細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇

1、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)第三章第三章 細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)活細(xì)胞：長時(shí)間、直接觀察、研究活細(xì)胞的形活細(xì)胞：長時(shí)間、直接觀察、研究活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)態(tài)、結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)可控制：可控制：選擇特定的細(xì)胞種類、性質(zhì)、階段選擇特定的細(xì)胞種類、性質(zhì)、階段可控制調(diào)節(jié)條件：物理、化學(xué)、生物等可控制調(diào)節(jié)條件：物理、化學(xué)、生物等可采用各種研究技術(shù)、記錄方法可采用各種研究技術(shù)、記錄方法樣品均一性：來源于同一組織同一種細(xì)胞樣品均一性：來源于同一組織同一種細(xì)胞經(jīng)濟(jì)、規(guī)模經(jīng)濟(jì)、規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇局限性局限性人工模擬的條件和體內(nèi)實(shí)

2、際情況仍不完全相同人工模擬的條件和體內(nèi)實(shí)際情況仍不完全相同缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞相互間的影響細(xì)胞相互間的影響體外培養(yǎng)的細(xì)胞生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡的環(huán)境環(huán)體外培養(yǎng)的細(xì)胞生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡的環(huán)境環(huán)境中，必然發(fā)生變化。境中，必然發(fā)生變化。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇本章主要內(nèi)容本章主要內(nèi)容細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作技術(shù)原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)(primary culture)(primary culture)傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)(subculture)(subculture)體外培養(yǎng)細(xì)胞的體外培養(yǎng)細(xì)胞的影響因素影響因素細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)污染及對(duì)策污染及

3、對(duì)策培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞的生長測(cè)定生長測(cè)定方法方法細(xì)胞細(xì)胞凍存和復(fù)蘇凍存和復(fù)蘇細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇細(xì)胞培養(yǎng)中的常用術(shù)語細(xì)胞培養(yǎng)中的常用術(shù)語組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)(Tissue Culture)(Tissue Culture)： 指的是從體內(nèi)取指的是從體內(nèi)取出組織，模擬體內(nèi)生理環(huán)境，使之生存和生長并出組織，模擬體內(nèi)生理環(huán)境，使之生存和生長并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。器官培養(yǎng)（器官培養(yǎng)（Organ CultureOrgan Culture）： 培養(yǎng)的是器官的培養(yǎng)的是器官的原基、器官的一部分或整個(gè)器官，使之在體外生原基、器官的一部分或整個(gè)器官，使之在體外生存、生長和保持一定功能的方法。存

4、、生長和保持一定功能的方法。細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)(Cell Culture)(Cell Culture)： 培養(yǎng)物是單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物是單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞群。和細(xì)胞群。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇細(xì)胞培養(yǎng)中的常用術(shù)語細(xì)胞培養(yǎng)中的常用術(shù)語原代培養(yǎng)（原代培養(yǎng)（primary cultureprimary culture）：從體內(nèi)取出細(xì)：從體內(nèi)取出細(xì)胞或組織的第一次培養(yǎng)。胞或組織的第一次培養(yǎng)。傳代（傳代（passagepassage）也稱再培養(yǎng)。無論是否稀釋，也稱再培養(yǎng)。無論是否稀釋，將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個(gè)培養(yǎng)瓶將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個(gè)培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)。也稱再培養(yǎng)。即稱為傳代或傳代培養(yǎng)

5、。也稱再培養(yǎng)。細(xì)胞系（細(xì)胞系（cell linecell line）：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即為細(xì)胞系成功后即為細(xì)胞系細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇細(xì)胞培養(yǎng)中的常用術(shù)語細(xì)胞培養(yǎng)中的常用術(shù)語細(xì)胞株（細(xì)胞株（cell straincell strain）：通過選擇法或克隆形成法：通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志的培養(yǎng)物稱細(xì)胞株。志的培養(yǎng)物稱細(xì)胞株。匯合（匯合（confluentconfluent）：細(xì)胞相互連接成片占據(jù)所有底：細(xì)胞相互連接成片占據(jù)所有底物面積。物面積。接觸抑制（接觸抑制（contact i

6、nhibitioncontact inhibition）：細(xì)胞匯合相互）：細(xì)胞匯合相互接觸后失去運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象接觸后失去運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇一、細(xì)胞培養(yǎng)基本操作技術(shù)一、細(xì)胞培養(yǎng)基本操作技術(shù) 由于體外培養(yǎng)的由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞沒有抗感染能力，細(xì)胞沒有抗感染能力，因此因此防污染防污染是決定培是決定培養(yǎng)成功的首要條件。養(yǎng)成功的首要條件。一切操作需要保證一切操作需要保證無菌無菌和有條不紊。和有條不紊。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇培養(yǎng)前準(zhǔn)備培養(yǎng)前準(zhǔn)備制定好制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序?qū)嶒?yàn)計(jì)劃和操作程序有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。準(zhǔn)備各種所需器材和物品，清點(diǎn)無誤后將其放置準(zhǔn)備各種所需器材和物品

7、，清點(diǎn)無誤后將其放置在操作場(chǎng)所在操作場(chǎng)所( (培養(yǎng)室、超凈臺(tái)培養(yǎng)室、超凈臺(tái)) )內(nèi)，然后開始消毒。內(nèi)，然后開始消毒。避免開始實(shí)驗(yàn)后，因物品不全往返拿取而增加污避免開始實(shí)驗(yàn)后，因物品不全往返拿取而增加污染機(jī)會(huì)。染機(jī)會(huì)。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇消毒消毒地面地面每天都要用每天都要用0.2%0.2%的新潔爾滅拖洗地面的新潔爾滅拖洗地面次次( (拖布拖布要專用要專用) )，紫外線照射消毒，紫外線照射消毒30-50min30-50min超凈工作臺(tái)臺(tái)面超凈工作臺(tái)臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用每次實(shí)驗(yàn)前要用7575酒精擦洗。然酒精擦洗。然后紫外線消毒后紫外線消毒30min30min。消毒時(shí)工作臺(tái)面上用品消毒時(shí)工作臺(tái)面上用品布局

8、合理布局合理，不要，不要過多過多或重疊或重疊放置，否則會(huì)遮擋射線降低消毒效果。放置，否則會(huì)遮擋射線降低消毒效果。一些一些操作用具操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用等用75%75%酒精擦洗后置于臺(tái)內(nèi)同時(shí)紫外線消毒。酒精擦洗后置于臺(tái)內(nèi)同時(shí)紫外線消毒。 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇洗手和著裝洗手和著裝原則上和外科手術(shù)相同原則上和外科手術(shù)相同。僅做觀察不做培養(yǎng)操作時(shí)，可穿著細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)紫外僅做觀察不做培養(yǎng)操作時(shí)，可穿著細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)紫外線照射線照射30min30min的清潔工作服的清潔工作服在利用超凈臺(tái)工作時(shí)，因整個(gè)前臂要伸入箱內(nèi)，應(yīng)著在利用超凈臺(tái)工作時(shí)，因整個(gè)前臂要伸入

