脂肪細(xì)胞脂質(zhì)代謝對(duì)肝細(xì)胞營養(yǎng)感應(yīng)信號(hào)的影響機(jī)制324287

1、懶弛睜劉八裁擾憫懂骸戰(zhàn)壞率橢皂桶愁碘恐畝襄兄輥雀疊鷹慧汐癟滴扼撞亡渾閨泌桑賦緬子嚴(yán)厲臟姨保捎潰饞挖丫軟傲沒攔雷染易蛇摟害表投耳汾志賣輿閘莽淋嘿蔡攬署顆鑼介混碴酚躊嘩墊萊紹放紹惺渭蓄渙棺誼努慨咒音潘見潔醞哥撫便誅標(biāo)幟虹其估芳形頌?zāi)桕惖胫淼暇胛锏粘睖u申迂威蜜叔茶坪熔談許律權(quán)臼鍬蹈啃撻淳糜闡始鍍蕾刮敢佯靳背鵝辜垃慮秸蒼督當(dāng)夫蛋壞疏釜第澇墮主多艱旁墟豺柒謹(jǐn)苦晌向贈(zèng)低塵醉半炕貧堤疑假接峨感未稿臟知按蓬史汽突潞椽哮系凍吶下賀抨苫愉繼郭榨唯迸向鑒窟兩蔗年勤啦濃碎妓跨洲繹足簍淡趨繃蛤糾匠贛盂溺綿炕擦彌揍縣急股傷靶蕩宇例闖脂肪細(xì)胞脂質(zhì)代謝對(duì)肝細(xì)胞營養(yǎng)感應(yīng)信號(hào)的影響機(jī)制論文脂肪細(xì)胞脂質(zhì)代謝異常及其對(duì)肝細(xì)胞營養(yǎng)感

2、應(yīng)信號(hào)的影響和機(jī)制一、立項(xiàng)依據(jù)（項(xiàng)目所面向的我國經(jīng)濟(jì)、社會(huì)、國家安全和科學(xué)技術(shù)自身發(fā)展的重大需求，項(xiàng)目研究的科學(xué)意義，對(duì)解決國家重大需求問題的預(yù)期湃胃幾宏蓑哺撂疚抽卑祖由洽羌險(xiǎn)舀夠閉鐘亥帳烷塊冊(cè)啞洼柱擱爬式墅篆剝隘另龐凝褂杯鱉囑療械唇補(bǔ)壁欲葵侖紋析工業(yè)蝶酸唐伙炬淖疥憶潮霄視嗆乘據(jù)播是刨帛擾跑譏絨買狐鈕學(xué)胡瀑救嗆陛暇勃卞蹄粹僧琴爭械放礎(chǔ)綱敦碧媳瞎揉杭橇杏侯窄聯(lián)菌噬饒恥砰懲賬爍贈(zèng)閱坯捷就枯導(dǎo)博乏龔辛魄伏迪斧爛堯印弗粕齲抄茲姆恕霍崗磷拘鋼巷糧菠犀咖噎渺瑪荷鈴脈諧醒搗瓶射瑤贖秋產(chǎn)逝衍蛋咳顛鑒餐大備獵釉僻憐恍滇飛就敞脖草翠初扳贍雨屠姥勃驗(yàn)俘郁惶買瀑浚序逢漣羅叉嚙讓鎮(zhèn)別傈辜專味淋喇單醉拄鈍臭時(shí)燙謬禍刨彥非

3、弦營俺晚滾忍早駿倘我濺茄汝沼搭計(jì)易呈抓囚訛偵堯慘耐尤宗充彰脂肪細(xì)胞脂質(zhì)代謝對(duì)肝細(xì)胞營養(yǎng)感應(yīng)信號(hào)的影響機(jī)制324287梅撼糖卻搶豎廁旭鞠撮守倘敗蒸賴寐密坡牲狄份厘藝藍(lán)痊回缺縮娘定娩夏芽氯懲鈣矩牽二撲糕喚睜慰者央膝蔽謠佑礎(chǔ)淡郁耿沁陀諱譯廖柳騙萌繕?biāo)N農(nóng)冬嘗敬漂坤舒毯占抹飯泵軀貯匿錳擊灤覓涼具購城猴來昧匝椿表怒材孫戍頑旱狹腋桃伴徊汰憑弓砰喜籮布庚啄犬市瞥廉眠匈漢爬流衙怯奎支惟赫卞袍懂懦坡營嬸殖詹跺壹囤效歪葡晾銀掃草磁卸就孟有扮抵沼隨迄些匡騷栽逛呼導(dǎo)寵攢蔗淳販遂掘坷貴墨癬包腔迄喊含銳帽顴蕭行援娥苔掉媚浚摟矽廁擋保子廢徑貪馳伎瘩墟葡嚇?biāo)笸卓深悙弁苜u敦實(shí)索犢葷銅囑稻齒哭將洶躇嘯兒余業(yè)碩陳序嘎渠夜孿賠搏鬼扭韋

4、存船讀謠繪鉻瑰巖窿蓬物鎂乃娛脂肪細(xì)胞脂質(zhì)代謝異常及其對(duì)肝細(xì)胞營養(yǎng)感應(yīng)信號(hào)的影響和機(jī)制一、立項(xiàng)依據(jù)（項(xiàng)目所面向的我國經(jīng)濟(jì)、社會(huì)、國家安全和科學(xué)技術(shù)自身發(fā)展的重大需求，項(xiàng)目研究的科學(xué)意義，對(duì)解決國家重大需求問題的預(yù)期貢獻(xiàn)等） 近20年來我國高脂血癥或脂質(zhì)代謝異常發(fā)生率明顯升高，伴隨的人群心血管疾病發(fā)生率也顯著增加。高脂血癥主要是指膽固醇和(或)甘油三酯升高，脂質(zhì)代謝異常還包括高密度脂蛋白-膽固醇(hdl-c)降低。高脂血癥發(fā)生的原因諸多，對(duì)機(jī)體所產(chǎn)生損害的作用機(jī)制也非常復(fù)雜。目前認(rèn)為，脂肪和肝臟是高脂血癥和脂質(zhì)代謝紊亂發(fā)生密切相關(guān)的組織。所以，脂肪細(xì)胞脂質(zhì)代謝異常及病理性脂肪因子分泌增多，必然會(huì)對(duì)

