱目曾記載：“余甘子果，主補益氣，久服輕身，延年益壽” 。余甘子的藥理作用的研究報道很少，為了探討余甘子的抗腫瘤作用，本實驗研究了余甘子提取物對小鼠免疫功能影響，旨在了解余甘子的免疫藥理作用機制，為研究其抗腫瘤機制提供研究資料，為余甘子的食用和藥用價值的開發(fā)提供實驗依據(jù)。1 材料1.1 材料、藥品與試劑余甘子采購自四

3、川鹽源縣。經(jīng)廣東藥學院中藥學院藥用植物與中藥鑒定學教研室李書淵教授鑒定為戟科葉下珠屬植物余甘子Phyllanthus emblica L.的成熟果實。余甘子提取物制備：將余甘子晾干，取適量余甘子，常規(guī)水煎2次，過濾后混合并濃縮成1g 生藥/ml，4保存?zhèn)溆谩?，4二硝基氟苯(DNFB)，二甲基亞砜(DMSO)，上海試劑一廠產(chǎn)品。RPMI-1640，MTT，PHA，Sigma產(chǎn)品。721型分光光度計，CO2培養(yǎng)箱，酶標儀，離心機。1.2 動物昆明種清潔級小鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量為(20±2) g，由廣州市白云區(qū)穗北實驗動物養(yǎng)殖場提供。2 方法2.1 余甘子提取物對小鼠體液免疫功能的影響采

4、用溶血素測定法2：小鼠40只,體質(zhì)量(20±2) g，隨機分為4組，每組10只?？瞻讓φ战M，每天灌胃蒸餾水0.5 ml/只;試藥大劑量組、中劑量組、小劑量組，每只每天分別灌胃余甘子提取物45,30,15 mg/kg，連續(xù)12 d。給藥第2天，每只小鼠腹腔注射5%綿羊紅細胞懸液0.2 ml免疫，末次給藥后禁食24 h，斷頭取血并分離血清，將血清用生理鹽水按150稀釋，取血清1 ml，加5% 綿羊紅細胞懸液0.5ml和補體1 ml，37水浴10 min，冰浴，離心,取上清液1 ml，測定A540，計算樣品的半數(shù)溶血值(HC50 )。 用HC50代表血清溶血素水平。2.2 余甘子提取物對小

5、鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響3小鼠40只，分組及給藥天數(shù)和劑量同實驗“2.1”項。第12天小鼠稱重，后腹腔注射5%淀粉肉湯1 ml，致敏24 h后，腹腔注射1 ml 5%雞紅細胞懸液，4 h后脫臼處死，腹腔注入5 ml冷Hanks液，按摩腹部5 min后，解剖，無菌吸取腹腔液涂片，晾干，甲醇固定5 min，瑞-姬氏復合染色劑染色，鏡檢，在油鏡下觀察，隨機計數(shù)100個吞噬細胞中吞噬雞紅細胞及吞噬的雞紅細胞總數(shù)，并計算巨噬細胞吞噬百分率與吞噬指數(shù)。2.3 余甘子提取物對小鼠T淋巴細胞增殖反應的影響T淋巴細胞增殖反應測定(MTT法)4：小鼠40只，分組及給藥天數(shù)和劑量同實驗“2.1”項。12 d后脫

6、頸處死，無菌取脾，制細胞懸液(5×106 /ml)，加入96孔培養(yǎng)板，每孔100 l，再加入含PHA (10 g/ml) 的RPMI-1640培養(yǎng)液100 l，每個樣品設3個復孔，37 CO2 培養(yǎng)箱中孵育27 h，后每孔加入MTT (5 mg/l)10 l ，振蕩1 min，放入37 CO2 培養(yǎng)箱反應3 h，取出離心，棄上清，每孔加DMSO200 l，混勻，振蕩5 min，酶標儀測A500。結果以3個復孔的±s表示。2.4 余甘子提取物對特異性細胞免疫功能的影響DNFB 誘導小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應的測定2，5：小鼠40只，分組及給藥天數(shù)和劑量同實驗“2.1”項。給藥后第6天

7、進行致敏，在小鼠后肢皮下注射0.02 ml1% DNFB，給藥第10天同法第2次致敏，于第1次致敏的第9天，用1% DNFB 0.02 ml涂于右耳進行攻擊，左耳涂布生理鹽水作為對照。次日處死，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑8 mm的打孔器分別在左、右耳同一部位打下耳片，稱重。以耳腫脹度(EPR左右耳片重量之差)作為遲發(fā)型變態(tài)反應的指標。2.5 余甘子提取物對非特異性細胞免疫功能的影響NK細胞活性測定2：小鼠40只，分組及給藥天數(shù)和劑量同實驗“2.1”項。12 d后，處死取脾，制成細胞懸液，按乳酸脫氫酶(LDH)法，酶標儀測A490值。2.6 數(shù)據(jù)處理實驗結果以±s表示，用spss11軟