9、箱內(nèi)，應(yīng)著長袖的清潔工作服，并于開始操作前要用長袖的清潔工作服，并于開始操作前要用7575酒精消酒精消毒手毒手。進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。 專用鞋或?qū)Ｓ眯驇讕准?xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇火焰消毒火焰消毒在無菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無菌工作時(shí)，首先在無菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無菌工作時(shí)，首先要要點(diǎn)燃酒精燈點(diǎn)燃酒精燈。按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。如實(shí)驗(yàn)用品需火焰滅菌，如實(shí)驗(yàn)用品需火焰滅菌，冷卻冷卻后接觸培養(yǎng)細(xì)胞，后接觸培養(yǎng)細(xì)胞，以防燒死細(xì)胞。

10、以防燒死細(xì)胞。 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇操作操作進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷準(zhǔn)確敏捷不能不能太快，太快，否則否則空氣流動(dòng)增加污染機(jī)會(huì)。空氣流動(dòng)增加污染機(jī)會(huì)。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。用火焰燒灼消毒或取備品更換。 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇組織細(xì)胞取材及培養(yǎng)的基本要求組織細(xì)胞取材及培養(yǎng)的基本要求l取材的組織用培養(yǎng)液浸泡，取材的組織用培養(yǎng)液浸泡，44運(yùn)送，運(yùn)送，24h24h內(nèi)盡快培養(yǎng)。內(nèi)盡快培養(yǎng)。l取材時(shí)應(yīng)嚴(yán)格取材時(shí)應(yīng)嚴(yán)格無菌無菌操作，避免對(duì)組織的機(jī)械損傷，盡量操作，避免對(duì)組織的機(jī)械損傷，盡量去除脂肪、神經(jīng)、結(jié)締、壞死組織

11、，污染組織可用青鏈去除脂肪、神經(jīng)、結(jié)締、壞死組織，污染組織可用青鏈霉素和制霉菌素漂洗。霉素和制霉菌素漂洗。l原代培養(yǎng)，特別是正常細(xì)胞的培養(yǎng)，應(yīng)采用原代培養(yǎng)，特別是正常細(xì)胞的培養(yǎng)，應(yīng)采用營養(yǎng)豐富營養(yǎng)豐富的的培養(yǎng)液。培養(yǎng)液。l一般來講一般來講, ,胚胎組織較成熟個(gè)體的組織容易培養(yǎng)胚胎組織較成熟個(gè)體的組織容易培養(yǎng); ;分化低分化低的較分化高的組織容易生長的較分化高的組織容易生長; ;腫瘤組織較正常組織容易腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng)。取材時(shí)應(yīng)盡量選用培養(yǎng)。取材時(shí)應(yīng)盡量選用易培養(yǎng)易培養(yǎng)的組織進(jìn)行培養(yǎng)。的組織進(jìn)行培養(yǎng)。l為了便于以后鑒別原代組織的來源和觀察細(xì)胞體外培養(yǎng)為了便于以后鑒別原代組織的來源和觀察細(xì)

12、胞體外培養(yǎng)與原組織的差異性，原代取材同時(shí)保留組織學(xué)和電鏡標(biāo)與原組織的差異性，原代取材同時(shí)保留組織學(xué)和電鏡標(biāo)本，對(duì)供體來源、部位及一般情況做記錄。本，對(duì)供體來源、部位及一般情況做記錄。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇組織材料的分離組織材料的分離機(jī)械法機(jī)械法：適于較：適于較柔軟柔軟的組織，如腦、脾、淋巴結(jié)、的組織，如腦、脾、淋巴結(jié)、胸腺等。剪切組織為胸腺等。剪切組織為1mm1mm3 3碎塊后，置于組織勻漿碎塊后，置于組織勻漿器研磨或用注射器針芯擠壓后過不銹鋼篩網(wǎng)。器研磨或用注射器針芯擠壓后過不銹鋼篩網(wǎng)?；瘜W(xué)法化學(xué)法：胰蛋白酶、膠原酶、：胰蛋白酶、膠原酶、EDTAEDTA法法細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液的分離方法：低速離心法

13、、密度梯度離的分離方法：低速離心法、密度梯度離心法心法細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇細(xì)胞懸液的分離方法細(xì)胞懸液的分離方法低速離心低速離心法：法： 血液和體液等細(xì)胞懸液血液和體液等細(xì)胞懸液500-500-1000rpm1000rpm離心離心5-10min5-10min。離心速度過大、時(shí)間過。離心速度過大、時(shí)間過長，會(huì)造成細(xì)胞損傷和死亡。長，會(huì)造成細(xì)胞損傷和死亡。密度梯度離心密度梯度離心法：法： 用離心法將細(xì)胞分到不同用離心法將細(xì)胞分到不同密度的梯度介質(zhì)中，再分別吸出各層細(xì)胞。適密度的梯度介質(zhì)中，再分別吸出各層細(xì)胞。適于分離密度不等的細(xì)胞。常用介質(zhì)有于分離密度不等的細(xì)胞。常用介質(zhì)有Ficoll Ficoll

14、400400，PercollPercoll，泛影葡胺等。，泛影葡胺等。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇胰蛋白酶（胰蛋白酶（TrypsinTrypsin） 對(duì)細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞離散。對(duì)細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞離散。消化效果與消化效果與PHPH值、溫度、酶濃度和組織塊大小與值、溫度、酶濃度和組織塊大小與硬度有關(guān)。硬度有關(guān)。適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，軟組織，能有效地分離能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。而對(duì)含結(jié)締組織較豐富的組織，如乳腺、滑膜、而對(duì)含結(jié)締組織較豐富的組織，如乳腺、滑膜、子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等無

15、效但若與膠原子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等無效但若與膠原酶合用能增加其對(duì)組織的分離作用酶合用能增加其對(duì)組織的分離作用 。鈣鎂離子和血清抑制其活性鈣鎂離子和血清抑制其活性。常用劑量為常用劑量為0.25%0.25%，PH8PH8，溫度，溫度3737細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇膠原酶法（膠原酶法（collagenasecollagenase） 水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分，對(duì)上皮細(xì)胞影水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分，對(duì)上皮細(xì)胞影響不大。響不大。產(chǎn)品有產(chǎn)品有 等型，分別適用于分離肝細(xì)胞、等型，分別適用于分離肝細(xì)胞、胰島、脂肪細(xì)胞及纖維組織。胰島、脂肪細(xì)胞及纖維組織。鈣鎂離子和血清不影響活性鈣鎂離子和血清不影響活性，PH6

16、.5-7PH6.5-7常用劑量為常用劑量為200U/ml200U/ml細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇EDTAEDTA法法EDTAEDTA能與細(xì)胞上的能與細(xì)胞上的鈣、鎂離子鈣、鎂離子結(jié)合形成整合結(jié)合形成整合物，利用結(jié)合后的機(jī)械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)物，利用結(jié)合后的機(jī)械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞或使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離。胞或使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離。缺點(diǎn)是細(xì)胞易裂解或貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離時(shí)缺點(diǎn)是細(xì)胞易裂解或貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離時(shí)呈片狀，有團(tuán)塊，常不單獨(dú)使用，可與呈片狀，有團(tuán)塊，常不單獨(dú)使用，可與胰蛋白胰蛋白酶混合使用酶混合使用(1 (1：1 1或或2 2：1) 1)，既利于細(xì)胞脫壁又，既利于細(xì)胞脫壁