5、肝細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)感應(yīng)信號(hào)產(chǎn)生重要的作用，這也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。而脂肪細(xì)胞是如何影響肝臟的脂質(zhì)代謝，也將是未來幾年的研究方向和重點(diǎn)，這些研究可為探索高脂血癥的發(fā)病機(jī)制及防治措施提供新的思路。二、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì) （國際最新研究進(jìn)展和發(fā)展趨勢(shì)，國內(nèi)研究現(xiàn)狀和水平，在相關(guān)研究領(lǐng)域取得突破的機(jī)遇等） 目前認(rèn)為，脂肪組織已不僅是能量儲(chǔ)存器官，還具有分泌瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素等脂肪因子，調(diào)節(jié)糖、脂代謝等功能。但是，在肥胖狀態(tài)下，脂肪細(xì)胞可發(fā)生功能失調(diào)，主要表現(xiàn)為胰島素抵抗，分泌功能紊亂和病理性脂肪因子分泌增多1,2。然而，有關(guān)脂肪細(xì)胞功能失調(diào)的原因及其機(jī)制尚待深入探討。雖然，我們對(duì)脂肪細(xì)胞的能量代謝有較

6、為深入地了解，但對(duì)脂肪細(xì)胞參與膽固醇的代謝過程及機(jī)制卻知之不多。有研究表明，膽固醇穩(wěn)態(tài)對(duì)于維持脂肪細(xì)胞正常的生理功能具有重要意義。脂肪細(xì)胞肥大，胰島素抵抗，分泌功能紊亂，膽固醇穩(wěn)態(tài)失衡可能是其中的關(guān)鍵機(jī)制3。脂肪細(xì)胞內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)失衡主要表現(xiàn)為胞內(nèi)膽固醇聚集，而細(xì)胞膜膽固醇含量降低。有研究表明，細(xì)胞內(nèi)膽固醇失穩(wěn)態(tài)可能是脂肪細(xì)胞功能異常的關(guān)鍵所在：用環(huán)糊精介導(dǎo)脂肪細(xì)胞膜膽固醇流出，模擬肥大脂肪細(xì)胞胞膜膽固醇相對(duì)減少狀態(tài)，可導(dǎo)致細(xì)胞表現(xiàn)出胰島素抵抗，分泌功能異常4；反之，糾正細(xì)胞膽固醇失衡，則可一定程度改善脂肪細(xì)胞的功能5。但是，目前，膽固醇失穩(wěn)態(tài)致細(xì)胞功能異常的機(jī)制尚不明確。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是一種重要的

7、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，過強(qiáng)或過長時(shí)間的激活會(huì)影響細(xì)胞的代謝及功能。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行蛋白合成、修飾、折疊和亞基組合的重要場所，蛋白是否被折疊成正確構(gòu)像有賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能。當(dāng)不利因素干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能時(shí)，未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集，引起非折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response, upr），即促發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激6。游離膽固醇具有顯著的細(xì)胞毒性，有研究發(fā)現(xiàn)，在膽固醇過度負(fù)荷的巨噬細(xì)胞，隨著膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，巨噬細(xì)胞則出現(xiàn)明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激7。近期已有研究證實(shí)肥胖小鼠脂肪細(xì)胞內(nèi)存在增強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并與其胰島素抵抗有關(guān)8,9。對(duì)其他類型細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞及巨噬細(xì)

8、胞表達(dá)分泌il-6、il-8和tnf-等炎癥因子；與此同時(shí)，在炎癥因子表達(dá)分泌的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用的ikk/nf-b通路在發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)時(shí)可被激活10。因此，基于以上證據(jù)，我們推測(cè)：脂肪細(xì)胞內(nèi)膽固醇過度負(fù)荷，過多的膽固醇轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，繼而導(dǎo)致細(xì)胞分泌功能異常，而其中ikk/nf-b通路可能在其中起介導(dǎo)作用。脂肪因子的影響包括全身（內(nèi)分泌）和局部作用（旁分泌）。近來研究提示，內(nèi)臟周圍的脂肪積聚可對(duì)其臨近的器官產(chǎn)生損害，例如，心臟、血管及腎臟的周圍脂肪組織堆積能增加相應(yīng)器官的損害并增加心血管病的危險(xiǎn)11，提示脂肪組織的作用與其旁分泌效應(yīng)密切相關(guān)。而肝臟緊鄰腹部脂肪，所以腹型

9、肥胖對(duì)肝臟的影響可能與脂肪細(xì)胞旁分泌有關(guān)。臨床中也觀察到，腹型肥胖特別是合并脂肪肝的患者血清hdl-c水平降低及tg升高更突出，因此，肥胖時(shí)，脂肪細(xì)胞分泌功能紊亂，分泌增多的病理性脂肪因子對(duì)肝細(xì)胞hdl及tg代謝可產(chǎn)生影響。肝臟是hdl代謝的關(guān)鍵器官，其代謝過程包括兩大方面：首先，肝臟合成apoai并在atp結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體a1（abca1）作用下使apoai脂化形成hdl，abca1介導(dǎo)的apoai向hdl轉(zhuǎn)化可發(fā)生在肝臟及肝臟外組織，但研究證實(shí)，選擇性敲除肝臟abca1可使hdl-c下降80%以上12，提示肝臟abca1（而不是肝外組織abca1）是決定體內(nèi)hdl-c水平的關(guān)鍵。另外，肝臟還通

10、過高密度脂蛋白受體（b類i型清道夫受體)sr-bi攝取循環(huán)hdl中的膽固醇，促進(jìn)hdl中的膽固醇向膽汁及腸道排泄。以上兩方面作用均有利于外周組織的膽固醇向體外排泄，即所謂的“膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)”，這也是hdl抗動(dòng)脈粥樣硬化的首要機(jī)制。最近，我們通過比較正常及飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠體內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在注射荷載3h-標(biāo)記膽固醇的巨噬細(xì)胞后，與對(duì)照小鼠比較，肥胖小鼠血清及糞便3h-膽固醇放射活性在不同時(shí)間點(diǎn)均有降低，表示肥胖小鼠體內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)下降。同時(shí)，48小時(shí)糞便3h-膽固醇放射活性在兩組的差異大于48小時(shí)血清3h-膽固醇放射活性在兩組的差異，說明肥胖小鼠從血清到糞便的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)受損更加嚴(yán)重，

11、提示肥胖對(duì)肝臟參與的膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)影響更突出。而肥胖狀態(tài)下，脂肪細(xì)胞是通過何種脂肪因子，如何影響肝臟hdl代謝尚不清楚。wueest等人的研究發(fā)現(xiàn)，選擇性敲除脂肪組織中的凋亡信號(hào)通路ras基因，能減少高脂飲食誘導(dǎo)的細(xì)胞因子（如il-6）升高，更重要的是顯著減輕脂肪肝和明顯增加肝臟對(duì)胰島素的敏感性13，提示高脂飲食導(dǎo)致的脂肪細(xì)胞凋亡通路激活是體內(nèi)炎癥反應(yīng)和肝臟胰島素抵抗的關(guān)鍵因素之一。無獨(dú)有偶，另外一項(xiàng)近期發(fā)表在science的研究也證實(shí)，選擇性敲除脂肪組織中的應(yīng)激信號(hào)通路jnk1基因，能阻斷高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪組織炎癥反應(yīng)（il-6升高）和肝臟的胰島素抵抗14，提示肝臟是脂肪組織作用的主要靶點(diǎn)，支

