茉莉花香氣相關基因JsDXS及其啟動子的克隆與表達分析

1、園 藝 學 報 2014，41（6）：12361244 http: / www. ahs. ac. cn acta horticulturae sinica e-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20131213；修回日期：20140410 基金項目：福建省科技廳區(qū)域重大項目（2010n3001）；福建農林大學園藝植物種質與高優(yōu)生產技術創(chuàng)新團隊項目（cxtd12013） * 通信作者 author for correspondence（e-mail：ynxtea，guixinchen；tel 茉莉花香氣相關基因jsdxs及其啟動子的克隆與表達分析 孫

2、 君1，陳桂信1,*，葉乃興1,2,*，呂恃衡1，劉志欽3，黃 瑋1，林志達1 （1福建農林大學園藝學院，福州 350002；2福建農林大學茶葉科技與經濟研究所，福州 350002；3福建農林大學生命科學學院，福州 350002） 摘 要：以雙瓣茉莉花瓣為材料，采用rt-pcr和race技術相結合的方法，獲得茉莉花香氣形成限速酶即5磷酸脫氧木酮糖合成酶（deoxyoxylulose-5-phosphate synthase，dxs）基因（命名為jsdxs）；采用染色體步移技術獲得該基因的啟動子序列；采用實時熒光定量pcr技術檢測該基因在花瓣發(fā)育過程中的表達動態(tài)。結果表明，jsdxs全長cdna

3、 為2 505 bp，其中orf（open reading frame）為2 145 bp，編碼714個氨基酸，含有tpp-dxs、tpp-pyr-dxs-tk-like和transketolase c等保守功能結構域；分離得到jsdxs基因上游調控序列745 bp，其含啟動子核心元件tata-box及t/gboxatpin2（茉莉酮酸酯相關元件）、ciacadianlelhc（生物鐘相關元件）、mycconsensusat（低溫相關元件）等與花香形成相關的重要順式作用元件；熒光定量pcr分析表明，該基因在18：00時表達量較低，隨著時間的推移逐漸上調，到夜間22：00時表達量達到最高，逐漸又

4、出現下調的趨勢，直至凌晨2：00時表達量降到最低，說明該基因的表達受生物鐘的控制。 關鍵詞：茉莉花；香氣；5磷酸脫氧木酮糖合成酶；啟動子；順式作用元件；表達分析 中圖分類號：s 685.16 文獻標志碼：a 文章編號：0513-353x（2014）06-1236-09 cloning and expression analysis of deoxyoxylulose-5-phosphate synthase gene related to aroma from jasminum sambac and isolation of its promoter sun jun1，chen gui-xin

5、1,*，ye nai-xing1,2,*，lÜ shi-heng1，liu zhi-qin3，huang wei1，and lin zhi-da1 （1college of horticulture，fujian agriculture and forestry university，fuzhou 350002，china；2the institute of tea science and technology and economy，fujian agriculture and forestry university，fuzhou 350002，china；3college of

6、life science，fujian agriculture and forestry university，fuzhou 350002，china） abstract：the full length cdna sequence of deoxyoxylulose-5-phosphate synthase gene（jsdxs）was cloned from jasminum sambacby using rt-pcr and rapid amplification of cdna ends（race）method. according to the 2 505 bp sequence，th

7、e promoter of jsdxs was isolated using genome walking method. the gene expression pattern in blooming was analyzed by the real-time pcr. gene structure 6期 孫 君等：茉莉花香氣相關基因jsdxs及其啟動子的克隆與表達分析 1237 analysis showed that the full length cdna contained a 2 145 bp open reading frame（orf），encoding a protein o

8、f 714 amino acid. there were several conserved domains，such as tpp-dxs，tpp-pyr-dxs- tk-like，transketolase c，etc. one 745 bp sequence was found to be the promoter of jsdxs，which contained many cis-acting elements，such as tata-box，t/gboxatpin2（related to jasmonate signaling），mycconsensusat（related to

9、cold stress），ciacadianlelhc（necessary for circadian expression）. the real-time pcr analysis revealed that the gene expression at 18：00 was low and started to increase and reached a maximum at 22：00，and then started to decrease and reached a minimum at 2：00. this phenomenon perhaps illustrated that t