17、又利于細(xì)胞分散。可降低胰酶的用量和毒性作用。利于細(xì)胞分散?？山档鸵让傅挠昧亢投拘宰饔?。EDTAEDTA工作液的濃度為工作液的濃度為0.020.02，用用不含鈣、鎂不含鈣、鎂PBSPBS配制。配制。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇二、二、原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)(primary culture)(primary culture)從直接取自生物體細(xì)胞、組織或器官開始的培從直接取自生物體細(xì)胞、組織或器官開始的培養(yǎng)，即將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，養(yǎng)，即將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTAEDTA）或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞，置）或機(jī)械

18、方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖的過程。和繁殖的過程。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇原代培養(yǎng)細(xì)胞原代培養(yǎng)細(xì)胞組織和細(xì)胞剛剛離體，生物學(xué)特性未發(fā)生很大組織和細(xì)胞剛剛離體，生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍具有二倍體遺傳性，最接近和反映體變化，仍具有二倍體遺傳性，最接近和反映體內(nèi)生長特性，是藥物測(cè)試、細(xì)胞分化等實(shí)驗(yàn)的內(nèi)生長特性，是藥物測(cè)試、細(xì)胞分化等實(shí)驗(yàn)的很好對(duì)象；很好對(duì)象；原代細(xì)胞培養(yǎng)也是建立各種細(xì)胞系（原代細(xì)胞培養(yǎng)也是建立各種細(xì)胞系（cell line)cell line)或或細(xì)胞株（細(xì)胞株（cell straincell stra

19、in）必須經(jīng)過的階段。）必須經(jīng)過的階段。原代細(xì)胞培養(yǎng)多由各種細(xì)胞成分組成，比較復(fù)原代細(xì)胞培養(yǎng)多由各種細(xì)胞成分組成，比較復(fù)雜，即使是經(jīng)過處理后的細(xì)胞，也仍具有雜，即使是經(jīng)過處理后的細(xì)胞，也仍具有異質(zhì)異質(zhì)性（性（heterogeneous),heterogeneous),主要表現(xiàn)在細(xì)胞形態(tài)和大小主要表現(xiàn)在細(xì)胞形態(tài)和大小不一不一細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇原代培養(yǎng)的方法原代培養(yǎng)的方法懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法器官培養(yǎng)法器官培養(yǎng)法組織塊培養(yǎng)法組織塊培養(yǎng)法細(xì)胞培養(yǎng)法細(xì)胞培養(yǎng)法細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法對(duì)于懸浮生長的細(xì)胞如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)對(duì)于懸浮生長的細(xì)胞如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸

20、水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無須消化，可采用低速離心分離細(xì)胞無須消化，可采用低速離心分離, ,直接培直接培養(yǎng)。養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇器官培養(yǎng)器官培養(yǎng)( (organ cultureorgan culture) )指組織、器官原基，以至整個(gè)器官或其指組織、器官原基，以至整個(gè)器官或其一部分在體外的維持或生長，它們可以一部分在體外的維持或生長，它們可以分化與保持原來的結(jié)構(gòu)與功能。分化與保持原來的結(jié)構(gòu)與功能。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇細(xì)胞培養(yǎng)法細(xì)胞培養(yǎng)法方法與步驟方法與步驟1) 1) 動(dòng)物處死動(dòng)物處死：將出生：將出生2 23d3d乳鼠，乳鼠， 用脫頸方法處死。用酒精棉球

21、用脫頸方法處死。用酒精棉球 擦拭解剖部位。擦拭解剖部位。2) 2) 取材及剪切取材及剪切：在無菌條件下將：在無菌條件下將 組織取出，置于無菌培養(yǎng)皿中，組織取出，置于無菌培養(yǎng)皿中， 剪去多余的組織（脂肪等），剪去多余的組織（脂肪等）， 用用PBSPBS液洗滌液洗滌1-21-2次；放入另一次；放入另一 培養(yǎng)皿中，將組織剪成培養(yǎng)皿中，將組織剪成1mm1mm3 3大大 小的塊。小的塊。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇細(xì)胞培養(yǎng)法細(xì)胞培養(yǎng)法方法與步驟方法與步驟3) 3) 消化及分散組織塊消化及分散組織塊：將上述清洗過的組織放：將上述清洗過的組織放入無菌試管內(nèi)，加入入無菌試管內(nèi)，加入5 56 6倍量的倍量的0.250.2

22、5胰蛋白胰蛋白酶液（酶液（pH7.4 pH7.4 7.67.6），置），置3737水浴中消化水浴中消化20 20 40min40min，每隔，每隔10min10min搖動(dòng)一次，直到組織搖動(dòng)一次，直到組織塊變得疏松，粘稠，且顏色略變?yōu)榘咨珵橹?。塊變得疏松，粘稠，且顏色略變?yōu)榘咨珵橹?。取出試管，加入取出試管，加?ml5ml培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹打培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹打組織塊，使其分散成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液用組織塊，使其分散成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液用兩層滅菌紗布過濾至另一燒杯中。兩層滅菌紗布過濾至另一燒杯中。 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇細(xì)胞培養(yǎng)法細(xì)胞培養(yǎng)法方法與步驟方法與步驟4)計(jì)數(shù)與稀釋計(jì)數(shù)與稀釋: :從過

23、濾的細(xì)胞懸液中取出適量滴于血從過濾的細(xì)胞懸液中取出適量滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)；計(jì)數(shù)后細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)；計(jì)數(shù)后用培養(yǎng)液稀釋，稀釋后的濃度一般以每毫升含用培養(yǎng)液稀釋，稀釋后的濃度一般以每毫升含3 3 5 5105105個(gè)細(xì)胞為宜。個(gè)細(xì)胞為宜。5) 5)分裝與培養(yǎng)分裝與培養(yǎng)：將稀釋好的細(xì)胞懸液分裝于細(xì)胞培：將稀釋好的細(xì)胞懸液分裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶養(yǎng)瓶 or or 培養(yǎng)皿中，蓋好，做好標(biāo)記，置于培養(yǎng)皿中，蓋好，做好標(biāo)記，置于37 37 CO2CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6) 6)觀察觀察：逐日檢查培養(yǎng)物是否污染，觀察細(xì)胞生長：逐日檢查培養(yǎng)物是否污染，觀察細(xì)胞生長

24、情況。待細(xì)胞已基本長成致密單層時(shí)，即可進(jìn)行傳情況。待細(xì)胞已基本長成致密單層時(shí)，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。代培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇細(xì)胞培養(yǎng)法細(xì)胞培養(yǎng)法注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)取材的組織最好盡快培養(yǎng)取材的組織最好盡快培養(yǎng)，若不能及時(shí)培養(yǎng)，可將組織浸泡于，若不能及時(shí)培養(yǎng)，可將組織浸泡于培養(yǎng)液內(nèi)放置于冰浴或培養(yǎng)液內(nèi)放置于冰浴或4 40 0C C冰箱。若組織塊很大，應(yīng)先將其切成冰箱。若組織塊很大，應(yīng)先將其切成1cm21cm2以下的小塊再低溫保存，但時(shí)間不能超過以下的小塊再低溫保存，但時(shí)間不能超過2424小時(shí)，因放置時(shí)間小時(shí)，因放置時(shí)間長或組織塊太大都易造成細(xì)胞的死亡；長或組織塊太大都易造成細(xì)胞的死亡；取材時(shí)嚴(yán)格無菌操

