天水師院論文

1、多糖測定的研究進展李宗萍（天水師范學院 生命科學與化學學院 甘肅 天水 741001）摘 要：多糖是除了蛋白質(zhì)和核酸以外在生命有機體中不可缺少的成分，它已在各個領(lǐng)域得到應用。隨著多糖的作用越來越突出，人們對其重視程度也日漸加深，研究多糖性質(zhì)的測定方法也愈顯重要。本文主要從多糖的來源，提取，分離純化，含量、結(jié)構(gòu)及相對分子質(zhì)量的測定方面進行綜述。本文期望為多糖的高效利用提供一些依據(jù)。關(guān)鍵詞：多糖；相對分子質(zhì)量；結(jié)構(gòu)；含量The Research Progress of Polysaccharides DeterminationLi Zongping(School of Life Science a

2、nd Chemistry of TianShui Normal University, Gansu, TianShui, 741001)Abstract: The polysaccharides is an indispensable ingredient in addition to proteins and nucleic acids in living organisms, and it has been applied in various fields. With the increasingly prominent role of the polysaccharide, its e

3、mphasis is also deepening the study of the nature of the polysaccharide measurement method is also more and more important. The source of the polysaccharide, extraction, purification and determination of relative molecular mass, structure and content were summarized in this paper. Some useful inform

4、ation for the efficient use of the Polysaccharides was provided in this paper. Keywords: Polysaccharides The relative molecular mass Structure Content引言多糖（Polysaccharides）是一類天然產(chǎn)物，廣泛存在于動物、植物和微生物等有機體中，是一切有機體不可缺少的成分，與維持有機體的各種生理機能有著密切的聯(lián)系1。目前具有降血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、抗凝血、抗?jié)兊茸饔?。多糖又稱多聚糖，是由醛糖或酮糖通過脫水形成糖苷鍵，并

5、以糖苷鍵線性或分枝連接而成的鏈狀聚合物，對其測定的研究在生命體的研究起著重大的作用1-2。1. 多糖的來源多糖種類繁多，來源廣泛。主要包括動物多糖、植物多糖、微生物多糖。動物多糖來自動物結(jié)締組織基質(zhì)和細胞間質(zhì)。植物多糖來源于植物的根、莖、葉、皮、種子和花。微生物多糖主要來源于真菌的菌絲體細胞壁和細胞質(zhì)中、子實體及其發(fā)酵液中3。2. 多糖的提取、分離、純化和降解2.1 多糖的提取 大多數(shù)多糖是以氫鍵、鹽鍵等與其它物質(zhì)聚合在一起，所以必須以各種有效方法破壞多糖鏈與其它物質(zhì)的共價結(jié)合，才能達到提取多糖的目的4。多糖的提取方法很多，植物多糖多采用水提法、有機溶劑提取法、超聲波技術(shù)及微波輔助技術(shù)。對于動

6、物多糖，一般采用丙酮、乙醚、乙醇進行預處理，進行脫脂5-6。2.1.1 水提法多糖屬極性較強物質(zhì)，溶于熱水。故常用水提法，水提法多應用于中性多糖，提取糖醛酸類的酸性多糖可以用弱堿性水溶液。另外，在酸性條件下，多糖中糖苷鍵可能斷裂，提取時應盡量避免7。2.1.2 有機溶劑提取法該方法的原理是利用多糖溶液與有機溶劑互不相容，且多糖在有機溶劑的溶解度大于多糖在原溶劑的溶解度，經(jīng)過多次萃取將多糖從原溶劑中轉(zhuǎn)移至有機溶劑中，然后通過蒸發(fā)等手段出去有機溶劑，得到多糖。2.1.3 超聲波技術(shù)及微波輔助技術(shù)超聲波技術(shù)及微波輔助技術(shù)是近年研究比較多的一種高效率的方法，超聲波提取植物多糖是利用超聲波產(chǎn)生的機械振動