10、he expression of jsdxs was regulated by circadian. key words：jasminum sambac；aroma；deoxyoxylulose-5-phosphate synthase；promoter；cis-acting element；expression analysis 茉莉花jasminum sambac（l.）ait是木犀科（oleaceae）素馨屬（jasminum）茶用香花植物。茉莉花茶質量的優(yōu)劣取決于花朵的質量，尤其是花朵中香氣釋放量與持續(xù)時間。前人對茉莉花品種形態(tài)特征和香氣特性做了大量研究（郭友嘉 等，1993，1994

11、；張麗霞 等，2002；葉乃興 等，2007；楊江帆，2008；李鶴，2012），發(fā)現茉莉花香氣成分中含芳樟醇、法呢烯、石竹烯、橙花叔醇、依蘭油烯、萜品醇等萜類化合物，烯萜類物質為茉莉花香氣中最多的一大類。dxp（1脫氧d木酮糖5二磷酸）途徑是1條類萜物質前體合成途徑，提供萜類物質生物合成的基本骨架異戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，ipp）和二甲基烯丙基焦磷酸（dimethy lallyl diphosphate，dmapp）。dxs（5磷酸脫氧木酮糖合成酶）在該途徑中以丙酮酸和磷酸甘油醛為底物，生成dxp，是該途徑中第1個限速酶，是萜類物質代謝工程的重要靶點（e

12、stévez et al.，2001；潘夕春 等，2007），對茉莉花萜烯類物質的形成具有重要作用。 dxs最早從大腸桿菌中分離出來（sprenger et al.，1997），在植物中最早得到dxs的是擬南芥arabidopsis thaliana和胡椒薄荷mentha piperita（lange et al.，1998），隨后又從番茄solanum lycopersicum（lois et al.，2000）、甜葉菊stevia rebaudiana（totté et al.，2003）、菊花chrysanthemum morifolium（kishimoto &am

13、p; ohmiya，2006）、橡膠hevea brasiliensis（seetang-nun et al.，2008）、陽春砂amomum villosum（yang et al.，2012）等多種植物中克隆到，muñoz-bertomeu等（2006）將擬南芥dxs轉入薰衣草（lavandula angustifolia）后，其單萜烯精油的含量顯著提高，子一代仍然具有轉基因親本的特性，且形態(tài)和生長習性等均無變化。 本研究中以開放的雙瓣茉莉花瓣為材料，采用rt-pcr和race技術，分離得到jsdxs全長cdna，對該基因進行生物信息學分析，找出jsdxs的功能結構域。采用染色體

14、步移技術，分離jsdxs上游的啟動子序列，發(fā)現啟動子中含有多個與生物鐘相關等順式作用元件。采用熒光定量pcr技術，分析jsdxs在花不同發(fā)育時期的表達模式，為將來深入研究jsdxs在茉莉花香氣釋放中的功能奠定基礎，以期為生產上調控茉莉花香強度和釋香時間提供理論依據。 1 材料與方法 1.1 茉莉花瓣總rna及茉莉花基因組dna的提取 茉莉花供試材料為雙瓣茉莉花，于2012年6月取自福建農林大學茉莉花種質資源圃。 采用改良ctab法提取茉莉花瓣總rna（鄭鴻昌，2012）；采用biospin植物基因組dna提取試劑盒（杭州博日科技有限公司cat#bsc13s1）提取茉莉花基因組dna。 1238

15、 園 藝 學 報 41卷 1.2 jsdxs保守區(qū)、5race、3race及全長orf的pcr擴增 以茉莉花總rna為模板，參考鄭鴻昌（2012）的方法，合成雙鏈cdna，于20 保存?zhèn)溆谩８鶕褕蟮赖挠烷蠙欤╫lea europaea）、丹參（salvia miltiorrhiza）、連翹（forsythia suspense）、金魚草（antirrhinum majus）等dxs基因序列，用dnaman設計出保守區(qū)簡并引物。dxs-r：5-tggga(t/c)gt(c/t)gg(t/c)ca(c/t)cag(g/t)(c/t)-3；dxs-f：5-gc(t/c)tc(g/a)tc(a/t)