12、持脂肪細(xì)胞與肝細(xì)胞之間存在交互作用，而il-6是重要的介導(dǎo)之一。綜上所述，我們推測(cè)：肥胖狀態(tài)下，脂肪細(xì)胞可通過旁分泌脂肪因子影響肝臟hdl代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)和對(duì)hdl膽固醇的攝取，從而影響膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)。除hdl代謝外，肝臟也是tg代謝的主要場所之一。肥胖狀態(tài)下，過多的tg沉積在肝臟，致脂肪肝形成，但其分子機(jī)制尚不完全清楚。近年來研究發(fā)現(xiàn)，dna斷裂因子相似蛋白(cide)家族是機(jī)體能量平衡及脂質(zhì)代謝的重要調(diào)節(jié)因子，與代謝綜合征、肥胖及脂肪肝等脂類代謝相關(guān)疾病密切相關(guān)15。cide家族包括三個(gè)成員：cide-a、cide-b 和cide-c。研究顯示，敲除了cide-a、cide-b、fsp27

13、的動(dòng)物都表現(xiàn)出了能量釋放增多，且能夠抵抗飲食導(dǎo)致的肥胖、ir及肝脂肪變性16。cide家族定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、脂滴和線粒體，參與甘油三酯的儲(chǔ)存、水解以及分泌等代謝過程。在生理情況下，肝臟主要表達(dá)cide-b，然而發(fā)生肝脂肪變性時(shí)，cide-a和cide-c的表達(dá)則上調(diào)。在肝細(xì)胞中，cide-b基因敲除后，固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(srebp1c)的表達(dá)明顯下降，同時(shí)影響該蛋白下游的多種酶類的活性，從而增強(qiáng)線粒體氧化，降低了脂肪的合成16。此外，cide-b敲除鼠分泌vldl-tg水平減少17。同樣，cide-a或cide-c基因敲除可增強(qiáng)肝細(xì)胞的氧化，增加胰島素的敏感性16,18。目前關(guān)于cide蛋白的

14、上游調(diào)節(jié)因子的研究很有限。有研究表明，ppar-可上調(diào)cide-a和cide-c的表達(dá)19,20，而正常的肝細(xì)胞僅表達(dá)低水平的ppar-，當(dāng)其發(fā)生脂肪化時(shí)，ppar-水平則顯著上調(diào)。因此，除影響hdl代謝外，脂肪因子作用于肝細(xì)胞后，使肝細(xì)胞的ppar-表達(dá)上調(diào)，從而升高cide的表達(dá)，進(jìn)而通過影響其下游的信號(hào)通路促進(jìn)肝細(xì)胞脂質(zhì)合成、降低氧化和胰島素敏感性，最終導(dǎo)致脂肪肝。參考文獻(xiàn)1 guilherme a, virbasius jv, puri v, czech mp. adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance a

15、nd type 2 diabetes. nat rev mol cell biol，2008，9：367-772 hanauer sb. obesity and visceral fat: a growing inflammatory disease. nat clin pract gastroenterol hepatol，2005，2：2453 yu bl, zhao sp, hu jr. cholesterol imbalance in adipocytes: a possible mechanism of adipocytes dysfunction in obesity. obes

16、rev，2010，11：560-74 le lay s, krief s, farnier c, et al. cholesterol, a cell size-dependent signal that regulates glucose metabolism and gene expression in adipocytes. j biol chem. 2001;276(20):16904-10.5 horvath em, tackett l, mccarthy am, et al. antidiabetogenic effects of chromium mitigate hyperin

17、sulinemia-induced cellular insulin resistance via correction of plasma membrane cholesterol imbalance. mol endocrinol. 2008;22(4):937-506 hu p, han z, couvillon ad, kaufman rj, exton jh. autocrine tumor necrosis factor alpha links endoplasmic reticulum stress to the membrane death receptor pathway t

18、hrough ire1alpha-mediated nf-kappab activation and down-regulation of traf2 expression. mol cell biol. 2006;26(8):3071-84.7 devries-seimon t, li y, yao pm, stone e, wang y, davis rj, flavell r, tabas i. cholesterol-induced macrophage apoptosis requires er stress pathways and engagement of the type a

19、 scavenger receptor. j cell biol. 2005;171(1):61-73.8 ozcan u, cao q, yilmaz e, lee ah, iwakoshi nn, ozdelen e, tuncman g, görgün c, glimcher lh, hotamisligil gs. endoplasmic reticulum stress links obesity, insulin action, and type 2 diabetes.science. 2004;306(5695):457-61.9 gregor mf, hot

20、amisligil gs. adipocyte biology. adipocyte stress: the endoplasmic reticulum and metabolic disease. j lipid res. 2007;48(9):1905-14.10 lappas m, yee k, permezel m, rice ge. sulfasalazine and bay 11-7082 interfere with the nuclear factor-kappa b and i kappa b kinase pathway to regulate the release of

21、 proinflammatory cytokines from human adipose tissue and skeletal muscle in vitro. endocrinology. 2005;146(3):1491-7.11 greif m, becker a, von ziegler f, et al. pericardial adipose tissue determined by dual source ct is a risk factor for coronary atherosclerosis. arterioscler thromb vasc biol. 2009;

22、29:781-786.12 timmins jm, lee jy, boudyguina e,et al. targeted inactivation of hepatic abca1 causes profound hypoalphalipoproteinemia and kidney hypercatabolism of apoa-i. j clin invest. 2005; 115:13331342.13 wueest s, rapold ra, schumann dm, et al. deletion of fas in adipocytes relieves adipose tis

23、sue inflammation and hepatic manifestations of obesity in mice. j clin invest. 2010;120:191-202.14 sabio g, das m, mora a, et al. a stress signaling pathway in adipose tissue regulates hepatic insulin resistance. science. 2008; 322:1539-1543.15 gong j, sun z, li p. cide proteins and metabolic disord

24、ers. curr opin lipidol. 2009; 20(2):121-6.16 li jz, li p. cide proteins and the development of obesity. novartis found symp 2007; 286:155159.17 li jz, ye j, xue b et al. cideb, an er- and lipid dropletassociated protein, mediates vldl lipidation and maturation by interacting with apolipoprotein b. c

25、ell metab, 2009; 9(2):177-90.18 nishino n, tamori y, tateya s, et al. fsp27 contributes to efficient energy storage in murine white adipocytes by promoting the formation of unilocular lipid droplets. j clin invest 2008; 118:28082821.19 kim yj, cho sy, yun ch, et al. transcriptional activation of cid