7、、乳化、擊碎、化學效應等的空化作用加速植物有效成分的溶出，利于提取8。微波提取則是利用微波場中介質(zhì)的偶極子轉(zhuǎn)向極化和界面極化的時間與微波頻率相吻合的特點，促使介質(zhì)轉(zhuǎn)動能級躍遷, 加劇熱運動，將電能轉(zhuǎn)化為熱能，從而使細胞壁破碎或溶解，達到增強提取效率的目的9。如超聲波催化纖維素酶法提取靈芝多糖8-9。目前的困難是此法的工業(yè)生產(chǎn)設(shè)備尚未普及。2.2 多糖的分離多糖分離過程一般包括蛋白質(zhì)、色素及低聚糖等小分子雜質(zhì)的去除。根據(jù)多糖的不同性質(zhì)，其分離方法也不同。多糖的溶解度與多糖的分子量有關(guān)，分子量小的，溶解多一般較大，分支越多的直鏈多糖的水溶性越好，多糖具有較強極性，在其水溶液中加入乙醇、丙酮或甲醇等

8、沉淀劑，即可產(chǎn)生沉淀。故可以根據(jù)溶解度的不同可以分為：乙醇沉淀法和含鹽溶液沉淀法。多糖分子中含有如羥基及硫酸基等不同的電離基團，因此可以根據(jù)電離性質(zhì)的不同可以分為：季銨鹽絡(luò)合法和電泳分離法10-11。此外，還有離子交換、層析法凝膠色譜、分子篩色譜、高效液相色譜（HPLC）法、膜分離法等。尤其是膜分離法不需加熱和化學物質(zhì)處理，不僅節(jié)約能源、無環(huán)境污染，且保留生物活性成分的高效價，因而得到廣泛的應用。2.3 多糖的純化純化是將多糖混合物分離為單一多糖的過程,是多糖分離進一步的處理工作。其純化方法主要有化學法和物理法12?；瘜W法主要是依靠加入化學物質(zhì)使非多糖類物質(zhì)發(fā)生沉淀，從而純化多糖。其方法主要有

9、：分部沉淀法、鹽析法、金屬絡(luò)合物法和季銨鹽沉淀法等。物理法主要是根據(jù)填料對不同種類糖的吸附作用的差異性，而使各糖分達到彼此分離的方法。常見色譜法包括凝膠柱色譜法和離子柱交換色譜法13。另外，紙層析法和冷凍法也是純化多糖的有效手段。2.4 多糖的降解對多糖組成進行定性和定量分析時，先用酸催化水解多糖，使其還原為單糖或寡糖，再進行分析?；瘜W降解常用的方法有：NaNO2降解、酸降解以及氧化降解。其中，酸降解最為常見，最常用的酸是鹽酸、硫酸和三氟乙酸。例如利用色譜方法進行檢測時，由于酸和鹽往往干擾色譜分離，所以常需用中和、沉淀及透析等形式消除干擾。此外，甲醇分解、甲醛分解作用、乙酰分解作用和酶水解等方

10、法也可用于多糖降解14-15。3. 多糖含量的測定多糖含量是利用糖的還原性進行測定。常用的方法有化學法和色譜法?；瘜W法主要包括苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法，DNS法，咔唑-硫酸法，滴定法等，色譜法主要包括薄層色譜（TLC）法，液相色譜（HPLC）法，氣相色譜（GC）法，紅外光譜（IR）法等。3.1 化學分析法3.1.1苯酚-硫酸法苯酚-硫酸試劑可以同多糖中的己糖和糖醛酸、游離的寡糖起顯色反應。糖在濃硫酸作用下，先水解成單糖, 再脫水生成具有呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物。五碳糖和六碳糖一般生成糠醛和5-羥甲糠醛?？啡┧嵩诖藯l件下往往脫羧，并生成糠醛。糠醛及其衍生物和苯酚縮合成有色物質(zhì)，在480nm處有最大吸

11、收，吸收值與糖的含量呈線性關(guān)系，根據(jù)其在曲線上的位置推算出多糖的濃度從而推算其含量16-17。此法操作簡單、快速、靈敏、重復性好, 對每種糖僅需制作一條標準曲線即可，但對有色樣品結(jié)果易偏高4。3.1.2 蒽酮-硫酸法此法的原理是利用糖類與濃硫酸在沸水浴中脫水后，生成糖醛或其衍生物, 再與蒽酮試劑縮合，反應后形成藍綠色溶液，于620nm處有最大吸收，吸收值與糖的含量呈線性關(guān)系。再根據(jù)其在曲線上的位置推算出多糖的濃度從而推算其含量18-19，但是蒽酮-硫酸法穩(wěn)定性較差。3.1.3 咔唑-硫酸法該法主要用于糖醛酸的測定，其原理在于多糖經(jīng)水解氧化生成糖醛酸，糖醛酸在硫酸存在下會與咔唑發(fā)生縮合反應，生成