16、ga (a/t)ggagccat-3。pcr擴增體系：2.5 µl 10× ex-taq，buffer（mg2+ plus），4 µl dntps（2.5 mmol · l-1），1 µl模板，0.5 µl dxs-r，0.5 µl dxs-f，0.2 µl ex-taq酶（5 u · µl-1），補ddh2o至25 µl體系。95 預變性5 min，95 變性30 s，53 退火45 s，72 延伸90 s，35個循環(huán)，最后72 延伸10 min進行pcr擴增。根據保守區(qū)克隆結果分別

17、設計特異性5race和3race引物（primer premier 5軟件）。5-dxs：5-agtagttcgtgtatgactgagttggtgc-3；3-dxs：5-catgcaaagggcttatgaccaggtagtgc-3。將保守區(qū)pcr體系中引物改為0.5 µl 5-dxs/3-dxs，0.25 µl接頭引物l4m，并補ddh2o至25 µl，并將保守區(qū)pcr擴增程序中的退火溫度提高至55 進行pcr擴增。將獲得的全長cdna，在其orf兩端設計特異引物（qdxs-r：5-atggctctctgtacatatgcatgtc-3；qdxs-f：5-tt

18、atacaattgttacacccccggtc-3）擴增全長序列。 1.3 jsdxs啟動子的分離 依據加拿大bio s & t inc的genome walking kit試劑盒，從起始密碼子下游200 bp內設計3條巢式引物（primer premier 5.0軟件）。dxs-a：5-gtgagtgatactctgctctttccgacaagg-3；dxs-b：5-ccctgctgccctctttcttacctgctta-3；dxs-c：5-aaacccactgtcttgctcaa attcccag-3。以茉莉花基因組dna為模板，參照試劑盒說明書，以巢式引物和試劑盒配套引物進行3

19、輪pcr擴增。 1.4 pcr產物純化回收及克隆 將1.2和1.3所得pcr產物純化回收并克隆至pmd18-t載體（takara），16 連接過夜后進行轉化測序（北京六合華大基因有限公司）。 1.5 序列分析 jsdxs基因序列通過在線ncbi的blast功能進行氨基酸序列同源性比較；通過protparam軟件對基因的分子量、等電點進行預測，初步分析目的基因的功能；通過signalp 4.1進行信號肽預測；通過protcomp version 9.0進行亞細胞定位預測；通過tmpred進行蛋白質跨膜結構的預測；通過在線sopma預測蛋白質二級結構。 啟動子序列通過在線plantcare（htt

20、p：/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）及place軟件（http：/www.dna.affrc.go.jp/place/signalscan.html）預測其順式作用元件（劉志欽 等，2013）。 1.6 熒光定量pcr表達分析 分別提取18：00、20：00、22：00、0：00、2：00時的茉莉花瓣總rna，用逆轉錄試劑盒（takara）反轉錄成cdna，稀釋10倍作模板。以茉莉花actin基因為內參（actin：5-cactgctgagcggg aaattgt-3，actin：5-gatcctccaatccagac

21、actgt-3）（歐雪鳳，2012）。運用primer premier 5.0軟件，按照熒光定量pcr引物設計原則，設計熒光定量pcr引物（rtdxs-r：5-gttgctgtaa 6期 孫 君等：茉莉花香氣相關基因jsdxs及其啟動子的克隆與表達分析 1239 taggcgatggtg-3，rtdxs-f：5-cctgttggactgtaatctgctaag-3）。參照sybr prime scripttm rt-pcr kit（takara）說明書，進行熒光定量pcr擴增體系：cdna模板1 µl，2×sybr premix ex-taqtm 5 µl，上下游

22、引物（10 µmol · l-1）各0.2 µl，用rnase-free h2o補足至10 µl。95 預變性30 s，95 變性5 s，60 復性34 s，共40個循環(huán)。每份樣品設3次重復。 試驗數據應用microsoft excel 2003軟件，采用2-ct法計算其相對表達量；應用spss軟件對結果進行差異顯著性分析。應用microsoft excel 2003軟件作柱狀圖。 2 結果與分析 2.1 jsdxs克隆及序列分析 茉莉花瓣總rna，28s與18s亮度比約為21，總rna較完整，可進行rt-pcr擴增等后續(xù)試驗。通過rt-pcr和race