8、件進行統(tǒng)計分析比較，采用單因素方差分析檢驗其顯著性。3 結果3.1 余甘子提取物對小鼠體液免疫功能和腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響結果見表1。與對照組相比，灌胃給藥組都能顯著提高血清血溶素水平(P<0.05)，但組間比較無顯著差異(P>0.05)，無顯著量-效關系。與對照組比較，灌胃給藥組的吞噬百分率和吞噬指數(shù)有顯著性差異(P<0.05)，提示余甘子提取物能提高小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬功能;巨噬細胞吞噬指數(shù)和吞噬百分率均隨劑量增加而增加，但劑量增加到一定程度后，其作用效果就不再增加(中劑量組和大劑量組之間的吞噬百分率和吞噬指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義，P&g

9、t;0.05)。表1 余甘子提取物對小鼠體液免疫功能和腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響3.2 余甘子提取物對小鼠T細胞增殖反應、遲發(fā)型變態(tài)反應和NK細胞活性的影響表2結果顯示：余甘子提取物能增強經(jīng)PHA誘導的小鼠T淋巴細胞轉(zhuǎn)化。灌胃給藥組與對照組比較,差異有顯著性( P<0.05) 。說明余甘子提取物能顯著增強T細胞增殖反應，而且作用呈量-效關系。各組小鼠耳腫脹度隨劑量而逐漸增加，中、大劑量組腫脹度與對照組相比差異有顯著性(P<0.05)，提示余甘子提取物能可以改善DNFB 誘導的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應，對小鼠特異性細胞免疫功能有促進作用。NK細胞活性隨劑量而增加，特別是中、

10、大劑量組NK細胞活性增加極顯著(P<0.01)，但中、高劑量組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。表2 余甘子提取物對小鼠T細胞增殖反應、遲發(fā)型變態(tài)反應和NK細胞活性的影響4 討論T、B 淋巴細胞是體內(nèi)的免疫活性細胞，它們的激活、分化和增殖在免疫應答過程中起著重要作用6。巨噬細胞是機體內(nèi)生物學作用最為活躍的細胞，具有吞噬、殺傷及消化病原體、殺傷腫瘤細胞，并在特異性免疫應答中參與抗原的提呈及免疫調(diào)節(jié)作用3。NK細胞(natural killer cell,自然殺傷細胞)是與T、B并列的第三類群淋巴細胞，屬于非特異性免疫細胞，它們無需抗原預先致敏，就可直接殺傷某些腫瘤細

11、胞和病毒感染靶細胞，在機體抗腫瘤和早期抗病毒和胞內(nèi)寄生菌感染的免疫過程中起重要作用。此外，NK 細胞活化后還可通過分泌IFN-、IL-2 和TNF 等細胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。因此，NK細胞具有抗腫瘤、抗感染、免疫調(diào)節(jié)等功能7。遲發(fā)型變態(tài)反應是由T細胞介導的細胞免疫應答的一種類型,也是常見的一種免疫反應8。這些免疫活性細胞與體液免疫共同構成機體的免疫防御系統(tǒng)。實驗結果顯示，余甘子提取物能增強小鼠溶血素形成的能力，提示其能提高抗原誘導循環(huán)抗體水平，從而實現(xiàn)提高機體的體液免疫力的作用;能提高小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬功能、促進淋巴細胞轉(zhuǎn)化;能改善小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應，對小鼠特異性細胞免疫功能有促進作用;

12、能提高NK細胞活性，增強小鼠非特異性細胞免疫功能。以上結果表明，余甘子提取物具有良好的免疫增強作用，它可能通過增強B淋巴細胞產(chǎn)生特異性抗體，促進溶血，從而使血清溶血素含量增加，促進小鼠的體液免疫功能;也可能刺激T 淋巴細胞轉(zhuǎn)化為致敏淋巴細胞，增強遲發(fā)性變態(tài)反應，提高巨噬細胞和NK細胞活性，促進小鼠的細胞免疫功能，而促進巨噬細胞活性和T淋巴細胞增殖及使NK 細胞活性提高，可能是余甘子抗腫瘤的作用機制之一。另外，從實驗結果綜合分析，中劑量(30 mg·kg-1·d-1) 余甘子提取物對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)效果較好。本實驗對余甘子調(diào)節(jié)免疫功能的藥理作用作了初步研究，目的為余甘子藥理

13、機制的研究和開發(fā)利用提供實驗資料和依據(jù)。有關余甘子藥理作用機制及其活性物質(zhì)篩選還有待于進一步研究探討?！緟⒖嘉墨I】 1 張福平. 余甘子的營養(yǎng)價值J. 中國食物與營養(yǎng),2004,10(1):25.2 李彥博,王 倩,張炳楨.牡丹皮對小白鼠免疫功能的影響J.中華中醫(yī)藥學刊，2007, 25(3):576.3 伍 楊,劉錦紅,聶 青.長葉胡頹子葉對小鼠免疫功能的影響J.時珍國醫(yī)國藥，2006,17(8):1403.4 秦紅兵,楊朝曄,劉紅旗，等. 麋鹿角醇提液對正常小鼠免疫功能的影響J. 中成藥，2006,28(12):1813.5 陳子珺,李云森,周吉燕，等. 香茶菜的免疫藥理作用研究J.中國藥學雜志，200