25、作取材時(shí)嚴(yán)格無菌操作。用預(yù)先消毒好的器皿和帶有少量培養(yǎng)液用預(yù)先消毒好的器皿和帶有少量培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶進(jìn)行取材。所取組織要盡量避免紫外線照射或接觸任何化的培養(yǎng)瓶進(jìn)行取材。所取組織要盡量避免紫外線照射或接觸任何化學(xué)試劑及有害藥物如碘、汞等。學(xué)試劑及有害藥物如碘、汞等。3 3. . 取材時(shí)取材時(shí)要細(xì)心去除組織中的血液、結(jié)締組織、脂肪及壞要細(xì)心去除組織中的血液、結(jié)締組織、脂肪及壞死組織等。死組織等。修剪和切碎過程中，為避免組織干燥，可將其浸泡于修剪和切碎過程中，為避免組織干燥，可將其浸泡于少量培養(yǎng)液中；少量培養(yǎng)液中；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇組織塊培養(yǎng)法組織塊培養(yǎng)法組織塊培養(yǎng)組織塊培養(yǎng)是常用、簡便易行和成功率較

26、高的是常用、簡便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法，也是早期采用培養(yǎng)細(xì)胞的方法，原代培養(yǎng)方法，也是早期采用培養(yǎng)細(xì)胞的方法，故也被稱為組織培養(yǎng)故也被稱為組織培養(yǎng)(tissue culture)(tissue culture)。 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇組織塊培養(yǎng)法組織塊培養(yǎng)法(1) (1) 取材、修剪、組織剪或切成取材、修剪、組織剪或切成1mm1mm3 3左右的小左右的小 塊。塊。(2)(2)將將 剪切好的組織小塊用眼科鑷送入培剪切好的組織小塊用眼科鑷送入培 養(yǎng)養(yǎng) 瓶瓶內(nèi)。內(nèi)。25ml25ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)瓶( (底面積約為底面積約為17.5cm17.5cm2 2）以）以2020一一3030小塊為宜。小塊為宜

27、。(3) (3) 放置放置24h24h待組織小塊貼附后將培養(yǎng)瓶慢慢待組織小塊貼附后將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放、靜止培養(yǎng)翻轉(zhuǎn)平放、靜止培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)組織塊接種后組織塊接種后l-3l-3天，游出細(xì)胞數(shù)很少天，游出細(xì)胞數(shù)很少, ,組織塊組織塊的粘貼不牢固。觀察、移動(dòng)過程中要注意的粘貼不牢固。觀察、移動(dòng)過程中要注意動(dòng)作動(dòng)作輕巧輕巧。盡量不要引起液體的振蕩而產(chǎn)生對(duì)組織盡量不要引起液體的振蕩而產(chǎn)生對(duì)組織塊的沖擊力使其漂起。塊的沖擊力使其漂起。在原代培養(yǎng)的在原代培養(yǎng)的1-2d1-2d內(nèi)要持別內(nèi)要持別注意觀察注意觀察，是否有，是否有細(xì)菌、霉菌的污染。一旦發(fā)現(xiàn)，要及時(shí)清除，細(xì)菌、霉菌的污染。一

28、旦發(fā)現(xiàn)，要及時(shí)清除，以防給培養(yǎng)箱內(nèi)的其它細(xì)胞帶來污染。以防給培養(yǎng)箱內(nèi)的其它細(xì)胞帶來污染。原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)3-5d3-5d需需換液換液一次，去除漂浮的組織塊一次，去除漂浮的組織塊和殘留的血細(xì)胞，以免影響原代細(xì)胞的生長。和殘留的血細(xì)胞，以免影響原代細(xì)胞的生長。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇幾種細(xì)胞的原代培養(yǎng)圖示幾種細(xì)胞的原代培養(yǎng)圖示1.細(xì)胞種類：人肺細(xì)胞種類：人肺 部部 成成 纖纖 維維 細(xì)細(xì) 胞胞 ；2.培養(yǎng)的天數(shù)：培養(yǎng)的天數(shù)：2d - 4d - 7d;3.放大倍數(shù)：放大倍數(shù)： 200倍倍 ；4.培養(yǎng)基種類：培養(yǎng)基種類：1640+10%胎牛血清；胎牛血清；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述:細(xì)胞呈梭形

29、，細(xì)胞呈梭形，貼壁生長貼壁生長; 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇幾種細(xì)胞的原代培養(yǎng)圖示幾種細(xì)胞的原代培養(yǎng)圖示 1. 1. 細(xì)胞種類：小鼠胚胎細(xì)胞種類：小鼠胚胎成纖維細(xì)胞成纖維細(xì)胞 2. 2. 培養(yǎng)的天數(shù)：培養(yǎng)的天數(shù)：4d4d； 3. 3. 放大倍數(shù)：倒置顯微放大倍數(shù)：倒置顯微鏡鏡 ； 4. 4. 培養(yǎng)基種類：培養(yǎng)基種類：1640+10%X1640+10%X小牛血清；小牛血清； 5. 5. 細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述: :細(xì)胞呈長梭形，貼壁生長細(xì)胞呈長梭形，貼壁生長 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇幾種細(xì)胞的原代培養(yǎng)圖示幾種細(xì)胞的原代培養(yǎng)圖示神經(jīng)元原代培養(yǎng)神經(jīng)元原代培養(yǎng):神經(jīng)元是高度神經(jīng)元是高度分化的細(xì)胞分化的

30、細(xì)胞,在體外培養(yǎng)條件下難在體外培養(yǎng)條件下難以增殖以增殖.因此因此,目前神經(jīng)元的培養(yǎng)目前神經(jīng)元的培養(yǎng)主要用于原代培養(yǎng)主要用于原代培養(yǎng).神經(jīng)元胞體呈圓形或長桿狀神經(jīng)元胞體呈圓形或長桿狀,核大核大而圓而圓,核仁明顯核仁明顯.可見有細(xì)小突起可見有細(xì)小突起從胞體長出從胞體長出.培養(yǎng)液中需加入高濃度的葡萄糖培養(yǎng)液中需加入高濃度的葡萄糖,以利于神經(jīng)元的生長以利于神經(jīng)元的生長.細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇三、傳代培養(yǎng)三、傳代培養(yǎng)(passage or subculture)(passage or subculture)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長

31、，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。不論是否稀釋，不論是否稀釋，將細(xì)胞以一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個(gè)培養(yǎng)將細(xì)胞以一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個(gè)培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)(passage)(passage)。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇細(xì)胞的傳代培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)根據(jù)細(xì)胞生長的特點(diǎn)，傳代方法有根據(jù)細(xì)胞生長的特點(diǎn)，傳代方法有2 2種。種。懸浮生長細(xì)胞傳代懸浮生長細(xì)胞傳代離心法傳代：離心（離心法傳代：離心（1000rpm1000rpm）去上清，沉淀物加）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。新培養(yǎng)液后再混勻傳