12、含羰基的紫紅色產(chǎn)物。該產(chǎn)物在530 nm下有最大吸收，各中性單糖在0.040.32mg/mL，糖醛酸在0.010.08mg/mL范圍內(nèi)，其濃度與咔唑法檢測吸收值呈線性，吸收值與糖含量呈線性關(guān)系20。3.1.4 DNS法（3, 5-二硝基水楊酸比色法）在堿性條件下，利用3, 5-二硝基水楊酸與多糖水解產(chǎn)物還原糖共熱后，被還原成氨基化合物，呈橘紅色，于540nm處有特征吸收21。在一定范圍內(nèi)還原糖的量與反應液的顏色強度呈比例關(guān)系，通過比色測定糖含量。該法可測定還原糖和總糖含量，并通過多糖+還原糖=總糖，可獲得多糖含量22。3.1.5 滴定法滴定法測定的原理是取多糖水解液，加入指示劑，用標準溶液滴定

13、，根據(jù)樣品水解液所消耗體積及化學反應計量關(guān)系計算其含量23。該法主要包括氧化還原滴定法、間接碘量滴定法、斐林氏滴定法等。3.2 色譜法3.2.1氣相色譜（GC）法通過氣相色譜法可以定性、定量對多糖的組分和含量分析，一般是將多糖酸水解或甲醇醇解，用衍生物法以增加其揮發(fā)性。在GC分析中，糖有兩類衍生物，一類是三甲基硅醚衍生物，是通過糖在二甲基亞砜或吡啶等非水溶劑中與三甲基氯硅烷，六甲基二硅烷，雙三甲基硅烷基乙酰胺等反應形成，此類衍生物均具有較強的揮發(fā)性。另一類糖衍生物是醋酸衍生物，包括醋酸乙醛肟衍生物，三氟醋酸鹽多羥基醇衍生物，三氟醋酸多羥基醇衍生物等24。填充柱和毛細管色譜柱是氣相色譜分析法中常

14、用的色譜柱。在糖分析中主要采用OV-1701、OV-17、OV- 225、SE-30、SE-33、SE-52、DB-1701、DB-1、HP-1701和AT-1701等25。被分離產(chǎn)物的檢測常采用選擇性好、靈敏度高的檢測器，最常用的氫火焰離子化檢測器（FID），具有最高的選擇性和靈敏度。此外也用到火焰光度檢測器（FPD）、質(zhì)譜檢測器（MS）、電子捕獲檢測器（ECD）等23。3.2.2 液相色譜（HPLC）法 糖的高效液相色譜分析方法已成為常規(guī)分析方法?？蓪翁呛凸烟沁M行常量和微量分析。對于一般的單糖、寡糖的分析，色譜柱一般用氨基鍵合固定相。常用的氨基鍵合色譜柱有碳水化合物柱、Amino-sil

15、-X-1、Amide-80、Hypersil NH2、Lichroeorb-NH2、Polygosil 60-5NH2、YMG-NH2和ZORBAX氨基柱等。通常用乙腈和水作為流動相，隨著水的比例的減少，糖的保留時間亦減少26。此外，C8和C18硅烷色譜柱和陽離子交換柱（通常以聚苯乙烯型陽交換色譜樹脂制作）也用于糖的分析，一般以水作流動相，在較高溫度（7585）下，分離效果較好25。HPLC常用的檢測器有紫外檢測器（UV）、熒光檢測器（FLD）、電化學檢測器（ED）、蒸發(fā)光檢測器（ELSD）等。3.2.3 薄層色譜（TLC）法薄層色譜，亦稱薄層層析，屬于固液吸附色譜。樣品在薄層板上的吸附劑和溶

