微生物實驗室質(zhì)量控制2009

1、衛(wèi)生微生物實驗室衛(wèi)生微生物實驗室的質(zhì)量保證與質(zhì)量控制的質(zhì)量保證與質(zhì)量控制二二0000九年四月九年四月微生物實驗室微生物實驗室v衛(wèi)生微生物實驗室衛(wèi)生微生物實驗室v病原微生物實驗室病原微生物實驗室v臨床微生物實驗室臨床微生物實驗室v分子微生物實驗室分子微生物實驗室微生物檢測的定義微生物檢測的定義v在特定的環(huán)境下在特定的環(huán)境下( (無菌無菌) )，采用適當(dāng)?shù)姆椒▽Γ捎眠m當(dāng)?shù)姆椒▽悠分心繕?biāo)微生物進行增殖和培養(yǎng)，并對以樣品中目標(biāo)微生物進行增殖和培養(yǎng)，并對以放大后的目標(biāo)微生物進行感官、生理、生化放大后的目標(biāo)微生物進行感官、生理、生化等到方面的特性分析和判定，以確定樣品中等到方面的特性分析和判定，以確定

2、樣品中目標(biāo)微生物的量或質(zhì)的特性的過程。目標(biāo)微生物的量或質(zhì)的特性的過程。微生物檢測涉及的要素微生物檢測涉及的要素v檢驗人員檢驗人員v檢測經(jīng)驗的判斷能力v檢測設(shè)備檢測設(shè)備v保證目標(biāo)菌種的生長的外部環(huán)境v菌種試劑菌種試劑v保證目標(biāo)菌種的生長的內(nèi)部環(huán)境v檢測方法檢測方法v選擇適宜目標(biāo)菌種檢測的方法v測試環(huán)境測試環(huán)境v保證操作過程不受外界干擾（保護樣品和人員）檢驗人員檢驗人員v檢驗人員需經(jīng)過微生物專業(yè)基礎(chǔ)知識和無菌檢驗人員需經(jīng)過微生物專業(yè)基礎(chǔ)知識和無菌技術(shù)的培訓(xùn)后技術(shù)的培訓(xùn)后, ,方可上崗操作方可上崗操作, ,并應(yīng)了解本專并應(yīng)了解本專業(yè)國內(nèi)外的最新文獻資料、參加專業(yè)培訓(xùn)，業(yè)國內(nèi)外的最新文獻資料、參加專業(yè)

3、培訓(xùn)，不斷更新專業(yè)知識和提高檢驗質(zhì)量，從實踐不斷更新專業(yè)知識和提高檢驗質(zhì)量，從實踐中不斷提高實驗室質(zhì)量管理規(guī)范，以保證檢中不斷提高實驗室質(zhì)量管理規(guī)范，以保證檢驗工作科學(xué)、規(guī)范、優(yōu)質(zhì)、高效，確保數(shù)據(jù)驗工作科學(xué)、規(guī)范、優(yōu)質(zhì)、高效，確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確和報告公正，實現(xiàn)實驗室的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)準(zhǔn)確和報告公正，實現(xiàn)實驗室的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化和管理科學(xué)化。范化和管理科學(xué)化。質(zhì)量保證和質(zhì)量控制的目的質(zhì)量保證和質(zhì)量控制的目的v質(zhì)量保證質(zhì)量保證v為使人們能確信某產(chǎn)品(這里指培養(yǎng)基)能滿足規(guī)定的質(zhì)量要求所必須的執(zhí)行的有計劃的和系統(tǒng)的活動。v質(zhì)量控制質(zhì)量控制v為達到質(zhì)量要求所采取的作業(yè)技術(shù)和活動。v為監(jiān)測整個檢測的過程，排除在具體的

4、技術(shù)操作中導(dǎo)致不滿意的原因，以取得可靠的檢測結(jié)果。微生物實驗室設(shè)施微生物實驗室設(shè)施v微生物檢驗必須在無菌環(huán)境中進行，保持樣微生物檢驗必須在無菌環(huán)境中進行，保持樣品的原污染狀態(tài)，防止二次污染。在未普遍品的原污染狀態(tài)，防止二次污染。在未普遍采用現(xiàn)代化的無菌隔離器技術(shù)之前，無菌室采用現(xiàn)代化的無菌隔離器技術(shù)之前，無菌室仍然是最常用的無菌環(huán)境之一，無菌室及配仍然是最常用的無菌環(huán)境之一，無菌室及配套的相關(guān)建筑設(shè)計應(yīng)充分考慮其合理布局，套的相關(guān)建筑設(shè)計應(yīng)充分考慮其合理布局，操作安全，使用方便等條件。操作安全，使用方便等條件。微生物實驗室布局微生物實驗室布局v無菌室應(yīng)遠離交通干道、廁所及污染區(qū)，最無菌室應(yīng)遠離