32、代。直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除養(yǎng)液去除l l2 22 23 3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代胞懸液再傳代。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇細(xì)胞的傳代培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)貼壁生長細(xì)胞傳代貼壁生長細(xì)胞傳代 采用酶消化法傳代。在傳代時(shí)，需要用胰蛋采用酶消化法傳代。在傳代時(shí)，需要用胰蛋白酶將細(xì)胞消化，使其從支持物上脫落，或用白酶將細(xì)胞消化，使其從支持物上脫落，或用EDTAEDTA溶液與胰蛋白酶按溶液與胰蛋白酶按1 1：1 1或或2 2：1 1比例混合比例混合后聯(lián)合使用。常用的消化液有后聯(lián)合使用。常用的消化液有0.250

33、.25的胰蛋白的胰蛋白酶液。酶液。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇 Optimal confluency for moving cells to a new dish is 70-80%too low, cells will be in lag phase and wont proliferateToo high and cells may undergo unfavorable changes and will be difficult to remove from plate細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇貼壁生長細(xì)胞傳代方法貼壁生長細(xì)胞傳代方法細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇酶消化過程酶消化過程細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇酶消化過程酶消化

34、過程細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇注意問題注意問題操作全過程注意無菌操作操作全過程注意無菌操作胰酶消化時(shí)間要適度胰酶消化時(shí)間要適度吹打細(xì)胞時(shí)用力要適度，盡量減少氣泡吹打細(xì)胞時(shí)用力要適度，盡量減少氣泡細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇貼壁生長細(xì)胞的貼壁生長細(xì)胞的生長過程生長過程游離期游離期貼壁期貼壁期潛伏期潛伏期對(duì)數(shù)生長期對(duì)數(shù)生長期停止期（平臺(tái)期）停止期（平臺(tái)期）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇游離期游離期細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，也稱懸浮細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，也稱懸浮期期細(xì)胞質(zhì)回縮，胞質(zhì)呈圓球形細(xì)胞質(zhì)回縮，胞質(zhì)呈圓球形1010分鐘分鐘-4 -4小時(shí)小時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇貼壁期貼壁期細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細(xì)胞附著

35、于底物上，游離期結(jié)束。底物：膠原、玻璃、塑料等底物：膠原、玻璃、塑料等細(xì)胞株平均在細(xì)胞株平均在1010分鐘分鐘-4 -4小時(shí)貼壁小時(shí)貼壁血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白。膠原等糖蛋白。進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)（化學(xué)合成的功能進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）基團(tuán)）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇潛伏期、對(duì)數(shù)生長期、停止期潛伏期、對(duì)數(shù)生長期、停止期潛伏期潛伏期：細(xì)胞有生長活動(dòng)，而無細(xì)胞分裂，細(xì)：細(xì)胞有生長活動(dòng)，而無細(xì)胞分裂，細(xì)胞株潛伏期一般為胞株潛伏期一般為6-246-24小時(shí)。小時(shí)。對(duì)數(shù)生長期對(duì)數(shù)生長期：細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長

36、，活：細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。停止期停止期：細(xì)胞長滿瓶壁，雖有活力但不再分裂，：細(xì)胞長滿瓶壁，雖有活力但不再分裂，機(jī)制為接觸抑制、密度依賴性。機(jī)制為接觸抑制、密度依賴性。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇四、影響體外培養(yǎng)細(xì)胞的因素四、影響體外培養(yǎng)細(xì)胞的因素組織和細(xì)胞供體年齡組織和細(xì)胞供體年齡培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件細(xì)胞的粘附細(xì)胞的粘附培養(yǎng)技術(shù)方法培養(yǎng)技術(shù)方法促生長因子促生長因子細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇組織和細(xì)胞供體年齡組織和細(xì)胞供體年齡幼年個(gè)體比老年者易于培養(yǎng)，所有動(dòng)物的胚胎幼年個(gè)體比老年者易于培養(yǎng)，所有動(dòng)物的胚胎組織都是最好的培養(yǎng)對(duì)象。組織都是

37、最好的培養(yǎng)對(duì)象。來自同一個(gè)體的組織，分化低的比分化高的容來自同一個(gè)體的組織，分化低的比分化高的容易培養(yǎng)。易培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件不同的細(xì)胞對(duì)不同的細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基培養(yǎng)基需求不同，當(dāng)前尚無一種培需求不同，當(dāng)前尚無一種培養(yǎng)基是萬能的，應(yīng)選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基。應(yīng)了解所養(yǎng)基是萬能的，應(yīng)選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基。應(yīng)了解所培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)性狀和特殊需求成分。培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)性狀和特殊需求成分。細(xì)胞在體外進(jìn)行培養(yǎng)，失去了機(jī)體的調(diào)節(jié)和控制。細(xì)胞在體外進(jìn)行培養(yǎng)，失去了機(jī)體的調(diào)節(jié)和控制。因此，除滿足營養(yǎng)的要求外，還必須使細(xì)胞生存因此，除滿足營養(yǎng)的要求外，還必須使細(xì)胞生存環(huán)境盡量接近活體的環(huán)境。外環(huán)境的培養(yǎng)條件如

38、環(huán)境盡量接近活體的環(huán)境。外環(huán)境的培養(yǎng)條件如溫度、滲透壓、氣體環(huán)境、溫度、滲透壓、氣體環(huán)境、PHPH值值等均能影響細(xì)胞等均能影響細(xì)胞的生長的生長。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇細(xì)胞貼附的過程細(xì)胞貼附的過程細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇影響細(xì)胞貼附的因素影響細(xì)胞貼附的因素細(xì)胞類型細(xì)胞類型 ( (附著最強(qiáng)附著最強(qiáng)) )巨噬細(xì)胞一成纖維細(xì)胞巨噬細(xì)胞一成纖維細(xì)胞上皮上皮細(xì)胞細(xì)胞血細(xì)胞血細(xì)胞( (最弱最弱) ) 生物因素生物因素 血清、培養(yǎng)液中的促附著因子血清、培養(yǎng)液中的促附著因子 機(jī)械，物理等其他因素機(jī)械，物理等其他因素離心：促進(jìn)附著離心：促進(jìn)附著流動(dòng)：培養(yǎng)液流動(dòng)可阻止細(xì)胞附著流動(dòng)：培養(yǎng)液流動(dòng)可阻止細(xì)胞附著低溫：可抑制附著低溫

39、：可抑制附著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇促生長因子促生長因子現(xiàn)已證明，很多激素如胰島素、氫化可的松等具有促現(xiàn)已證明，很多激素如胰島素、氫化可的松等具有促進(jìn)細(xì)胞生長作用。胰島素能促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄糖和氨進(jìn)細(xì)胞生長作用。胰島素能促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄糖和氨基酸，用量為基酸，用量為1 110U/ml10U/ml。氫化可的松可促進(jìn)表皮細(xì)胞。氫化可的松可促進(jìn)表皮細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞生長，并能提高膠質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)和乳腺上皮細(xì)胞生長，并能提高膠質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的克隆形成率，用量為胞的克隆形成率，用量為1010-8 -8 1010-7 -7mol/Lmol/L。人表皮生長因子（人表皮生長因子（hEGF)hEGF)對(duì)大鼠宮頸鱗