23、技術得到保守區(qū)pcr產物、5race和3race的pcr產物，最終克隆得到保守區(qū)1 181 bp、5race片段1 411 bp和3race片段883 bp。利用特異性引物擴增其orf，測序后其精確長度為2 145 bp（圖1）。 圖1 茉莉花總rna及從茉莉花中分離的jsdxs電泳圖 m：marker dl2000；1：總rna電泳圖；2：保守區(qū)擴增產物；3：5race擴增產物；4：3race擴增產物； 5：jsdxs orf全長擴增產物；6：jsdxs啟動子擴增產物。 fig. 1 result of rna and amplification product of jsdxs from

24、jasminum sambac m：marker dl2000；1：result of rna；2：amplification product of conserved region；3：amplification product of 5race； 4：amplification product of 3race；5：full-length amplification product of jsdxs orf； 6：the promoter product of jsdxs . 將保守區(qū)、5race和3race序列拼接，得到茉莉花dxs基因cdna全長2 505 bp（圖2），包含1個完整的

25、閱讀框（232 2 380 bp），編碼714個氨基酸，該基因含有起始密碼子atg、終止密碼子taa、16個a的poly a尾巴和aataaa加尾信號，并含有保守功能結構域tpp-dxs、tpp-pyr-dxs-tk-like及transketolase-c。其相對分子量：76 768.0，分子式：c3396h5412n950o1010s33，等電點：7.08，不穩(wěn)定系數：39.28，屬于穩(wěn)定蛋白；帶負電氨基酸總和（asp + glu）：73，帶正電氨基酸總和（arg + lys）：72；脂溶指數：90.90。其蛋白質二級結構中38.74%為螺旋，14.97%為延伸鏈，7.13%為轉角，39.

26、16%為無規(guī)則卷曲。無信號肽，亞細胞定位在細胞質，其蛋白質無跨膜結構。 與其他植物氨基酸序列同源性為：丹參（salvia miltiorrhiza）88%，橡膠樹（hevea brasiliensis）87%、穿心蓮（andrographis paniculata）87%、杜仲（eucommia ulmoides）87%、可可（theobroma cacao）86%、陽春砂（amomum villosum）86%、檄樹（morinda citrifolia）72%、甜葉菊（stevia rebaudiana）72%、歐洲云杉（picea abies）71%。 1240 園 藝 學 報 41卷

27、圖2 jsdxs基因的核苷酸序列及推導的氨基酸序列 atg：起始密碼子；taa：終止密碼子；aataaa：聚腺苷酸化加尾信號；tpp-dxs、tpp-pyr-dxs-tk-like、transketolase-c：保守域。 fig. 2 nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the jsdxs atg：start anticodon；taa：terminate anticodon；aataaa：the polyadenylation signal； tpp-dxs，tpp-pyr-dxs-tk-like，transketo

28、lase-c：conserved domain. 2.2 啟動子分離及順式作用元件分析 將啟動子pcr擴增產物（圖1）克隆測序，得到上游啟動子調控序列745 bp（圖3），含有與茉莉酮酸酯相關元件t/gboxatpin2，脫落酸相關元件abre，生物鐘相關元件ciacadianlelhc，低溫相關元件mycconsensusat，熱激相關元件hse，光響應相關元件gatabox、sorlip1at、tct-motif，水楊酸相關元件tca-element，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶相關元件cactftppca1，花粉特異性相關元件pollen1lelat52，胚乳表達相關元件skn-1 motif等

29、。 6期 孫 君等：茉莉花香氣相關基因jsdxs及其啟動子的克隆與表達分析 1241 圖4 茉莉花開放過程中jsdxs基因表達分析 不同字母代表不同時刻間存在顯著差異（p < 0.05）。 fig. 4 express analysis of jsdxs during blooming the results with same letters are not significantly different at p < 0.05 according to duncans multiple-range test. 圖3 茉莉花dxs基因啟動子序列及部分順式作用元件 abre：脫落酸

30、相關元件；cactftppca1：參與磷酸烯醇丙酮酸羧化酶反應；ciacadianlelhc：生物鐘相關元件；gatabox、sorlip1at、tct-motif：光響應相關元件；hse：熱激相關元件；iboxcore、rebetalglhcb2i：光敏色素調節(jié)元件；mycconsensusat：低溫相關元件；pollen1lelat52：花粉特異性相關元件；skn-1 motif：胚乳表達相關元件；tca-element：水楊酸相關元件； t/gboxatpin2：參與茉莉酮酸酯反應相關元件。 fig. 3 the promoter sequence of jsdxs and partia

