實驗 溶菌酶的粗提取、分離純化及酶活力、純度及分子量測定ppt課件

1、實驗1-3 溶菌酶的提取分離及鑒定（酶活力、純度及分子量測定）1;.2實驗內(nèi)容1. 溶菌酶的粗提取2. 溶菌酶的分離純化及酶活力、蛋白濃度測定3. 溶菌酶純度鑒定與分子量測定3背景知識溶菌酶（lysozyme）：胞壁質(zhì)酶（muramidase）或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶。生物學效應：主要通過破壞細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的-1,4糖苷鍵，使細胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導致細胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細菌溶解。該酶活性可被一些金屬離子Cu2+，F(xiàn)e2+，Zn2+以及N-

2、乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+，Ca2+、NaCl所激活45溶菌酶理化性質(zhì)：溶菌酶理化性質(zhì)：相對分子質(zhì)量相對分子質(zhì)量14700 Da，由，由129個個氨基酸氨基酸殘基構(gòu)殘基構(gòu)，pI:10.8，最適溫度為，最適溫度為50，最適最適pH為為67左右。左右。280nm的消光系數(shù)為的消光系數(shù)為13.06背景知識：背景知識：酶的提取、分離純化酶的提取、分離純化l初步純化初步純化（rough fractionation） （提?。海ㄌ崛。喊衙笍纳锝M織或細胞中以溶解狀態(tài)釋放出來的過把酶從生物組織或細胞中以溶解狀態(tài)釋放出來的過程，即將盡可能多的酶，盡量少的雜質(zhì)從原料中引入溶液。程，即將盡可能多的酶，盡

3、量少的雜質(zhì)從原料中引入溶液。 l高度純化高度純化（fine fractionation） （精純化）：除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)。（精純化）：除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)。l純化方案評價：純化方案評價：酶活力酶活力、蛋白濃度蛋白濃度、純度純度7 粗純化（粗純化（ 提?。┠繕耍禾崛。┠繕耍?a. 將目的酶最大限度地溶解出來。 b. 保持生物活性。l注意：溫度升高，溶解度加大。但為防止酶失活，一般采用低溫下（010）操作。提取原則提取原則a. 相似相溶。b. 遠離等電點的pH值，溶解度增加。8離心分離離心分離（一）一）基本原理基本原理1. 1. 離心力離心力 Fc = m ac m r r 2 2 m

4、r r （2 N/60）2 2 N為離心機為離心機每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)每分鐘轉(zhuǎn)數(shù) （r/min ）；）； Fc通常以相對離心力通常以相對離心力RCF（relative centrifugal force）表示，即離心力）表示，即離心力F的大小相當于地的大小相當于地球引力（重力常數(shù)球引力（重力常數(shù)g）的多少倍。）的多少倍。一般用一般用g g（或數(shù)字（或數(shù)字 g g）表示。）表示。RCF = RCF = m r r （2 N/60）2 2 /mg= 1.12 = 1.12 1010-5 -5 N2 2 r 此公式描述了相對離心力與轉(zhuǎn)速之間的關(guān)系此公式描述了相對離心力與轉(zhuǎn)速之間的關(guān)系 旋轉(zhuǎn)半徑用旋轉(zhuǎn)半徑用r

5、r平均平均代替代替 r r平均平均=1/2=1/2（r r大大+r+r小小）cmcm 9 通常：通常：低速離心以每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)表示，如：低速離心以每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)表示，如：4000r/min4000r/min。高速離心（超速），常以相對離心力（高速離心（超速），常以相對離心力（RCFRCF）表）表 示，如：示，如：65000g65000g。 兩者可換算或查測算圖。兩者可換算或查測算圖。10名稱名稱 轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速(r/min)(r/min) 注意事項注意事項 低速離心機低速離心機 60006000 常溫，注意樣品熱變性和離心管平衡常溫，注意樣品熱變性和離心管平衡 高速離心機高速離心機 6000 25000