40、狀上皮細(xì)胞對(duì)大鼠宮頸鱗狀上皮細(xì)胞(RCEC)(RCEC)有促進(jìn)增殖的作用。有促進(jìn)增殖的作用。表皮生長因子表皮生長因子(EGF)(EGF)、成纖維細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)(FGF)等生等生長調(diào)節(jié)因子都能促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖。長調(diào)節(jié)因子都能促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇五、細(xì)胞培養(yǎng)污染及對(duì)策五、細(xì)胞培養(yǎng)污染及對(duì)策培養(yǎng)細(xì)胞生長狀況常規(guī)檢查培養(yǎng)細(xì)胞生長狀況常規(guī)檢查培養(yǎng)液：顏色與透明度的變化培養(yǎng)液：顏色與透明度的變化細(xì)胞生長狀況。細(xì)胞生長狀況。細(xì)胞形態(tài)變化。細(xì)胞形態(tài)變化。微生物污染微生物污染細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇培養(yǎng)液培養(yǎng)液PHPH值值（顏色變化）（顏色變化）變黃，表示變黃，表示

41、PHPH值下降，細(xì)胞生長旺盛，代謝值下降，細(xì)胞生長旺盛，代謝產(chǎn)生的酸性物不斷積累導(dǎo)致。產(chǎn)生的酸性物不斷積累導(dǎo)致。變紅或紫紅色，表示變紅或紫紅色，表示PHPH值上升，細(xì)胞生長停值上升，細(xì)胞生長停滯、死亡。滯、死亡。一般生長穩(wěn)定的細(xì)胞需要一般生長穩(wěn)定的細(xì)胞需要2-32-3天換液天換液1 1次，生長次，生長慢的細(xì)胞需要慢的細(xì)胞需要3-43-4天換液一次。天換液一次。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇細(xì)胞換液細(xì)胞換液原代細(xì)胞原代細(xì)胞經(jīng)經(jīng)2424小時(shí)培養(yǎng)，培養(yǎng)液顏色變淺，表示小時(shí)培養(yǎng)，培養(yǎng)液顏色變淺，表示細(xì)胞代謝好。少量換液可刺激細(xì)胞生長。細(xì)胞代謝好。少量換液可刺激細(xì)胞生長。通常每周兩次，每次換半量或通常每周兩次，每次

42、換半量或1/5-1/31/5-1/3量。原代細(xì)量。原代細(xì)胞第胞第1 1次換液時(shí)，切記不要把培養(yǎng)液全部倒掉。次換液時(shí)，切記不要把培養(yǎng)液全部倒掉。細(xì)胞株（系）細(xì)胞株（系）：條件合適時(shí)生長迅速，過夜就變：條件合適時(shí)生長迅速，過夜就變黃，可進(jìn)行全量換液。這種情況下，最好減少細(xì)黃，可進(jìn)行全量換液。這種情況下，最好減少細(xì)胞接種數(shù)，延長換液的時(shí)間。胞接種數(shù)，延長換液的時(shí)間。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇細(xì)胞生長狀況細(xì)胞生長狀況常規(guī)應(yīng)特別注意細(xì)胞的生長增殖情況。常規(guī)應(yīng)特別注意細(xì)胞的生長增殖情況。原代細(xì)胞：經(jīng)歷一個(gè)適應(yīng)或潛伏期。原代細(xì)胞：經(jīng)歷一個(gè)適應(yīng)或潛伏期。細(xì)胞系：多為細(xì)胞系：多為2424小時(shí)以內(nèi)。小時(shí)以內(nèi)。細(xì)胞長滿瓶底

43、細(xì)胞長滿瓶底80%80%時(shí)應(yīng)及時(shí)傳代。時(shí)應(yīng)及時(shí)傳代。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇細(xì)胞形態(tài)變化細(xì)胞形態(tài)變化生長良好細(xì)胞：透明度大，折光性強(qiáng)，輪廓不生長良好細(xì)胞：透明度大，折光性強(qiáng)，輪廓不清。清。生長狀態(tài)不良時(shí)，細(xì)胞折光性變?nèi)?，輪廓增?qiáng)，生長狀態(tài)不良時(shí)，細(xì)胞折光性變?nèi)?，輪廓增?qiáng)，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡，脂滴，顆粒樣物質(zhì)，細(xì)胞胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡，脂滴，顆粒樣物質(zhì)，細(xì)胞之間空隙加大。之間空隙加大。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇微生物污染微生物污染培養(yǎng)液顏色與透明度：培養(yǎng)液顏色與透明度：培養(yǎng)液混濁，液體內(nèi)漂菌絲或細(xì)胞菌。培養(yǎng)液混濁，液體內(nèi)漂菌絲或細(xì)胞菌。支原體污染，沒有明顯癥狀，但細(xì)胞生長卻明支原體污染，沒有明顯癥狀，但細(xì)胞生長卻明

44、顯變緩。顯變緩。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇細(xì)胞培養(yǎng)污染的概念細(xì)胞培養(yǎng)污染的概念不僅僅指微生物，包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)細(xì)不僅僅指微生物，包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)細(xì)胞生存有害的成份和造成細(xì)胞不純的異物，因此胞生存有害的成份和造成細(xì)胞不純的異物，因此一般包括一般包括微生物微生物( (真菌、細(xì)菌、病毒和支原體真菌、細(xì)菌、病毒和支原體) )、化學(xué)物質(zhì)化學(xué)物質(zhì)( (影響細(xì)胞生存、非細(xì)胞所需的化學(xué)成份影響細(xì)胞生存、非細(xì)胞所需的化學(xué)成份) )及及細(xì)胞細(xì)胞( (非同一種的其它細(xì)胞非同一種的其它細(xì)胞) )。其中以微生物污。其中以微生物污染最多見。另外隨著細(xì)胞種類增多不同種細(xì)胞染最多見。另外隨著細(xì)胞種類增多不同種細(xì)胞交叉

45、污染也時(shí)有發(fā)生、從而造成細(xì)胞不純。交叉污染也時(shí)有發(fā)生、從而造成細(xì)胞不純。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇污染的途徑污染的途徑空氣空氣：空氣是微生物傳播的最主要途徑。：空氣是微生物傳播的最主要途徑。 凈化工作臺(tái)使用過久，濾器受塵埃阻塞，可使凈凈化工作臺(tái)使用過久，濾器受塵埃阻塞，可使凈化工作不能正常進(jìn)行化工作不能正常進(jìn)行工作時(shí)不戴口罩或面對(duì)操作野大聲講話、咳嗽等工作時(shí)不戴口罩或面對(duì)操作野大聲講話、咳嗽等使外界氣流過強(qiáng)使外界氣流過強(qiáng)減少空氣流動(dòng)是防止污染的重要環(huán)節(jié)。減少空氣流動(dòng)是防止污染的重要環(huán)節(jié)。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇污染的途徑污染的途徑器材器材：各種培養(yǎng)器皿及器械清洗消毒不徹底：各種培養(yǎng)器皿及器械清洗消毒不徹底