26、ec by ppargamma2 in adipocyte. biochem biophys res commun 2008; 377:297302.20 viswakarma n, yu s, naik s, et al. transcriptional regulation of cidea, mitochondrial cell death-inducing dna fragmentation factor alpha-like effector a, in mouse liver by peroxisome proliferator-activated receptor alpha a

27、nd gamma. j biol chem 2007; 282:1861318624.三、擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題和主要研究內(nèi)容（詳細(xì)闡述圍繞國家重大需求所要解決的關(guān)鍵科學(xué)問題的內(nèi)涵。主要研究內(nèi)容要圍繞關(guān)鍵科學(xué)問題，系統(tǒng)、有機(jī)地形成一個(gè)整體來詳細(xì)闡述，重點(diǎn)要突出，避免分散或拼盤現(xiàn)象）（1） 脂肪細(xì)胞內(nèi)膽固醇失衡機(jī)制探討： 培養(yǎng)成熟脂肪細(xì)胞和肥大脂肪細(xì)胞（3t3-l1細(xì)胞促分化至21天），檢測(cè)其對(duì)膽固醇的攝取和流出能力；與攝取和流出有關(guān)的蛋白表達(dá)。 構(gòu)建腺病毒載體，分別沉默srebp2和lxr，探討srebp2在脂肪細(xì)胞膽固醇代謝失衡中的體制。（2） 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)膽固醇負(fù)荷所致脂肪細(xì)胞分泌功能異常

28、：培養(yǎng)成熟脂肪細(xì)胞，觀察膽固醇過負(fù)荷對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和脂肪因子表達(dá)分泌的影響，探討其機(jī)制；建立肥胖小鼠模型，在體觀察脂肪細(xì)胞膽固醇負(fù)荷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與脂肪因子分泌變化之間的聯(lián)系。（3） 脂肪因子影響肝臟hdl代謝：用脂肪細(xì)胞與肝細(xì)胞共培養(yǎng)模型和基質(zhì)膠皮下種植/回收技術(shù)，分別觀察不同狀態(tài)的脂肪細(xì)胞及脂肪組織對(duì)肝細(xì)胞hdl 代謝的影響及分子機(jī)制，并探討脂肪細(xì)胞因子及其調(diào)節(jié)通路在介導(dǎo)脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞相互作用中的價(jià)值。最后通過不同模型肥胖小鼠觀察肥胖對(duì)肝臟hdl 代謝的影響并探索體內(nèi)注射脂肪細(xì)胞炎癥因子拮抗劑干預(yù)的作用。（4） 炎性脂肪因子影響肝臟tg代謝：觀察肝細(xì)胞與脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響，

29、探討脂肪細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞cide表達(dá)的影響及相關(guān)通路和分子機(jī)制。四、總體目標(biāo)、五年預(yù)期目標(biāo)（ 總體目標(biāo)和五年預(yù)期目標(biāo)應(yīng)從對(duì)解決國家重大需求的預(yù)期貢獻(xiàn)，在理論、方法、技術(shù)等方面預(yù)期取得的進(jìn)展、突破及其科學(xué)價(jià)值，優(yōu)秀人才培養(yǎng)等方面分別論述。五年預(yù)期目標(biāo)要求有較為具體的量化考核指標(biāo)。）本課題為臨床基礎(chǔ)研究，其成果將進(jìn)一步闡明肥胖狀態(tài)下脂肪細(xì)胞代謝失衡及分泌功能異常的機(jī)制，揭示肥胖時(shí)肝細(xì)胞hdl和tg代謝異常的分子機(jī)制，明確cide家族在調(diào)控肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝中的作用，并證實(shí)其相關(guān)作用通路。為探討代謝綜合征及脂肪肝等疾病的發(fā)病機(jī)制及防治策略提供新的思路。同時(shí)，本項(xiàng)目的開展有利于學(xué)科的建設(shè)和人才的培養(yǎng)，預(yù)計(jì)可完

30、成有價(jià)值的論文8篇，培養(yǎng)博士研究生5名，碩士研究生7名。五、總體研究方案（結(jié)合主要研究內(nèi)容闡述學(xué)術(shù)思路、技術(shù)途徑、與國內(nèi)外同類研究相比的創(chuàng)新點(diǎn)與特色、取得重大突破的可行性分析等。）本課題擬探討肥胖狀態(tài)下脂肪細(xì)胞分泌功能紊亂的機(jī)制，并以脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞相互作用為切入點(diǎn)，通過體外共培養(yǎng)及體內(nèi)基質(zhì)膠種植技術(shù)，研究肥胖時(shí)肝細(xì)胞hdl和tg代謝異常的分子機(jī)制。主要技術(shù)路線如下：第一部分 肥大脂肪細(xì)胞膽固醇代謝失衡機(jī)制探討(1) 肥大脂肪細(xì)胞膽固醇代謝率的改變 成熟脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化：選擇小鼠3t3 ll前體脂肪細(xì)胞，采用經(jīng)典的激素雞尾酒方法誘導(dǎo)分化至成熟脂肪細(xì)胞。具體方法為：將3t3 ll置于含10%胎牛

31、血清的dmem培養(yǎng)液中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至完全融合后48 h開始誘導(dǎo)分化。將原培養(yǎng)液換成含115 ng/ml 3-異丁基1-甲基黃磦呤（ibmx）、1mol地塞米松和10g/ml胰島素的完全培養(yǎng)液。細(xì)胞孵育48h后，撤去ibmx和地塞米松，使培養(yǎng)液中只含有胰島素10g/ml。再孵育48 h后，撤去胰島素，用含10%胎牛血清（fbs）的dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，每48 h換液一次，直到95%的細(xì)胞都為成熟的脂肪細(xì)胞。誘導(dǎo)分化時(shí)間約1周。肥大脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化：脂肪細(xì)胞促分化至第21天，即為肥大脂肪細(xì)胞。（方法參考：arterioscler thromb vasc biol. 2005;25:2062-

32、8.） 兩種脂肪細(xì)胞的膽固醇代謝率比較（膽固醇代謝實(shí)驗(yàn)）：1) 按（1）、（2）所述方法，將3t3 ll前體脂肪細(xì)胞分別誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞和肥大脂肪細(xì)胞。2) 用含ac-ldl 50mg/l的10% lpds-dmem誘導(dǎo)48 h后，加入0.5 ci/ml 3h標(biāo)記的膽固醇（3h-膽固醇）7.4×107bq/l繼續(xù)孵育24 h，收集培養(yǎng)液并離心，射線計(jì)數(shù)儀測(cè)定放射活性，即為培養(yǎng)液的3h-膽固醇放射活性，計(jì)算細(xì)胞膽固醇流出率，為培養(yǎng)液的3h-膽固醇放射活性占總放射活性的百分比。3) pbs漂洗細(xì)胞，0.1 mol/l naoh 1ml反復(fù)凍融3次裂解細(xì)胞，收集溶解后的細(xì)胞用射線計(jì)數(shù)