6、冷凍（防止溫度升高），冷凍（防止溫度升高），離心管的精確平衡離心管的精確平衡 超速離心機超速離心機 25000冷凍真空系統(tǒng)（減少空氣阻力和摩擦），冷凍真空系統(tǒng)（減少空氣阻力和摩擦），離心管的精確平衡離心管的精確平衡 離心機的種類離心機的種類 11l角式及水平（外擺）式：水平式一般為低速。角式及水平（外擺）式：水平式一般為低速。 l 角式由低速到超速均有。角式由低速到超速均有。 12l角式離心頭要配套，低溫使用要預冷，操作注意穩(wěn)、蓋、旋緊。角式離心頭要配套，低溫使用要預冷，操作注意穩(wěn)、蓋、旋緊。13l材質(zhì)：玻璃，塑料材質(zhì)：玻璃，塑料l強度：和離心速度相配強度：和離心速度相配l大小：和轉(zhuǎn)子配套大小

7、：和轉(zhuǎn)子配套l高速超速管要加蓋高速超速管要加蓋14l平衡、定溫、定速、定時。平衡、定溫、定速、定時。15實驗一、實驗一、 溶菌酶的粗提取溶菌酶的粗提取略略16u 酶精純化常用技術(shù)l膜分離技術(shù)l柱層析技術(shù)l蛋白質(zhì)結(jié)晶透析超濾凝膠過濾（分子篩/排阻）層析離子交換層析疏水層析吸附層析親和層析反相層析17GelFiltrationIonExchangeHydrophobic InteractionAffinity Reversed Phase18實驗二、溶菌酶的分離純化及酶活力、蛋白濃度測定目的：1. 掌握離子交換層析原理及層析操作所需的必須原件。2. 掌握層析柱填裝方法及層析填料的保存3. 掌握比色

8、法測定溶菌酶的濃度與酶活19l原理：l 根據(jù)溶菌酶 pI 10.8，pH 8.0 PBS 中攜帶？電，與陰/陽離子層析填料可結(jié)合，通過吸附后，提高pH或離子強度將溶菌酶與其他蛋白進行分離達到純化目的。l溶菌酶對革蘭氏陽性菌細胞壁的酶解作用導致細菌完整性破壞，OD600值會下降，通過單位時間內(nèi)（每分鐘）OD600值的下降評價酶活性。l溶菌酶的活力單位（U）：在室溫，pH8.0的條件下，OD600每分鐘降低0.001為1個活力單位。l280nm的消光系數(shù)為13.0，根據(jù) A=ECL 可粗略測定溶菌酶濃度，用于酶比活的評價。20離子交換層析離子交換層析 （ion exchange chromatog

9、raphy，IEC）212.離子交換填料：離子交換填料： 離子交換劑由載體、電荷基團和反離子構(gòu)成。離子交換劑由載體、電荷基團和反離子構(gòu)成。 纖維素纖維素 瓊脂糖瓊脂糖 葡聚糖葡聚糖 載體載體 電荷基團電荷基團 O OCHCH2 2COOCOO- -NaNa+ +反離子反離子1.原理:根據(jù)待分離物質(zhì)帶電性質(zhì)不同的分離 純化方法。22離子交換劑離子交換劑-帶有電荷基團的帶有電荷基團的不溶性不溶性載體載體-O-CH2CH2N-HCH2CH3CH2CH3Cl-載體載體Diethylaminoethyl(DEAE) 陰離子交換劑陰離子交換劑(可吸附可吸附帶負電的蛋白質(zhì)帶負電的蛋白質(zhì)) 陽離子交換劑陽離子

10、交換劑(可吸附可吸附帶正電的蛋白質(zhì)帶正電的蛋白質(zhì))23l陰離子交換劑：陰離子交換劑：l常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羥丙基羥丙基l陽離子交換劑：陽離子交換劑：l常用羧甲基常用羧甲基 CM CH2COO l磺丙基磺丙基 SP C3H6SO3DEAE C2H4N+(C2H5)2HQAE C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH324 化學原料合成化學原料合成 ： sephadex sepharose 載體載體 天然材料制成：天然材料制成： cellulosecellulose 如：如：DEAE-Sepharose， CM-Sepharose25 實驗設(shè)計原