46、洗刷不干凈，污物殘留及培養(yǎng)用液等滅菌不徹底洗刷不干凈，污物殘留及培養(yǎng)用液等滅菌不徹底CO2CO2溫箱由于溫箱內(nèi)濕度大，溫度適宜，取存溫箱由于溫箱內(nèi)濕度大，溫度適宜，取存細(xì)胞時(shí)不慎將培養(yǎng)液漏出，易使細(xì)菌、霉菌孽生，細(xì)胞時(shí)不慎將培養(yǎng)液漏出，易使細(xì)菌、霉菌孽生，而而CO2CO2溫箱內(nèi)是開放式培養(yǎng)如不定期消毒溫箱內(nèi)是開放式培養(yǎng)如不定期消毒, ,可形可形成污染成污染. .細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇污染的途徑污染的途徑操作操作無菌觀念不強(qiáng)、動(dòng)作不準(zhǔn)確、使用污染的器具或無菌觀念不強(qiáng)、動(dòng)作不準(zhǔn)確、使用污染的器具或封瓶時(shí)不嚴(yán)封瓶時(shí)不嚴(yán)培養(yǎng)兩種以上細(xì)胞時(shí)，操作不規(guī)范、交叉使用吸培養(yǎng)兩種以上細(xì)胞時(shí)，操作不規(guī)范、交叉使用吸管

47、或營養(yǎng)液瓶等有可能導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。管或營養(yǎng)液瓶等有可能導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇污染的途徑污染的途徑血清血清：有些血清在生產(chǎn)時(shí)就已被支原體或病毒：有些血清在生產(chǎn)時(shí)就已被支原體或病毒等污染，即可成為污染的來源。等污染，即可成為污染的來源。組織樣本組織樣本：原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來源于組織樣：原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來源于組織樣本；另一方面手術(shù)時(shí)使用碘酒消毒，這些混入本；另一方面手術(shù)時(shí)使用碘酒消毒，這些混入組織中的碘可以影響細(xì)胞生長。組織中的碘可以影響細(xì)胞生長。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇污染對(duì)細(xì)胞的影響污染對(duì)細(xì)胞的影響支原體和病毒支原體和病毒對(duì)細(xì)胞的形態(tài)和機(jī)能的影響是長期對(duì)細(xì)胞的形態(tài)和機(jī)能的影響是長期的

48、、緩慢的和潛在的的、緩慢的和潛在的霉菌和細(xì)菌霉菌和細(xì)菌繁殖迅速，能在很短時(shí)間內(nèi)壓制細(xì)胞繁殖迅速，能在很短時(shí)間內(nèi)壓制細(xì)胞生長或產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺滅細(xì)胞。生長或產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺滅細(xì)胞。化學(xué)物質(zhì)污染化學(xué)物質(zhì)污染如重金屬或其它化學(xué)試劑混入培養(yǎng)如重金屬或其它化學(xué)試劑混入培養(yǎng)液中后，有的毒性較小、如能及時(shí)排出，細(xì)胞仍液中后，有的毒性較小、如能及時(shí)排出，細(xì)胞仍可存活但有些烴化物如多環(huán)芳烴等有致突變性，可存活但有些烴化物如多環(huán)芳烴等有致突變性，能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇細(xì)菌的污染和檢測(cè)細(xì)菌的污染和檢測(cè)細(xì)菌污染是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染，即使細(xì)菌污染是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染，即使在細(xì)

49、胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素，也可能因?yàn)椴僮髟诩?xì)胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素，也可能因?yàn)椴僮鞑簧鞫鹞廴?。最常見的有不慎而引起污染。最常見的有革蘭氏陽性菌，如革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌、白色葡萄球菌，枯草桿菌、白色葡萄球菌， 以及以及大腸桿菌、假單大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌。胞菌等革蘭氏陰性菌。 培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pHpH改變。污染后細(xì)胞發(fā)生改變。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改病理改 變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。死亡。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇細(xì)菌污染細(xì)菌污染細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇細(xì)菌污染的檢測(cè)細(xì)菌污染的檢

50、測(cè)肉眼直接觀察法肉眼直接觀察法培養(yǎng)檢查法培養(yǎng)檢查法顯微鏡觀察法顯微鏡觀察法PCRPCR檢測(cè)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇真菌污染真菌污染真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，最常見的真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，最常見的真菌有真菌有煙曲霉、煙曲霉、 黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。菌和酵母菌。培養(yǎng)細(xì)胞受培養(yǎng)細(xì)胞受真菌真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn)，肉眼可見；有的散在生長，倒置顯微淺黃色的小點(diǎn)，肉眼可見；有的散在生長，倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲

51、縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列，培養(yǎng)液一般不發(fā)之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列，培養(yǎng)液一般不發(fā)生渾濁。真菌污染后，細(xì)胞生長變慢，但最后由于營生渾濁。真菌污染后，細(xì)胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇真菌污染真菌污染細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇支原體污染和檢測(cè)支原體污染和檢測(cè)支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨(dú)立生活的最小支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨(dú)立生活的最小微生物，最小直徑微生物，最小直徑0.2um0.2um，一般，一般過濾除菌過濾除菌無法去無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開

52、始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件下生存，對(duì)青霉素有抗藥性。發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件下生存，對(duì)青霉素有抗藥性。多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間。多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間。培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見細(xì)培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見細(xì)胞生長增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。胞生長增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無明顯變化，或略有變化，若但多數(shù)細(xì)胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時(shí)處理，還會(huì)產(chǎn)生交叉污染。不及時(shí)處理，還會(huì)產(chǎn)生交叉污染。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇掃描電鏡法顯示支原體，附于細(xì)胞表面眾掃描電鏡法顯示支原體，附于細(xì)胞表面眾多的圓形顆粒為支原體多的圓形顆粒為支

53、原體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇支原體污染的檢測(cè)支原體污染的檢測(cè)相差顯微鏡觀察法相差顯微鏡觀察法Hayflick Hayflick 培養(yǎng)基直接培養(yǎng)法培養(yǎng)基直接培養(yǎng)法DNADNA熒光染色法（熒光染色法（Hoechst 33258Hoechst 33258）PCRPCR方法（即用型細(xì)胞培養(yǎng)中支原體檢測(cè)方法（即用型細(xì)胞培養(yǎng)中支原體檢測(cè)PCRPCR試劑盒）試劑盒）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇病毒的污染和檢測(cè)病毒的污染和檢測(cè)細(xì)胞的直接觀察細(xì)胞的直接觀察動(dòng)物接種檢查動(dòng)物接種檢查電子顯微鏡觀察電子顯微鏡觀察PCRPCR技術(shù)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇污染的預(yù)防污染的預(yù)防防止污染，防止污染，預(yù)防預(yù)防是關(guān)鍵，預(yù)防措施應(yīng)貫穿于整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)

54、的是關(guān)鍵，預(yù)防措施應(yīng)貫穿于整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)的始終。始終。器皿準(zhǔn)備器皿準(zhǔn)備開始操作前開始操作前操作過程中操作過程中其他細(xì)節(jié)方面的預(yù)防其他細(xì)節(jié)方面的預(yù)防在培養(yǎng)液中加入適量的在培養(yǎng)液中加入適量的抗菌素抗菌素。常規(guī)加入青霉素和鏈霉素各。常規(guī)加入青霉素和鏈霉素各100U/ml100U/ml。必要時(shí)加入慶大霉素、卡那霉素或兩性霉素。必要時(shí)加入慶大霉素、卡那霉素或兩性霉素B B等。等。培養(yǎng)箱內(nèi)應(yīng)經(jīng)常清潔消毒，放置含硫酸銅的消毒水。培養(yǎng)箱內(nèi)應(yīng)經(jīng)常清潔消毒，放置含硫酸銅的消毒水。購入的未滅活血清應(yīng)采取購入的未滅活血清應(yīng)采取5656水浴滅活水浴滅活30min30min的措施以使血清的措施以使血清中的補(bǔ)體和支原體中的補(bǔ)

