激光共聚焦掃描顯微鏡LSCM

1、 1.典型產(chǎn)品 2.基本組成 3.優(yōu)點 4.共聚焦的原理 5.掃描模式 6.整體結(jié)構(gòu) 7.應(yīng)用 Nikon的 Eclipse C1 Plus 1.性能卓越的平場復(fù)消色差TIRF物鏡（ 60 x ，100 x）， NA = 1.49.。這是當(dāng)前數(shù)值孔徑最高的油浸物鏡 2.四孔位針孔轉(zhuǎn)盤：用電腦控制針孔的大小，可在分辨率和光切厚度之間取得最佳平衡。 3.時間間隔可變的Time Lapse: 可以在拍攝過程中不同的時間段采用不同的時間間隔。 一、基本組成 （一）激光器激光器:多線氬離子(458 nm, 488 nm, 514 nm) 、氦氖綠(543nm)、氦氖紅(633 nm) （二）掃描器掃描器

2、(內(nèi)裝有針孔光欄、分光鏡、發(fā)射熒光單色器及檢測器) （三）光學(xué)裝置：光學(xué)裝置：根據(jù)樣品中熒光信號的強(qiáng)弱、大小及分布，調(diào)節(jié)激光能量、檢測孔光欄、光電倍增管（PMT）的檢測范圍、物鏡和電子放大倍數(shù)（zoom），以利于采集各種熒光信號。 （四）計算機(jī)圖像存儲與處理及控制系統(tǒng)：計算機(jī)圖像存儲與處理及控制系統(tǒng)：實現(xiàn)了圖像的優(yōu)化、三維重建，實現(xiàn)了全自動程序化控制采集（檢測）樣品熒光圖像的時間和空間，并和同時采集樣品中多重?zé)晒庑盘柕姆纸饧昂铣蓤D像，對其進(jìn)行定量測定。 一一.分辨率分辨率（0.1 8m） 二二.可可重構(gòu)樣品的重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)三維結(jié)構(gòu) 三三.無無損傷、連續(xù)光學(xué)損傷、連續(xù)光學(xué)切片切片 四四.光譜

3、掃描光譜掃描（分辨由光源波長，物鏡參數(shù)和針孔直徑等決定，如60X，NA1.4的物鏡水平分辨率約為0.2 m，垂直分辨率約為0.5m。）（細(xì)菌細(xì)胞1-2 m，原核生物細(xì)胞1-10 m） 利用照明針孔和探測針孔實現(xiàn)點照明和探測，并且被探測點位于焦平面。照明針孔與探測針孔對被照射點或被探測點來說是共軛的，因此被探測點即共焦點。 1.點照明（為作圖方便已將光線發(fā)散角放大） 假設(shè)是場照明（非共聚焦），會導(dǎo)致： 一.發(fā)生衍射，使像模糊； 二.散射光干擾（即除了成像點外，其余 點處有散射光進(jìn)入探測針孔）； 而點照明則不會有這些問題。消除衍射影響消除衍射影響消除背景雜光消除背景雜光 2.焦平面點成像 焦平面上

4、的像是最清晰的，從上面的圖可以看出，非焦平面點所成 的像的光像被探測針孔擋住，不會進(jìn)入光探頭，所以焦平面點成像使像更清晰。所以共聚焦成像方式可以很大的所以共聚焦成像方式可以很大的提高分辨率和成像質(zhì)量。提高分辨率和成像質(zhì)量。 一. XY軸掃描 二. Z軸掃描 （1）單光束掃描模式 其中最常見的掃描安排結(jié)合了兩個獨立的掃描鏡，具有中繼光學(xué)系統(tǒng)。移動的垂直軸的反射鏡即在試樣上產(chǎn)生XY平面的掃描。但中間需要增加高級別的像差校正光學(xué)系統(tǒng)，導(dǎo)致發(fā)光效率降低。 （1）單光束掃描模式 （2）多光束掃描（尼普可夫圓盤掃描） 多光束掃描技術(shù)提供了一個替代的單光束掃描配置照明效率低，而且掃描速度更快。其中旋轉(zhuǎn)盤掃描

5、儀有數(shù)百個孔，其功能作為照明和探測的針孔。由于磁盤掃描顯微鏡形成的實像，可以直接位于CCD照相機(jī)的圖像平面中。盡管這方面的優(yōu)勢，它允許實時聚焦和成像的動態(tài)過程，有幾個缺點限制了磁盤掃描共聚焦系統(tǒng)的實際效用。其中最嚴(yán)重的是典型的依賴于傳統(tǒng)的廣譜光源，和在磁盤發(fā)生極端的光損失。 （2）多光束掃描 奧林巴斯Fluo View300 激光共聚焦掃描系統(tǒng)同樣可以實現(xiàn)XZ軸，YZ軸掃描 通常的方法是通過計算機(jī)控制的馬達(dá)以預(yù)先設(shè)定的步距移動顯微鏡的鏡臺然后采集圖像。 （當(dāng)然也有通過改變焦平面位置的方法） 通過精細(xì)平面光切，形成生物樣品不同平通過精細(xì)平面光切，形成生物樣品不同平面的精細(xì)圖象，將一個連續(xù)的光切圖象面的精細(xì)圖象，將一個連續(xù)的光切圖象Z Z軸軸重疊就可形成一個完整的三維重疊就可形成一個完整的三維圖象圖象 切片的厚度受物鏡的數(shù)值孔徑和針孔直徑影響，比如60X，NA1.4的鏡頭當(dāng)針孔設(shè)定為1mm時，光學(xué)切片厚度為0.4微米。 激光掃描共聚焦顯微鏡的應(yīng)用范圍廣泛，主要在于生物領(lǐng)域，包括多種神經(jīng)解剖學(xué)和神經(jīng)生理學(xué)的研究，廣泛的細(xì)胞和組織的形態(tài)學(xué)研究，共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，干細(xì)胞研究，光漂