11、實驗設(shè)計原理理 利用不同的蛋白利用不同的蛋白質(zhì)質(zhì)分子在溶液中所分子在溶液中所帶電荷帶電荷不同，因而不同，因而與離子交換劑與離子交換劑有不同吸附力而有不同吸附力而分離。分離。pH8.0pI 8.0 蛋白蛋白質(zhì)帶質(zhì)帶正正電電pI 8.0 蛋白蛋白質(zhì)帶負電質(zhì)帶負電溶菌酶溶菌酶pI:10.8262. 陰離子交換劑分離蛋白質(zhì)陰離子交換劑分離蛋白質(zhì)的的過程過程平衡平衡吸附吸附去吸附去吸附分離結(jié)束分離結(jié)束再生再生+低鹽低鹽高鹽高鹽利用不同利用不同鹽濃度將鹽濃度將不同蛋白不同蛋白質(zhì)質(zhì)洗洗脫下脫下來來Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl

12、-Cl-273. 操作操作 平衡平衡 上樣上樣 沖洗沖洗 洗脫洗脫 再生再生1）上樣：上樣體積不十分嚴格。）上樣：上樣體積不十分嚴格。2）洗脫）洗脫: 增加溶液的離子強度增加溶液的離子強度 梯度洗脫法梯度洗脫法 （連續(xù)、不連續(xù)）（連續(xù)、不連續(xù)）改變?nèi)芤旱母淖內(nèi)芤旱膒H值值 3）再生：）再生：0.5-1mol/L NaCl溶液處理。溶液處理。4.4.應用應用 制備純化生物大分子制備純化生物大分子28梯度洗脫方式29圖圖4-39 梯度溶液的制備方法和洗脫曲線梯度溶液的制備方法和洗脫曲線（a）線性梯度；（）線性梯度；（b）凸形梯度；（）凸形梯度；（c）凹形梯度；（）凹形梯度；（d）編程梯度）編程梯度

13、30 層析柱的制備與層析操作層析柱的制備與層析操作 柱層析的設(shè)備柱層析的設(shè)備: 層析柱、蠕動泵（恒流泵）、檢測儀、部分收集器、梯度洗脫器。層析柱、蠕動泵（恒流泵）、檢測儀、部分收集器、梯度洗脫器。31l層析裝置：層析裝置：l 梯度混和器梯度混和器l 蠕動泵蠕動泵l 層析柱層析柱l 監(jiān)測儀監(jiān)測儀l 記錄儀記錄儀l 收集器收集器 3233現(xiàn)代化層析設(shè)備AKTA層析柱層析柱XKBPG34實驗2.1 層析柱的填裝l1.觀摩l2.實驗步驟l1）測定酶濃度（S-2）lC(mg/ml)=A280/13l2）若填料載量為20mg/ml，計算擬純化100mg 蛋白需要的填料量和量取量。35l3）裝柱要點：la.

14、 用純水將乙醇保存液置換lb. 柱頭及柱底適配器確保無氣泡，可用注射器推注趕氣泡，并確保連接管路密閉無泄漏。lc. 填料傾倒入柱管內(nèi)前先加入少量水覆蓋柱底ld. 柱拆卸后填料務必回收，并保存于20%乙醇中。36二、酶的活力單位及酶活測定：二、酶的活力單位及酶活測定：1. 1. 酶活單位：酶活單位：19611961年國際生化協(xié)會酶學委員會統(tǒng)一規(guī)定，酶的國際單位（年國際生化協(xié)會酶學委員會統(tǒng)一規(guī)定，酶的國際單位（IUIU）規(guī)定為：）規(guī)定為：在最適反應條件（溫度在最適反應條件（溫度2525）下，每分鐘內(nèi)催化）下，每分鐘內(nèi)催化1 1微摩爾（微摩爾（molmol）底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的）底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的