16、劑之間進行分離。由于各種化合物的吸附能力各不相同，在展開劑上移時，它們進行不同程度的解吸，從而達到分離的目的。再利用雙波長薄層掃描技術(shù)測定多糖中單糖組成，建立單糖濃度和斑點面積的定量關(guān)系，以此對樣品中各單糖作定量分析。薄層層析有分離效果好、操作簡便、分離速度快(13h)、樣品需要量較少(500ng1g)，檢測限可達到µg級等優(yōu)點。另外，利用高效薄層色譜(HPTLC)，進行薄層掃描，檢測限可達到ng級27。3.2.4 紅外光譜（IR）法紅外光譜定量分析多糖是通過對特征吸收譜帶強度的測量，用標準曲線法、求解聯(lián)立方程法等方法來求出各組份含量。其理論依據(jù)是朗伯-比耳定律：A=abc，式A為吸

17、光度，它沒有單位；a稱作吸收系數(shù)。當濃度c選用mol·L-1為單位，槽厚b以厘米為單位時，則a值的單位為：L·cn-1·mol-1，稱為摩爾吸收系數(shù)，并常用表示。利用傅里葉變換紅外光譜估測多糖含量時18，一般認為糖量的特征波在970cm和1182cm之間。Blakeney等4用近紅外反射光譜測定了谷物中非淀粉多糖，這種方法既快速又便宜，在快速分析具有營養(yǎng)功能的重要多糖方面具有很大的潛力。此外，隨著檢測儀器不斷革新升級，多糖含量的檢測還有一些其他方法。其發(fā)展趨勢使檢測過程更簡便、準確、快速、實現(xiàn)痕量檢測等。4. 多糖結(jié)構(gòu)的測定多糖的結(jié)構(gòu)復雜，分初級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)，一

18、級結(jié)構(gòu)為初級結(jié)構(gòu)，二、三、四級結(jié)構(gòu)為高級結(jié)構(gòu)?？茖W家們多年來通過從物理、化學和生物等手段對其結(jié)構(gòu)進行研究，已取得很大進展，而新技術(shù)的發(fā)展使得分析手段更快速更高效。本文主要從化學分析方法和物理分析方法進行闡述。4.1 化學分析方法4.1.1 酸水解法酸水解是鑒定多糖的單糖組成常用的方法。它又分完全酸水解與部分酸水解，現(xiàn)在酸水解法已實現(xiàn)完全自動化，通常多糖的酸水解條件是用13mol/L硫酸或2mol/L三氟乙酸，80100密閉加熱68h，若多糖中含又糖醛酸，則需要更加強烈的水解條件。當水解完成后，用氫氧化鋇或硫酸鋇等堿液中和，進而用色譜分析28。4.1.2 高碘酸氧化法多糖具有鄰二醇、鄰三醇結(jié)構(gòu)而

19、易被高碘酸鹽氧化開環(huán)。高碘酸可以選擇性地斷裂多糖分子中連二羥基或連三羥基，使其生成相應的多糖醛、甲酸或甲醛。反應定量進行，每斷裂一個C-C鍵消耗一分子高碘酸29。其原理主要是通過高碘酸氧化多糖的作用，測定高碘酸的消耗量、甲酸的生成量和剩余糖含量的比，從而確定多糖中糖苷鍵的鍵型、比例、糖苷鍵的位置以及支鏈多糖的分支數(shù)目。4.1.3 Smith降解法其原理主要是通過用稀酸在室溫下將高碘酸氧化產(chǎn)物還原后的多元醇進行部分酸水解，由于糖基之間以不同的位置縮合，用高碘酸氧化后則生成不同的產(chǎn)物。將氧化產(chǎn)物用硼氫化合物還原成穩(wěn)定的赤蘚醇糖苷或丙三醇糖苷等多羥基化合物，經(jīng)酸水解后用紙色譜或氣相色譜鑒定水解產(chǎn)物，