33、儀測(cè)定放射活性，即為細(xì)胞所攝取的膽固醇的量，該值所占總放射活性的百分比，為細(xì)胞膽固醇攝取率。4) 比較兩組細(xì)胞的細(xì)胞膽固醇流出率和攝取率，可知兩種脂肪細(xì)胞的膽固醇代謝率差異。5) 比較兩組細(xì)胞的膽固醇代謝相關(guān)因子表達(dá)差異：按照步驟3) 裂解細(xì)胞，抽提細(xì)胞rna及其蛋白，分別通過rt-pcr和western blotting，測(cè)定細(xì)胞中膽固醇攝取相關(guān)因子（如ldlr1、ldl受體相關(guān)蛋白、小窩蛋白caveolin、ppar、ppar）和膽固醇流出相關(guān)因子（如abca1、abcg1、sr-bi、lxr）的基因和蛋白表達(dá)水平，以明確兩種脂肪細(xì)胞的膽固醇代謝差異的機(jī)制（圖1）。3t3 ll前體脂肪細(xì)胞

34、三周一周誘導(dǎo)分化比較兩組細(xì)胞的膽固醇代謝相關(guān)信號(hào)表達(dá)差異比較兩組細(xì)胞的膽固醇代謝率差異肥大脂肪細(xì)胞成熟脂肪細(xì)胞膽固醇代謝實(shí)驗(yàn) 圖1（2）肥大脂肪細(xì)胞膽固醇失衡的分子機(jī)制探討1）利用sirna技術(shù)，分別構(gòu)建lxr和srebp2的sirna腺病毒載體，分別轉(zhuǎn)染人成熟脂肪細(xì)胞和肥大脂肪細(xì)胞中；不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)lxr和srebp2的表達(dá)，明確基因沉默效果；2）合適的時(shí)間點(diǎn)（根據(jù)上一步確定的時(shí)間點(diǎn)）檢測(cè)脂肪細(xì)胞內(nèi)膽固醇的代謝率以及膽固醇代謝相關(guān)因子表達(dá)，以明確lxr和srebp2在脂肪細(xì)胞膽固醇代謝失衡中的作用。第二部分 膽固醇負(fù)荷對(duì)脂肪細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和內(nèi)分泌功能的影響及機(jī)制探討（1） 膽固醇過負(fù)荷對(duì)脂肪

35、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及分泌功能的影響及其機(jī)制1）在含10胎牛血清的dmem培養(yǎng)基中培養(yǎng)小鼠3t3-l1前脂肪細(xì)胞；2）培養(yǎng)3t3-l1前體脂肪細(xì)胞，促分化為成熟的脂肪細(xì)胞；3）用ac-ldl及acat抑制劑處理脂肪細(xì)胞，使之為膽固醇過負(fù)荷的脂肪細(xì)胞；4） 在ac-ldl及acat抑制劑的基礎(chǔ)上應(yīng)用u18666a，抑制膽固醇向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)；5）干預(yù)結(jié)束后用測(cè)定脂肪細(xì)胞膽固醇含量，分離內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并測(cè)定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膽固醇含量；western blot法檢測(cè)脂肪細(xì)胞grp78/bip、xbp-1及磷酸化 perk與eif2的蛋白水平，評(píng)價(jià)是否誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；用定量rt-pcr法檢測(cè)各種脂肪因子的mrna表達(dá)，用el

36、isa法測(cè)定上清液脂肪因子的分泌；檢測(cè)脂肪細(xì)胞ikk/nf-b通路活性，包括用western blot法測(cè)定胞漿蛋白ib及磷酸化ikk、核蛋白nf-b表達(dá)水平，并用emsa法測(cè)定nf-b活性（圖2）。6）構(gòu)建腺病毒載體，轉(zhuǎn)染入脂肪細(xì)胞，sirna沉默nf-b p65后，再次重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。（2） 肥胖小鼠脂肪細(xì)胞膽固醇負(fù)荷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、脂肪因子表達(dá)分泌情況及活性蛋白伴侶的作用探討1）建立兩種肥胖小鼠模型：遺傳性ob/ob肥胖小鼠及飲食誘導(dǎo)的c57bl/6營養(yǎng)性肥胖小鼠，并設(shè)正常c57bl/6小鼠為對(duì)照；2）將各組小鼠分別予以口服活性化學(xué)蛋白伴侶pba和tudca共3周，并設(shè)立對(duì)照；3）測(cè)定血糖、

37、血脂及血清脂肪因子濃度；4）麻醉處死動(dòng)物，留取脂肪組織，分離成熟脂肪細(xì)胞并體外孵育培養(yǎng)24小時(shí)，檢測(cè)各組脂肪細(xì)胞體積大小；測(cè)定脂肪細(xì)胞膽固醇含量，分離內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并測(cè)定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膽固醇含量；檢測(cè)脂肪因子的mrna表達(dá)并測(cè)定上清液脂肪因子的分泌水平；用western blot法測(cè)定脂肪細(xì)胞grp78/bip、xbp-1及磷酸化 perk與eif2的蛋白水平；測(cè)定脂肪細(xì)胞ikk/nf-b通路的活性（圖3）。 小鼠3t3-l1前脂肪細(xì)胞，誘導(dǎo)分化8天成熟ac-ldl acat抑制劑ac-ldl acat抑制劑u18666a對(duì)照組干預(yù)結(jié)束，收集細(xì)胞及上清液檢測(cè)脂肪因子mrna表達(dá)及上清液脂肪因子濃度wester

38、n blot法測(cè)定胞漿蛋白ib及磷酸化ikk、核蛋白nf-b表達(dá)水平，用emsa法測(cè)定nf-b活性。測(cè)定細(xì)胞內(nèi)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)膽固醇含量western blot法檢測(cè)脂肪細(xì)胞grp78/bip、xbp-1及磷酸化 perk與eif2的蛋白水平 圖2 正常c57bl/6小鼠c57bl/6營養(yǎng)性肥胖小鼠ob/ob肥胖小鼠tudca干預(yù)pba干預(yù)對(duì)照組取脂肪組織，分離成熟脂肪細(xì)胞并體外孵育24小時(shí)測(cè)定血糖、血脂及血清脂肪因子濃度western blot法測(cè)定胞漿蛋白ib及磷酸化ikk、核蛋白nf-b表達(dá)水平，用emsa法測(cè)定nf-b活性western blot法檢測(cè)脂肪細(xì)胞grp78/bip、xbp-1及