15、酶量（或酶量（或1 1分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化底物生成分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化底物生成1 1微摩爾產(chǎn)物的酶量）稱為微摩爾產(chǎn)物的酶量）稱為1 1標準單位。標準單位。 372.2.酶的比活力：酶的比活力： 每單位酶蛋白所含的活力單位數(shù)。每單位酶蛋白所含的活力單位數(shù)。 對固體酶：用活力單位對固體酶：用活力單位/mg/mg酶蛋白、或活力單位酶蛋白、或活力單位/mg/mg酶蛋白氮來表示；酶蛋白氮來表示； 對液體酶：用活力單位對液體酶：用活力單位/ml/ml酶液來表示。酶液來表示。 很明顯，比活力越大，酶的活力越大。很明顯，比活力越大，酶的活力越大。38分光光度法：產(chǎn)物與適當?shù)幕瘜W試劑生成有色物質(zhì)分光光度法：產(chǎn)物與適當?shù)幕瘜W試劑生成

16、有色物質(zhì) 或產(chǎn)物有紫外吸收的能力可采用此法?；虍a(chǎn)物有紫外吸收的能力可采用此法。測壓法：產(chǎn)物中有氣體，測氣壓增加量。測壓法：產(chǎn)物中有氣體，測氣壓增加量。滴定法：產(chǎn)物中有酸生成，用堿滴定。滴定法：產(chǎn)物中有酸生成，用堿滴定。熒光法：產(chǎn)物中有熒光物質(zhì)生成或產(chǎn)物與熒光試劑熒光法：產(chǎn)物中有熒光物質(zhì)生成或產(chǎn)物與熒光試劑 反應生成熒光產(chǎn)物可用此法。反應生成熒光產(chǎn)物可用此法。旋光法：產(chǎn)物中有旋光物質(zhì)可采用此法。旋光法：產(chǎn)物中有旋光物質(zhì)可采用此法。 除了以上方法外，還可根據(jù)產(chǎn)物的性質(zhì)采用其它方法。除了以上方法外，還可根據(jù)產(chǎn)物的性質(zhì)采用其它方法。 3.具體測定方法具體測定方法394. 回收率和純化倍數(shù)回收率和純化倍

17、數(shù)回收率回收率 100提純后酶總活力提純后酶總活力提純前酶總活力提純前酶總活力純化倍數(shù)純化倍數(shù)每次比活力每次比活力第一次比活力第一次比活力40實驗實驗2.2溶菌酶的活性測定溶菌酶的活性測定實驗材料：實驗材料：1. 枯草芽孢桿菌懸液枯草芽孢桿菌懸液2. S1，S23. PBS等等4. 分光光度計、比色皿、計時器、離心機等分光光度計、比色皿、計時器、離心機等41實驗步驟：實驗步驟：1. 取取6ml 菌懸液，菌懸液，3500rpm*5min，棄上清，沉淀，棄上清，沉淀 6ml PBS重懸。重懸。2. 測定測定OD600并記錄（吸光度并記錄（吸光度0.51.0，若讀數(shù)過高可適當稀釋），若讀數(shù)過高可適當

18、稀釋）3. 測定樣品準備（酶液務必在儀器等條件準備好，臨測定前加入）測定樣品準備（酶液務必在儀器等條件準備好，臨測定前加入）比色皿1234PBS緩沖液/ml5-細胞PBS懸液/ml-54.84.8酶液S1/ml-0.2酶液S2/ml0.242實驗步驟：實驗步驟：4. 酶活性測定，以管（酶活性測定，以管（PBS）為對照，每隔）為對照，每隔30s 測定測定2,3,4管的管的OD600并記錄并記錄5. 酶活力及比活性計算：酶活力及比活性計算：U=(ODn-OD2)/0.001*T(min)*0.2C(mg/ml)=A280/136. 純化回收率及純化倍數(shù)計算純化回收率及純化倍數(shù)計算時間（s）0306