31、l cis-acting elements abre：involved in the abscisic acid responsiveness；cactftppca1：involved in phosphoenolpyruvate carboxylase responsiveness；ciacadianlelhc：necessary for circadian expression；gatabox，sorlip1at，tct-motif：related to light； hse：involved in heat stress responsiveness；iboxcore，rebetalgl

32、hcb2i：involved in phytochrome regulation； mycconsensusat：related to cold；pollen1lelat52：responsible for pollen specific activation； skn-1 motif：required for endosperm expression；tca-element：involved in salicylic acid responsiveness； t/gboxatpin2：play a key role in jasmonate signaling. 2.3 相對熒光定量pcr表

33、達分析 以茉莉花actin為內參，采用實時熒光定量pcr對茉莉花開放過程中jsdxs的表達進行了分析，結果（圖4）表明，其表達量在18：00時較低，隨著時間的推移，呈現上調趨勢，在22：00時達到最高，隨后呈現下調趨勢，在2：00時最低。 3 討論 dxs是dxp途徑的第一個酶，也是第一個關鍵酶。研究表明，超量表達dxs可提高單萜化合物、類胡蘿卜素、萜類化合物和萜類吲1242 園 藝 學 報 41卷 哚生物堿的含量（bouvier et al.，1998；chahed et al.，2000；lois et al.，2000）。本試驗中克隆得到茉莉花jsdxs全長cdna 2 505 bp，與

34、同屬植物丹參相似度最高為88%，與其他植物如橡膠樹（87%）、穿心蓮（87%）、杜仲（87%）、可可（86%）、陽春砂（86%）也有很高的同源性，與檄樹（72%），甜葉菊（72%），歐洲云杉（71%）同源性的也較高。jsdxs含有功能保守域tpp-dxs、tpp-pyr-dxs- tk-like、transketolase-c，其中transketolase-c認為是分子調控結合位點（lindqvist et al.，1992；nikkola et al.，1994），說明dxs在長期進化中較保守。前人對dxs表達模式的研究多以不同組織器官（空間）為對象，其表達的節(jié)律性（時間）還鮮有報道。本研

35、究中得出茉莉花瓣jsdxs的表達量在18：00時較低，隨著時間的推移，呈現上調趨勢，在22：00時達到最高，隨后出現下調趨勢，在2：00時最低。在整個花開放的過程中，jsdxs表達與茉莉花香強度呈現一定的關聯，與李鶴（2012）報道的雙瓣茉莉花萜烯類香氣物質在17：0003：00這個時間段內所表現的趨勢相一致，與茉莉花香相關cds和hpl基因的表達模式（歐雪鳳，2012）也一致。 本研究中利用染色體步移方法分離得到jsdxs上游調控序列，其包含多個與茉莉生長發(fā)育及開花密切相關的順式作用元件。其中，t/gboxatpin2（boter et al.，2004）與茉莉酮酸酯相關，而茉莉酮酸酯類，包

36、括茉莉酮酸（jasmonic acid，ja）和它的甲基酯（methyl jasmonate，meja）是許多花和果實中芳香物質的成分之一（薛炳燁和姚勝蕊，1999）。王鑫威等（2011）、魏潔書等（2013）對雨生紅球藻及陽春砂dxs的研究表明meja對dxs表達有促進作用，茉莉酮酸酯與dxs及茉莉花開花的相關性還需進一步深入研究探討。茉莉花屬于夜晚開花植物，dxs上游調控序列中發(fā)現的與生物鐘相關元件ciacadianlelhc（piechulla et al.，1998）及低溫相關元件mycconsensusat（chinnusamy et al.，2003；lee et al.，2005

37、）可能誘導茉莉花在低溫的夜晚開花。此外，該啟動子還含有與光響應相關元件gatabox、sorlip1at（hudson & quail，2003；jiao et al.，2005），光敏色素調節(jié)元件iboxcore（terzaghi & cashmore，1995）、rebetalglhcb2i（degenhardt & tobin，1996）等，其具體與茉莉花開花及香氣物質合成相關的元件還需進一步通過點突變來驗證。jsdxs是否調控茉莉花開花及花香物質合成還需對該基因進行轉基因功能鑒定，構建啟動子缺失載體和啟動子表達載體來研究啟動子核心元件和組織表達部位。 refer

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