20、這些單糖苷、二糖苷和寡糖苷的結(jié)構(gòu)有助于推斷多糖中單糖的部分連接順序和鍵型30。4.1.4 甲基化反應法甲基化反應是通過確定糖苷鍵的位置和各單糖的組成、比例，闡明單糖的連接方式、重復結(jié)構(gòu)中某種單糖的數(shù)目、末端糖的性質(zhì)及分支點的位置等。首先將多糖中的各種單糖殘基中的游離羥基全部甲基化，其次將多糖中的糖苷鍵水解，水解后得到的化合物的羥基所在位置即為原來單糖殘基的連接點。最后根據(jù)不同甲基化單糖的比例推測出這種連接鍵型在多糖重復結(jié)構(gòu)中的比例31。4.2 物理分析法4.2.1 紅外光譜( IR) 法紅外光譜法在多糖結(jié)構(gòu)分析上主要是確定吡喃糖的苷鍵構(gòu)型及常規(guī)觀察其他官能團32。一般主要觀察730960 cm

21、-1范圍，如對于-吡喃糖，C1-H為845cm- 1，而-吡喃糖C1-H為890cm-1。4.2.2 氣相色譜（GC）法氣相色譜法用于糖類的定性分析及定量測定。糖可通過酸水解或甲醇解成單糖或單糖苷，然后采用三氟乙?；?、三甲基硅烷化、糖醇乙酰化等方法衍生化，即可進樣分析。GC分析多糖雖受到樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，但GC-MS可使多糖結(jié)構(gòu)分析的靈敏度提高。另外常將GC與HPLC結(jié)合來分析多糖水解后單糖的組成及比例33。4.2.3 質(zhì)譜（MS）法 質(zhì)譜法用于鑒定各種甲基衍生物的碎片及各種單糖殘基的連接位置。已成為解決與碳水化合物有關(guān)的結(jié)構(gòu)問題的有力工具34。早期的質(zhì)譜主要局限于電子解離法（EIM

22、S），不適用于糖類這種極性強。而近年來，發(fā)展快速的軟電離技術(shù)質(zhì)譜由于其靈敏度高和結(jié)構(gòu)信息直觀，而受到人們更廣泛的青睞。如電噴霧電離、化學電離、場致電離和場解吸電離、基質(zhì)輔助的激光解吸電離。此外，對于極性高、難揮發(fā)且熱穩(wěn)定性不高的多糖，可用快原子轟擊質(zhì)譜。4.2.4 核磁共振光譜（NMR）法 NMR主要解決多糖結(jié)構(gòu)中糖苷鍵構(gòu)型問題。糖鏈的結(jié)構(gòu)特征通過化學位移、積分面積、偶合常數(shù)及弛豫時間等參數(shù)來表達。常用的有1H-NMR和13C-NMR，它們常用于測定呈現(xiàn)在重復單元中不同糖數(shù)目的差向構(gòu)型。13CNMR的化學位移較1HNMR大，分辨率高，不但能確定各種碳的位置，而且還能區(qū)別分子的構(gòu)型和構(gòu)象35。N

23、MR技術(shù)研究的優(yōu)點是保證樣品的完整性。4.2.5 X射線衍射其原理是利用X-射線纖維衍射和計算機模擬結(jié)合，再聯(lián)合立體化學的知識來確定多糖的構(gòu)型。由于絕大多數(shù)的多糖都不能形成單晶，故不適用于常規(guī)的X-射線單晶衍射，X-射線纖維衍射在多糖的結(jié)構(gòu)測定方面起了重大作用，X-射線纖維衍射與計算機模擬技術(shù)相結(jié)合是當前確定多糖立體構(gòu)型最為有力的工具36。5. 多糖相對分子質(zhì)量的測定多糖的性質(zhì)往往與相對分子量大小有關(guān)。如多糖溶液的粘度，不僅隨溶液濃度的增大而增大，并且與相對分子量大小也有關(guān)，而且在生物學上由于多糖分子量的不同，所產(chǎn)生的某些效應也有一定的差異。目前測定多糖相對分子量的方法主要有凝膠色譜法、端基法

24、、粘度法、滲透壓法和超濾法等。 5.1 凝膠色譜法該方法的原理是用苯酚-硫酸法監(jiān)測，用已知分子質(zhì)量的葡聚糖標準品進行凝膠層析，洗脫，收集。在測定中洗脫體積為Ve，當分子量足夠大，過凝膠柱時不進入凝膠的洗脫體積為死體積V0，分別求得相對應的洗脫體積Ve，通過標準曲線上的Ve/ Vo，查得待測多糖的相對分子質(zhì)量對數(shù)，便可求出相對分子質(zhì)量37。5.2 端基法基本原理是測定單位重量樣品中所含可測端基之數(shù)，計算檢樣的分子量。常用的測定多糖還原端基的定量分析方法有：3, 5 二硝基水楊酸比色法、堿性銅鹽試劑反應滴定法和多糖轉(zhuǎn)化為氰醇測定法等38。例如，對某一種多糖的分子結(jié)構(gòu)，如果已經(jīng)知道其每一個分子鏈含有