19、0901201501802號 3號 4號 回收率回收率 100US2*V2US1*V1純化倍數(shù)純化倍數(shù)S2比活力比活力S1比活力比活力43樣品體積ml蛋 白 濃 度mg/ml總蛋白 mg活力 u/ml比活力 u/mg總活力 U回 收 率%提純倍數(shù) S1V1 1001S2V2 7. 完成下表完成下表44實驗實驗3溶菌酶的純度鑒定與分子量測定溶菌酶的純度鑒定與分子量測定實驗目的實驗目的:1、通過實驗的學習與操作，在實驗過程更好的理解、通過實驗的學習與操作，在實驗過程更好的理解SDS-聚丙烯酰胺凝膠（聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）測定蛋白）測定蛋白質(zhì)純度與分子量的原理與依據(jù)；質(zhì)純度與分子量的原理與依據(jù)；

20、2、掌握電泳原理以及、掌握電泳原理以及SDS-PAGE垂直板電泳垂直板電泳分析分析蛋白質(zhì)技術(shù)；蛋白質(zhì)技術(shù)；3、熟悉垂直板電泳操作原理和方法，凝膠染色與脫色方法，、熟悉垂直板電泳操作原理和方法，凝膠染色與脫色方法，SDS-PAGE分子量測定分子量測定圖譜的繪圖譜的繪制與計算；制與計算；4、了解在電泳中分子量標準物的使用。、了解在電泳中分子量標準物的使用。45SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-

21、 PAGE）簡稱）簡稱SDS PAGE。 用于蛋白純度及蛋白質(zhì)亞基相對分子量（用于蛋白純度及蛋白質(zhì)亞基相對分子量（relative molecular mass, Mrrelative molecular mass, Mr）測定。）測定。1.1.原理原理461.1.原理原理 SDS是一種陰離子去污劑，帶有大量負電荷，與蛋白質(zhì)結(jié)合后使蛋白質(zhì)所帶負電荷大大超過是一種陰離子去污劑，帶有大量負電荷，與蛋白質(zhì)結(jié)合后使蛋白質(zhì)所帶負電荷大大超過了天然蛋白質(zhì)原有的負電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異。了天然蛋白質(zhì)原有的負電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異。 SDSSDS破壞

22、蛋白質(zhì)氫鍵、疏水鍵，引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，使蛋白質(zhì)破壞蛋白質(zhì)氫鍵、疏水鍵，引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，使蛋白質(zhì)SDSSDS復合物形狀近似橢圓形，復合物形狀近似橢圓形，短軸相同（短軸相同（1.8nm1.8nm），長軸與蛋白質(zhì)分子量成正比。），長軸與蛋白質(zhì)分子量成正比。 因此，蛋白質(zhì)因此，蛋白質(zhì)SDSSDS復合物復合物(SDS-denatured protein)在凝膠中的遷移率不受蛋白質(zhì)原有電荷和在凝膠中的遷移率不受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，只與橢圓棒長度（蛋白質(zhì)分子量）有關(guān)。形狀的影響，只與橢圓棒長度（蛋白質(zhì)分子量）有關(guān)。47 SDS-PAGE separates proteins by MW48 4

23、9502. 分離效應分離效應 連續(xù)電泳（連續(xù)電泳（continuous electrophoresis） 采用相同孔徑的凝膠和相同的緩沖系統(tǒng)采用相同孔徑的凝膠和相同的緩沖系統(tǒng)不連續(xù)電泳（不連續(xù)電泳（discontinuous electrophoresis） 采用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系采用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系 電荷效應電荷效應不連續(xù)不連續(xù)PAGE PAGE 分子篩效應分子篩效應 濃縮效應濃縮效應 連續(xù)連續(xù)PAGEPAGE51 凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。層為大孔徑的濃縮膠