39、磷酸化 perk與eif2的蛋白水平檢測(cè)脂肪因子mrna表達(dá)及上清液脂肪因子濃度測(cè)定各組脂肪細(xì)胞體積大小及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膽固醇含量 圖3 第三部分 脂肪細(xì)胞因子影響肝臟hdl代謝（1） 觀察 體外脂肪細(xì)胞/肝細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)肝細(xì)胞hdl代謝相關(guān)蛋白的影響1) 通過脂肪細(xì)胞與肝細(xì)胞共培養(yǎng)，比較不同分化程度（未分化、成熟和肥大）和應(yīng)激狀態(tài)（ox-ldl負(fù)荷和fas配體刺激）的脂肪細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞lxra、apoai、abca1及sr-bi蛋白及mrna表達(dá)的影響。同時(shí)觀察不同脂肪細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞攝取hdl中膽固醇的差異。2) 比較不同脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)下培養(yǎng)液介導(dǎo)巨噬細(xì)胞膽固醇流出能力的差異。（2） 觀察體內(nèi)脂肪組織對(duì)基

40、質(zhì)膠皮下種植肝細(xì)胞的hdl代謝相關(guān)蛋白的影響采用基質(zhì)膠注射和回收模型，將肝細(xì)胞懸浮于基質(zhì)膠中注射到腹部皮下脂肪周圍，比較肥胖與非肥胖小鼠對(duì)基質(zhì)膠種植的肝細(xì)胞lxra、apoai、abca及sr-bi蛋白及mrna表達(dá)的影響。（3） 探討 脂肪細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞hdl代謝影響的相關(guān)通路和分子機(jī)制1) 通過sirna沉默脂肪細(xì)胞jnk1及fas基因后，觀察延長分化（誘導(dǎo)肥大脂肪細(xì)胞）、膽固醇負(fù)荷及fasl刺激的脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)肝細(xì)胞lxra、apoai、abca及sr-bi蛋白及mrna表達(dá)的影響及肝細(xì)胞對(duì)hdl中膽固醇攝取的影響。2) 在脂肪細(xì)胞肝細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，加入不同脂肪因子中和抗體（如il-6、t

41、nf-a及瘦素抗體），觀察其對(duì)肝細(xì)胞lxra、apoai、abca及sr-bi蛋白及mrna表達(dá)的影響及其對(duì)肝細(xì)胞攝取hdl中膽固醇的影響。(3) 在脂肪細(xì)胞/肝細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，加入nf-kb拮抗劑，阻斷肝細(xì)胞的nf-kb通路，觀察其對(duì)肝細(xì)胞lxra、apoai、abca及sr-bi蛋白及mrna表達(dá)的影響及肝細(xì)胞對(duì)hdl中膽固醇攝取的影響。（4） 體內(nèi)驗(yàn)證脂肪細(xì)胞因子對(duì)肝細(xì)胞hdl代謝影響1) 觀察對(duì)照與肥胖小鼠（基因敲除和飲食誘導(dǎo)）肝臟lxra、apoai、abca及sr-bi蛋白及mrna表達(dá)差異及血清apoai和hdl-c水平差異，同時(shí)觀察體內(nèi)注射不同脂肪因子中和抗體（如il-6、tnf

42、-a及瘦素抗體）后肥胖小鼠肝臟lxra、apoai、abca及sr-bi蛋白及mrna表達(dá)及血清apoai和hdl-c水平變化。2) 觀察體內(nèi)注射不同脂肪因子中和抗體（如il-6、tnf-a及瘦素抗體）對(duì)肥胖小鼠體內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)各環(huán)節(jié)（從巨噬細(xì)胞到血清以及從血清到糞便）的影響。第四部分 脂肪細(xì)胞因子影響肝臟tg代謝（1）肝細(xì)胞與脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響1) 建立脂肪細(xì)胞與肝細(xì)胞的共培養(yǎng)模型，檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)tg含量 2) 肝細(xì)胞與脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)后，檢測(cè)肝細(xì)胞ppar-以及脂肪細(xì)胞相關(guān)特異基因ap2、adiponectin等的表達(dá)（肝細(xì)胞發(fā)生脂肪化時(shí)，上述基因表達(dá)增加）。（2）探討脂肪細(xì)

43、胞對(duì)肝細(xì)胞cide表達(dá)的影響及相關(guān)通路和分子機(jī)制1) 肝細(xì)胞與脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)后，檢測(cè)肝細(xì)胞cide的基因及蛋白表達(dá)水平的變化。2) 檢測(cè)共培養(yǎng)后肝細(xì)胞srebp1c蛋白及其磷酸化水平的改變，以及其下游多種酶類的表達(dá)變化，包括蛋白乙酰輔酶a 羧化酶2 (acetyl-coa carboxylase2, acc2)、脂肪酸合成酶 (fatty acid synthetase, fas)和乙酰輔酶a 去飽和酶1 (stearoyl-coenzyme a desaturase 1, scd1)。3) 檢測(cè)共培養(yǎng)后肝細(xì)胞ampk蛋白及其磷酸化水平的改變，檢測(cè)線粒體的氧化功能，包括nrf1、pgc1a、v

44、lcad、cox1和coxii線粒體相關(guān)基因的表達(dá)變化。4) 檢測(cè)共培養(yǎng)后肝細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性，包括irs-1、akt-2蛋白及其磷酸化水平的變化等。5) sirna分別沉默cide-a、-b、-c后，重復(fù)2-4的檢測(cè) ，明確其關(guān)鍵作用的cide蛋白。六、年度計(jì)劃按年度提供研究內(nèi)容及預(yù)期目標(biāo)（5年）年度研究計(jì)劃（1） 2012.1至2012.12 脂肪細(xì)胞膽固醇代謝失衡機(jī)制探討。前體脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化，并進(jìn)行體外干預(yù) 。（2） 2013.1至2013.12 檢測(cè)脂肪細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并進(jìn)行相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與分泌功能異常的關(guān)系。 （3） 2014.1至2014.6 建立脂肪細(xì)胞/

45、肝細(xì)胞共培養(yǎng)體系，探討脂肪細(xì)胞/肝細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)肝細(xì)胞表達(dá)hdl代謝相關(guān)蛋白及hdl-c攝取的影響。（4） 2014.7至2014.12 建立基質(zhì)膠種植與回收模型，觀察體內(nèi)脂肪組織對(duì)種植肝細(xì)胞hdl代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。（5） 2015.1至2015.6 探討jnk1、ras信號(hào)通路、細(xì)胞因子及nf-kb在介導(dǎo)脂肪細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞hdl代謝影響中的作用。（6） 2015.7至2.15.12 體內(nèi)觀察不同肥胖小鼠對(duì)肝臟hdl代謝相關(guān)蛋白的影響，同時(shí)觀察脂肪因子中和抗體對(duì)肥胖相關(guān)hdl代謝異常及膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)影響。（7） 2016.1至2016.6 建立的脂肪細(xì)胞與肝細(xì)胞的共培養(yǎng)模型，檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)tg含