5、交通干道、廁所及污染區(qū)，最好在二樓以上，應(yīng)選上、下水道及其他安裝好在二樓以上，應(yīng)選上、下水道及其他安裝適宜的位置。滅菌物品存放和傳輸、培養(yǎng)間、適宜的位置。滅菌物品存放和傳輸、培養(yǎng)間、結(jié)果觀察、陽性對照實驗室和辦公室等，要結(jié)果觀察、陽性對照實驗室和辦公室等，要集中，減少污染，便于管理和使用。集中，減少污染，便于管理和使用。微生物實驗室布局微生物實驗室布局v無菌操作間應(yīng)具有單向流空氣凈化設(shè)備，無無菌操作間應(yīng)具有單向流空氣凈化設(shè)備，無菌操作間面積不小于菌操作間面積不小于5m5m2 2, ,高度不超過高度不超過2.4m,2.4m,溫溫度控制在度控制在18182626，相對濕度，相對濕度40%40%60

6、%60%。新鮮空氣經(jīng)高效層流過濾后進入操作間。潔新鮮空氣經(jīng)高效層流過濾后進入操作間。潔凈度級別為局部百級、周圍環(huán)境萬級。應(yīng)保凈度級別為局部百級、周圍環(huán)境萬級。應(yīng)保持對環(huán)境形成正壓，不同級別的潔凈室之間持對環(huán)境形成正壓，不同級別的潔凈室之間的壓差不低于的壓差不低于4.9Pa4.9Pa，潔凈區(qū)對與其相通的非，潔凈區(qū)對與其相通的非潔凈區(qū)的壓差不低于潔凈區(qū)的壓差不低于10Pa10Pa。無菌室潔凈度要。無菌室潔凈度要定期檢查沉降菌或浮游菌及懸浮粒子。定期檢查沉降菌或浮游菌及懸浮粒子。微生物實驗室布局微生物實驗室布局v無菌室內(nèi)應(yīng)六面光滑、平整、無縫隙、不起無菌室內(nèi)應(yīng)六面光滑、平整、無縫隙、不起灰、耐腐蝕、

7、易清洗，墻與地面、臺面、墻灰、耐腐蝕、易清洗，墻與地面、臺面、墻壁之間連接處應(yīng)呈凹弧形，不留死角，室內(nèi)壁之間連接處應(yīng)呈凹弧形，不留死角，室內(nèi)不安裝上、下水道，進出口應(yīng)為拉門，出入不安裝上、下水道，進出口應(yīng)為拉門，出入操作間和緩沖間的門不應(yīng)直對。室內(nèi)的電源操作間和緩沖間的門不應(yīng)直對。室內(nèi)的電源總控制應(yīng)設(shè)在室外?？偪刂茟?yīng)設(shè)在室外。微生物實驗室布局微生物實驗室布局v無菌室內(nèi)采光的面積要大，照明燈應(yīng)嵌裝在無菌室內(nèi)采光的面積要大，照明燈應(yīng)嵌裝在天花板內(nèi)，光照應(yīng)分布均勻，光照度不低于天花板內(nèi)，光照應(yīng)分布均勻，光照度不低于300300勒克斯，緩沖間和操作間勻應(yīng)設(shè)置紫外燈勒克斯，緩沖間和操作間勻應(yīng)設(shè)置紫外燈（

8、2 22.5w/m2.5w/m3 3) )，距實驗臺面高度不超過，距實驗臺面高度不超過1m1m。微生物實驗室使用微生物實驗室使用v無菌檢查、微生物限度檢查、微生物效價檢無菌檢查、微生物限度檢查、微生物效價檢定應(yīng)有專用的無菌室，不可混用，以免彼此定應(yīng)有專用的無菌室，不可混用，以免彼此干擾或交叉污染。干擾或交叉污染。v陽性對照實驗陽性對照實驗以及具有危險性的毒菌、毒素以及具有危險性的毒菌、毒素等檢驗，如破傷風(fēng)梭菌、黃曲霉毒素等檢驗，等檢驗，如破傷風(fēng)梭菌、黃曲霉毒素等檢驗，必須有必須有單獨使用的無菌間或生物安全柜單獨使用的無菌間或生物安全柜，以，以便控制，防止傳播。便控制，防止傳播。微生物實驗室使用