55、體和支原體滅活滅活。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇支原體污染的預(yù)防支原體污染的預(yù)防小牛血清小牛血清是造成支原體初級(jí)污染的主要來源是造成支原體初級(jí)污染的主要來源次級(jí)污染源，即已污染支原體的細(xì)胞在污染的傳播中更為重要次級(jí)污染源，即已污染支原體的細(xì)胞在污染的傳播中更為重要保證培養(yǎng)細(xì)胞的保證培養(yǎng)細(xì)胞的來源來源絕對(duì)干凈，同時(shí)應(yīng)做好檢測(cè)，一旦發(fā)現(xiàn)支絕對(duì)干凈，同時(shí)應(yīng)做好檢測(cè)，一旦發(fā)現(xiàn)支原體污染就應(yīng)廢棄原體污染就應(yīng)廢棄嚴(yán)禁已知污染了支原體的細(xì)胞進(jìn)入未污染的工作區(qū)域。嚴(yán)禁已知污染了支原體的細(xì)胞進(jìn)入未污染的工作區(qū)域。嚴(yán)格嚴(yán)格無菌操作無菌操作，杜絕人為污染。，杜絕人為污染。對(duì)每批小牛血清嚴(yán)格檢查，對(duì)每批小牛血清嚴(yán)格檢查，滅活、

56、過濾滅活、過濾有利于抑制支原體的污有利于抑制支原體的污染。染。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇污染的清除污染的清除培養(yǎng)的細(xì)胞一旦污染應(yīng)及時(shí)處理，防止污染其培養(yǎng)的細(xì)胞一旦污染應(yīng)及時(shí)處理，防止污染其他細(xì)胞。他細(xì)胞。高壓滅菌被污染的細(xì)胞，然后棄掉。高壓滅菌被污染的細(xì)胞，然后棄掉。有價(jià)值的細(xì)胞被污染，并且污染程度較輕，可有價(jià)值的細(xì)胞被污染，并且污染程度較輕，可以通過及時(shí)排除污染物，挽救細(xì)胞恢復(fù)正常以通過及時(shí)排除污染物，挽救細(xì)胞恢復(fù)正常常用的排除微生物污染的方法有以下常用的排除微生物污染的方法有以下4 4種種細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇抗生素排除法抗生素排除法 抗生素是細(xì)胞培養(yǎng)中殺滅抗生素是細(xì)胞培養(yǎng)中殺滅細(xì)菌細(xì)菌的主要手段。的

57、主要手段。聯(lián)合應(yīng)用聯(lián)合應(yīng)用比單用效果好，預(yù)防性應(yīng)用比污染后應(yīng)比單用效果好，預(yù)防性應(yīng)用比污染后應(yīng)用好用好有的抗生素對(duì)細(xì)菌僅有抑制作用，無殺滅效應(yīng)。有的抗生素對(duì)細(xì)菌僅有抑制作用，無殺滅效應(yīng)。反復(fù)使用抗生素還能使微生物產(chǎn)生耐藥性，而且反復(fù)使用抗生素還能使微生物產(chǎn)生耐藥性，而且對(duì)細(xì)胞本身也有一定影響對(duì)細(xì)胞本身也有一定影響盡量不用抗生素處理盡量不用抗生素處理一些有價(jià)值的細(xì)胞被污染后，仍需要用抗生素挽一些有價(jià)值的細(xì)胞被污染后，仍需要用抗生素挽救，在這種情況下，可采用救，在這種情況下，可采用5 51010倍于常用量的倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作用沖擊法，加入高濃度抗生素后作用24244848小時(shí)

58、，小時(shí)，再換入常規(guī)的培養(yǎng)液，有時(shí)可以奏效再換入常規(guī)的培養(yǎng)液，有時(shí)可以奏效細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇加溫除菌加溫除菌根據(jù)支原體耐熱性能差的特點(diǎn)。有人將受支原根據(jù)支原體耐熱性能差的特點(diǎn)。有人將受支原體污染的細(xì)胞置于體污染的細(xì)胞置于4141度作用度作用5 51010小時(shí)小時(shí)（最長（最長可以達(dá)可以達(dá)1818小時(shí)）殺滅支原體小時(shí)）殺滅支原體但是但是4141度對(duì)細(xì)胞本身應(yīng)有較大影響，故在處理度對(duì)細(xì)胞本身應(yīng)有較大影響，故在處理前，應(yīng)先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，確定最大限度殺傷支原前，應(yīng)先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，確定最大限度殺傷支原體而對(duì)細(xì)胞影響較小的處理時(shí)間。體而對(duì)細(xì)胞影響較小的處理時(shí)間。 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇?jiǎng)游矬w內(nèi)接種動(dòng)物體內(nèi)接種受微生物

59、污染的腫瘤細(xì)胞可以接種到同種動(dòng)物受微生物污染的腫瘤細(xì)胞可以接種到同種動(dòng)物皮下或腹腔，借動(dòng)物體內(nèi)免疫系統(tǒng)消滅掉微生皮下或腹腔，借動(dòng)物體內(nèi)免疫系統(tǒng)消滅掉微生物，腫瘤細(xì)胞卻能在體內(nèi)生長，待一定時(shí)間，物，腫瘤細(xì)胞卻能在體內(nèi)生長，待一定時(shí)間，從體內(nèi)取出再進(jìn)行培養(yǎng)繁殖。從體內(nèi)取出再進(jìn)行培養(yǎng)繁殖。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)在良好的體外培養(yǎng)條件下巨噬細(xì)胞可以存活在良好的體外培養(yǎng)條件下巨噬細(xì)胞可以存活7 71010天，并可以分泌一些細(xì)胞因子支持其他細(xì)天，并可以分泌一些細(xì)胞因子支持其他細(xì)胞的克隆生長。胞的克隆生長。巨噬細(xì)胞在體外條件下仍然可以吞噬微生物并巨噬細(xì)胞在體外條件下仍然可以吞噬微生

60、物并將其消化。將其消化。利用利用9696孔板將極少培養(yǎng)細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，孔板將極少培養(yǎng)細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，可以在高度稀釋培養(yǎng)細(xì)胞、極大地降低微生物可以在高度稀釋培養(yǎng)細(xì)胞、極大地降低微生物污染程度地同時(shí)，更有效地發(fā)揮巨噬細(xì)胞清除污染程度地同時(shí)，更有效地發(fā)揮巨噬細(xì)胞清除污染的效能。污染的效能。與抗生素聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。與抗生素聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇六、培養(yǎng)細(xì)胞生長的測(cè)定方法六、培養(yǎng)細(xì)胞生長的測(cè)定方法細(xì)胞計(jì)數(shù)法細(xì)胞計(jì)數(shù)法胎盤蘭染色法胎盤蘭染色法MTTMTT比色法比色法細(xì)胞生長曲線法細(xì)胞生長曲線法 3 3H-TdR(H-TdR(3 3H-H-胸腺嘧啶核苷）摻入法胸腺嘧啶核苷）摻入