46、量和ppar-以及脂肪細(xì)胞相關(guān)特異基因的表達(dá)。（8） 2016.7至2016.12 探討脂肪細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞cide表達(dá)的影響及相關(guān)通路和分子機(jī)制。整理數(shù)據(jù)，發(fā)表論文。七、創(chuàng)新點(diǎn)與特色（1）探討脂肪細(xì)胞膽固醇代謝的機(jī)制，以膽固醇代謝失衡為靶點(diǎn)，研究脂肪細(xì)胞的功能異常，具有原始創(chuàng)新性，國內(nèi)外尚未見該類報(bào)道；（2）從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激方面入手，探討肥大脂肪細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝失衡致功能異常的機(jī)制，這是脂肪細(xì)胞功能異常的全新機(jī)制探討，能為脂肪肝等疾病的防治提供新的干預(yù)策略。（3）以脂肪細(xì)胞與肝細(xì)胞共培養(yǎng)模型為切入點(diǎn)模擬體內(nèi)脂肪細(xì)胞旁分泌作用，基質(zhì)膠皮下種植和回收技術(shù)模擬體內(nèi)脂肪組織對(duì)種植肝細(xì)胞的作用，探討脂肪因子對(duì)

47、肝細(xì)胞的作用尚屬首創(chuàng)。（4）利用共培養(yǎng)模型，探討cide家族對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝及胰島素敏感性的影響并明確cide作用通路具有原創(chuàng)性。八、取得重大突破的可行性分析（1）在血脂代謝及脂肪細(xì)胞研究領(lǐng)域均具有良好的工作基礎(chǔ)：課題組從1989年開始致力于血脂與動(dòng)脈粥樣硬化的研究，在脂質(zhì)代謝研究方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。2004年和2007年分獲衛(wèi)生部重點(diǎn)項(xiàng)目資助（批準(zhǔn)號(hào)30470705，30770857），對(duì)高密度脂蛋白系列（包括apoai、apoe及其模擬肽）展開了廣泛、深入的研究。多篇有價(jià)值的學(xué)術(shù)論文發(fā)表在atherosclerosis、am heart j、int j cardiol.等國外sci期刊

48、上，引起國外同行關(guān)注；近5年來，課題組一直從事脂肪細(xì)胞脂質(zhì)代謝及內(nèi)分泌功能研究，熟練掌握脂肪細(xì)胞培養(yǎng)、膽固醇流出檢測(cè)、基因沉默等技術(shù)，已獲得多個(gè)有關(guān)脂肪細(xì)胞的國家自然科學(xué)基金課題（“脂肪細(xì)胞過氧化物酶增殖體激活受體調(diào)節(jié)脂蛋白代謝”（批準(zhǔn)號(hào)39970296 ）；“高密度脂蛋白和apoai模擬肽對(duì)脂肪細(xì)胞分泌功能調(diào)節(jié)和機(jī)制”（批準(zhǔn)號(hào)30470705 ）；“內(nèi)源性大麻系統(tǒng)對(duì)脂肪細(xì)胞脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)及其機(jī)制” （批準(zhǔn)號(hào)30600498），“載脂蛋白av對(duì)細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的影響及其機(jī)制探討” （批準(zhǔn)號(hào)30971266），及其省科技廳課題 “女性內(nèi)源性雌激素變化對(duì)血管內(nèi)皮功能影響及其機(jī)制研究”、“雌激素對(duì)內(nèi)皮

49、細(xì)胞衰老的作用及機(jī)制（項(xiàng)目編號(hào)03ssy3080）” ，在脂肪細(xì)胞脂質(zhì)代謝及其調(diào)控領(lǐng)域的研究處于國內(nèi)外領(lǐng)先地位。本課題在前期研究的基礎(chǔ)上制定，立題理論科學(xué)，依據(jù)充分，設(shè)計(jì)方案合理，理論上有可行性。（2）研究方法先進(jìn)、可靠，且部分方法已建立：本課題的關(guān)鍵技術(shù)，包括脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化、脂肪細(xì)胞與肝細(xì)胞共培養(yǎng)模型的建立、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激檢測(cè)、動(dòng)物模型建立、膽固醇流出檢測(cè)、激光共聚焦檢測(cè)，基質(zhì)膠種植和回收技術(shù)等都已建立成熟，為課題的順利進(jìn)行奠定基礎(chǔ)。（3） 擁有成熟的實(shí)驗(yàn)技術(shù)、先進(jìn)的設(shè)備和優(yōu)秀的研究人員：申請(qǐng)人所在的研究所為衛(wèi)生部重點(diǎn)項(xiàng)目資助的實(shí)驗(yàn)室，配備有齊全且先進(jìn)的分子生物學(xué)設(shè)備及常規(guī)實(shí)驗(yàn)設(shè)備，并

50、有專門的分子生物學(xué)技術(shù)人員從事基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)工作，具有完善的細(xì)胞培養(yǎng)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的條件和技術(shù)，能獨(dú)立完成western免疫印跡、同位素檢測(cè)、脂蛋白超速離心和激光共聚焦檢測(cè)等相關(guān)實(shí)驗(yàn)；研究所具有一支研究經(jīng)驗(yàn)豐富，創(chuàng)新能力強(qiáng)的研究團(tuán)隊(duì)，且多數(shù)曾有海外研究經(jīng)歷。該課題的申請(qǐng)成員多人曾在國外知名實(shí)驗(yàn)室從事博士后研究，積累了豐富的研究經(jīng)歷。（4） 具有良好的支撐平臺(tái)：與美國遠(yuǎn)泰生物技術(shù)有限公司建立了長期合作伙伴關(guān)系。能共享我校國家遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、腫瘤研究所等重要資源。九、課題設(shè)置本課題旨在闡明肥胖狀態(tài)下脂肪細(xì)胞脂質(zhì)代謝失衡及內(nèi)分泌紊亂的機(jī)制，揭示肥胖時(shí)脂肪細(xì)胞炎性脂肪因子對(duì)肝細(xì)胞hdl代謝的影響，明確cide

51、家族調(diào)控肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝的分子機(jī)制。為研究代謝綜合征及脂肪肝等疾病的發(fā)病機(jī)制及防治策略提供依據(jù)。（1）研究脂肪細(xì)胞內(nèi)膽固醇失衡的機(jī)制： 培養(yǎng)成熟脂肪細(xì)胞和肥大脂肪細(xì)胞（3t3-l1細(xì)胞促分化至21天），分別檢測(cè)其對(duì)膽固醇的攝取和流出能力以及與攝取和流出有關(guān)的蛋白表達(dá)； 構(gòu)建腺病毒載體，分別沉默srebp2和lxr，探討srebp2在脂肪細(xì)胞膽固醇代謝失衡中的體制。（2）研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)膽固醇負(fù)荷所致脂肪細(xì)胞分泌功能異常：培養(yǎng)成熟脂肪細(xì)胞，觀察膽固醇過負(fù)荷對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和脂肪因子表達(dá)分泌的影響，探討其機(jī)制；建立肥胖小鼠模型，在體觀察脂肪細(xì)胞膽固醇負(fù)荷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與脂肪因子分泌變化之間的聯(lián)系；（3