25、一個可測端基和每毫克中所含的可測端基為Ymmol，則它的分子量為1/Y。即檢樣的分子量是每毫克檢樣重量中所含可測端基的毫摩爾數(shù)的倒數(shù)，在端基法測定分子量時，分子量計算的通式是：檢樣的分子量=檢樣重量mg/可測端基（mmol）。5.3 粘度法 粘度法測定分子量先是測定樣品特性粘度G，然后通過換算方程，即經(jīng)驗式G=KM計算分子量39。該方法所需設(shè)備簡單，操作方便，有相當好的實驗精度，因此常用于多糖分子量測定。但是此法中所用的特性粘度與分子量的經(jīng)驗方程要根據(jù)多糖的性質(zhì)（分子量范圍、溶劑種類等）來確定。5.4 滲透壓法 滲透壓法是利用膜滲透壓計測定范圍在在1萬50萬之間的多糖分子量。其原理是半透膜只允

26、許小分子物質(zhì)（如水）通過，而多糖分子不能通過半透膜，將多糖溶液裝入用半透膜制成的透析袋中，由于袋內(nèi)的多糖溶液濃度高，袋外的水分子會滲入袋內(nèi)，從而形成一定的滲透壓。滲透壓與溶液中的溶質(zhì)分子數(shù)有關(guān)，用范特荷甫公式表示，即V=nRT，式中：滲透壓；V：溶液體積；n：溶液摩爾數(shù)；R：氣體常數(shù)；T：絕對溫度。采用滲透壓法測定分子量時，要求樣品內(nèi)不含分子量小至能 透過半透膜的物質(zhì)40。如靈芝菌絲體多糖的分子量測定。5.5 超濾法 超過濾，又名分子過濾，是在常規(guī)微粒過濾基礎(chǔ)上發(fā)展起來的細微粒子過濾新技術(shù)，應用適宜的分子量截留值的超過濾膜，以各種已知分子量不同的多糖作標準進行超濾測百分濾過量，然后以百分濾過量

27、對分子量作圖得出標準曲線， 在相同超過濾膜和相同測定條件下測定樣品的百分濾過量，從標準曲線上即可求出近似的分子量41。6. 研究展望多糖不僅是生物體必不可少的成分，而且廣泛參與細胞的各種生命活動而產(chǎn)生多種生物學功能，雖然較蛋白質(zhì)、核酸研究的晚，但由于它在生命過程中不可忽視的作用使得它越來越受到關(guān)注。但是由于多糖的復雜性以及研究手段的局限性，使得多糖的研究還不是很成熟，尤其是多糖在人體內(nèi)的機理問題，目前應用于臨床的多糖已在抗突變、抗凝血、降血壓、降血脂等方面展現(xiàn)出了誘人的前景。它作為藥物具有其它藥物難以相比的優(yōu)勢毒副作用小，具有多方面的功能，而且現(xiàn)在多糖已在食品、化妝品、醫(yī)藥、保健品和環(huán)境治理等

28、研發(fā)中成為重要組成部分。因此，建議充分利用對多糖的測定研究，使其在各個領(lǐng)域得到更加廣泛的應用。參考文獻1 姚新生. 天然藥物化學M. 第三版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2002. 53106.2 王鏡巖, 朱圣庚, 徐長法. 生物化學(上冊) M. 3版. 北京: 高等教育出版社, 2002.3 方積年, 丁侃. 天然藥物多糖的主要生物活性及分離純化J. 中國天然藥物, 2007, 5 (5): 339347.4 張惟杰. 糖復合物生化研究技術(shù)M. 杭州: 浙江大學出版社, 1999. 128.5 崔亦華, 崔英德, 易國斌. 應用廣泛的天然多糖及其提取方法J. 廣州化工, 2002, 30

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