24、，下層為小孔徑的分離膠。l濃縮效應：使樣品在濃縮膠中被濃縮成一條窄帶，然后再濃縮效應：使樣品在濃縮膠中被濃縮成一條窄帶，然后再進入分離膠進行分離。進入分離膠進行分離。l電荷效應電荷效應 : 分離膠中，蛋白質(zhì)表面凈電荷不同，遷移率不分離膠中，蛋白質(zhì)表面凈電荷不同，遷移率不同。同。l分子篩效應分子篩效應 ：大小和形狀不同的樣品分子通過一定孔徑大小和形狀不同的樣品分子通過一定孔徑的分離膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率。的分離膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率。 522. 實驗步驟：（實驗步驟：（SDS-PAGE）1）母液配制）母液配制2）制膠準備）制膠準備: 玻璃板清洗、干燥玻璃板

25、清洗、干燥 制膠架的準備：嚴格按說明書組裝制膠架制膠架的準備：嚴格按說明書組裝制膠架。532. 實驗步驟：（實驗步驟：（SDS-PAGE）3）制膠）制膠: 分離膠、濃縮膠：根據(jù)待分離樣品的分子大小選擇分離膠、濃縮膠：根據(jù)待分離樣品的分子大小選擇15%的分離膠，如表配制的分離膠，如表配制54濃縮膠（10 ml）雙蒸水0.5 mol/L pH 6.8Tris-HCl30%膠貯液10% SDSTEMED10% AP5%3.4ml0.63 ml0.83ml50 l5 l50 l分離膠（20 ml）雙蒸水1.5 mol/L pH 8.8Tris-HCl膠貯液10% SDSTEMED10% AP12%3.

26、3ml2.8ml2.5 ml2.0ml4 ml5 ml100 l4 l100 l553、按比例配好分離膠，用移液管快速加入，大約、按比例配好分離膠，用移液管快速加入，大約5 cm左右，之后加少許蒸餾水，靜置左右，之后加少許蒸餾水，靜置30分鐘分鐘。凝膠配制過程要迅速，催化劑。凝膠配制過程要迅速，催化劑TEMED要在注膠前再加入，否則凝結(jié)無法注膠。注膠過程最好要在注膠前再加入，否則凝結(jié)無法注膠。注膠過程最好一次性完成，避免產(chǎn)生氣泡。水封的目的是為了使分離膠上延平直，并排除氣泡。凝膠聚合好的一次性完成，避免產(chǎn)生氣泡。水封的目的是為了使分離膠上延平直，并排除氣泡。凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清

27、晰的界面。標志是膠與水層之間形成清晰的界面。4、倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干，按比例配好濃縮膠，連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣、倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干，按比例配好濃縮膠，連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5 mm處，迅速插入樣梳，靜置處，迅速插入樣梳，靜置10分鐘。樣梳需一次平穩(wěn)插入，梳口處不得有氣泡，梳底需水平。分鐘。樣梳需一次平穩(wěn)插入，梳口處不得有氣泡，梳底需水平。5、電泳液緩沖（、電泳液緩沖（*10）配制：）配制：30g Tris, 150g Gly, 10g SDS+800ml dH2O, 定容至定容至1000ml565、樣品處理：取、樣品處理：取30ul樣品（樣品（S1，S2），加入），加入30ul 上樣緩沖液，上樣緩沖液，100水浴水浴30min，拔出樣梳后，在上槽內(nèi)加入緩沖液，使鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部排出，否則會影響加樣效果。拔出樣梳后，在上槽內(nèi)加入緩沖液，使鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部排出，否則會影響加樣效果。6、加樣、加樣3個，空出第一個孔，從第二個開始按已編排好的順序依次加入相應體積的樣品和蛋白個，空出第一個孔，從第二個開始按已編排好的順序依次加入相應體積的樣品和蛋白Marker。其中蛋清（。其中蛋清（S1）和）和Marker加樣量為加樣量為2 l，S1、S2、S3、和、和S4加