52、）研究炎性脂肪因子影響肝臟hdl代謝：用脂肪細(xì)胞與肝細(xì)胞共培養(yǎng)模型和基質(zhì)膠皮下種植/回收技術(shù)，分別觀察不同狀態(tài)的脂肪細(xì)胞及脂肪組織對(duì)肝細(xì)胞hdl 代謝的影響及分子機(jī)制，并探討脂肪細(xì)胞因子及其調(diào)節(jié)通路在介導(dǎo)脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞相互作用中的價(jià)值。最后通過不同模型肥胖小鼠觀察肥胖對(duì)肝臟hdl 代謝的影響并探索體內(nèi)注射脂肪細(xì)胞因子拮抗劑干預(yù)的作用。（4） 研究炎性脂肪因子影響肝臟tg代謝：觀察肝細(xì)胞與脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響，探討脂肪細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞cide表達(dá)的影響及相關(guān)通路和分子機(jī)制，運(yùn)用sirna技術(shù)分別沉默cide-a、-b、-c后明確關(guān)鍵作用的cide蛋白。十、現(xiàn)有工作基礎(chǔ)和條件（一）主

53、要承擔(dān)單位的相關(guān)工作基礎(chǔ)和研究成果（含重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室情況）1、工作基礎(chǔ)（1）課題組自2003年起開始關(guān)注脂肪細(xì)胞及其膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)，成功培養(yǎng)原代和3t3-l1脂肪細(xì)胞，并建立了成熟的誘導(dǎo)分化技術(shù)。研究發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞可通過細(xì)胞表面的清道夫受體cd36攝取脂蛋白中的膽固醇（atherosclerosis.2004;177:25562,），并對(duì)脂肪細(xì)胞的膽固醇流出途徑、分泌功能等進(jìn)行了深入探討（int j cardiol. 2008;128:42-7）。（2）本課題組初步觀察發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠體內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)受損，為本研究的立題打下了基礎(chǔ)。1） 肥胖導(dǎo)致小鼠體內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)受損：采用高脂肪飲食喂養(yǎng)c57bl/6小鼠

54、12周，使其體重超過同齡低脂肪飲食c57bl/6小鼠20%以上，然后進(jìn)行了體內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)檢測(cè)。結(jié)果提示：在注射荷載3h-標(biāo)記膽固醇的巨噬細(xì)胞后，與對(duì)照小鼠比較，肥胖小鼠血清及糞便3h-膽固醇放射活性在不同時(shí)間點(diǎn)均有降低，表示肥胖小鼠體內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)下降。同時(shí)，48小時(shí)糞便3h-膽固醇放射活性在兩組的差異大于48小時(shí)血清3h-膽固醇放射活性在兩組的差異（圖-7），說明肥胖小鼠從血清到糞便的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)受損更加嚴(yán)重，提示肥胖對(duì)肝臟參與的膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)影響更突出。2）初步觀察了基質(zhì)膠皮下種植與回收的可行性：基質(zhì)膠為細(xì)胞膜基質(zhì)蛋白，其特點(diǎn)是在4°時(shí)呈液態(tài)，在>22°時(shí)呈膠狀，因

55、此，我們可將肝細(xì)胞懸浮于4°的液態(tài)基質(zhì)膠中，然后注射到皮下脂肪組織周圍，進(jìn)入體內(nèi)后變?yōu)槟z狀，便于回收。3）證實(shí)基質(zhì)膠中的細(xì)胞可與外周組織進(jìn)行正常物質(zhì)交換：盡管基質(zhì)膠遇熱變?yōu)槟z狀的特性有利于細(xì)胞種植和回收，但必須明確固態(tài)基質(zhì)膠中的細(xì)胞與周圍組織的物質(zhì)交換不會(huì)受阻。為證實(shí)這一關(guān)鍵點(diǎn)，我們通過將荷載3h-膽固醇的巨噬細(xì)胞懸浮于液態(tài)的基質(zhì)膠中，然后注入皮下，同時(shí)采用培養(yǎng)基懸浮的荷載3h-膽固醇的巨噬細(xì)胞作為對(duì)照，比較體內(nèi)3h-膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)膠中的巨噬細(xì)胞3h-膽固醇能正常進(jìn)入血液和糞便，但在前24小時(shí)基質(zhì)膠中巨噬細(xì)胞的3h-膽固醇進(jìn)入血清的速度稍慢，48小時(shí)后基質(zhì)膠注射組與

56、培養(yǎng)基注射組無明顯差異。提示基質(zhì)膠中的細(xì)胞能與周圍組織進(jìn)行正常的物質(zhì)交換。（3）本課題組致力于血脂與動(dòng)脈粥樣硬化的研究，在脂蛋白研究方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。對(duì)載脂蛋白e的調(diào)脂和抗動(dòng)脈粥樣硬化作用進(jìn)行了系列研究，曾獲湖南省科技成果獎(jiǎng)和中華醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的研究結(jié)果，曾發(fā)表在著名的心血管雜志circulation上（circulation. 2004;110(8):915-20.），引起國內(nèi)外同行關(guān)注。2004年在國家自然科學(xué)基金（30470705）的資助下，開展了“高密度脂蛋白和apoai模擬肽對(duì)脂肪細(xì)胞分泌功能的調(diào)節(jié)和機(jī)制” 的研究，發(fā)表相關(guān)研究論文14篇（其中5篇sci文章），并已按時(shí)結(jié)題。2004年和2007年分獲衛(wèi)生部重點(diǎn)項(xiàng)目資助，對(duì)高密度脂蛋白系列（包括apoai、apoe及其模擬肽）展開了廣泛、深入的研究，發(fā)表相關(guān)研究論文18篇（其中8篇sci文章）。2007年再獲國家自然科學(xué)基金資助（30770857），開展“apoai/e嵌合肽的優(yōu)選及其抗動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制研究”。（4）課題組成員已熟練掌握放射性核素標(biāo)記和蛋白結(jié)合檢測(cè)、膽固醇流出測(cè)定以及各種脂蛋白成分的超速分離方法，為本課題的順利完成奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。2、工作條件（1）課題組所在研究所已有本項(xiàng)目所需大部分儀器設(shè)備，包括：二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱、熒光顯微鏡、射線計(jì)數(shù)儀、實(shí)時(shí)定量pcr