9、微生物實驗室使用v無菌室一般應(yīng)設(shè)有一更、二更、緩沖間和無無菌室一般應(yīng)設(shè)有一更、二更、緩沖間和無菌操作間。無菌室內(nèi)應(yīng)有人凈、物凈設(shè)施，菌操作間。無菌室內(nèi)應(yīng)有人凈、物凈設(shè)施，所有實驗器材應(yīng)經(jīng)過消毒處理后，通過物流所有實驗器材應(yīng)經(jīng)過消毒處理后，通過物流間無菌傳遞系統(tǒng)進入無菌室，執(zhí)行人流和物間無菌傳遞系統(tǒng)進入無菌室，執(zhí)行人流和物流分開。流分開。微生物實驗室的分級微生物實驗室的分級v根據(jù)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB19489-2004實驗室生物安全通用要求實驗室生物安全通用要求把把所有操所有操作的微生物因子的危害程度和采取的防護措作的微生物因子的危害程度和采取的防護措施，將微生物

10、實驗室所處理樣本的生物危險施，將微生物實驗室所處理樣本的生物危險性程度將微生物實驗室分為四級：性程度將微生物實驗室分為四級：v級對生物安全隔離要求最低，級對生物安全隔離要求最低，級最高。級最高。以以BSL-1、 BSL-2、 BSL-3、 BSL-4表示微表示微生物實驗室的相應(yīng)生物實驗室的相應(yīng)生物安全防護水平生物安全防護水平。微生物實驗室的分級微生物實驗室的分級v級生物安全防護實驗室：級生物安全防護實驗室：v實驗室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)實驗室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)備適用于對健康成年人巳知無致病作用的微備適用于對健康成年人巳知無致病作用的微生物，如用于教學(xué)的普通微生物實驗室等

11、。生物，如用于教學(xué)的普通微生物實驗室等。v級生物安全防護實驗室：級生物安全防護實驗室：v實驗室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)實驗室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)備適用于對人或環(huán)境具有中等潛在危害的微備適用于對人或環(huán)境具有中等潛在危害的微生物。生物。微生物實驗室的分級微生物實驗室的分級v級生物安全防護實驗室：級生物安全防護實驗室：v實驗室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)實驗室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)備適用于主要通過呼吸途徑使人傳染上嚴重備適用于主要通過呼吸途徑使人傳染上嚴重的甚至是致死疾病的致病微生物及其病毒，的甚至是致死疾病的致病微生物及其病毒，通常巳有預(yù)防傳染的疫苗。艾滋病病毒的

12、研通常巳有預(yù)防傳染的疫苗。艾滋病病毒的研究（血清學(xué)實驗除外）應(yīng)在究（血清學(xué)實驗除外）應(yīng)在級級生物安全防生物安全防護實驗室中進行。護實驗室中進行。微生物實驗室的分級微生物實驗室的分級v級生物安全防護實驗室：級生物安全防護實驗室：v實驗室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)實驗室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)備適用于對人體具有高度的危險性，通過氣備適用于對人體具有高度的危險性，通過氣溶膠途徑傳播或傳播途徑不明，目前尚無有溶膠途徑傳播或傳播途徑不明，目前尚無有效的疫苗或治療方法的致病微生物及毒素。效的疫苗或治療方法的致病微生物及毒素。與上述情況類似的不明微生物，也必須在與上述情況類似的不明微生物，也必

13、須在級級生物安全防護實驗室中進行。待有充分數(shù)生物安全防護實驗室中進行。待有充分數(shù)據(jù)后再決定此種微生物或毒素應(yīng)在據(jù)后再決定此種微生物或毒素應(yīng)在級級還是還是在較低級別的實驗室中處理。在較低級別的實驗室中處理。儀器設(shè)備儀器設(shè)備v所用的各種器械及設(shè)備應(yīng)按計量要求定期檢所用的各種器械及設(shè)備應(yīng)按計量要求定期檢測，全部設(shè)備應(yīng)滿足檢測項目的要求，做到測，全部設(shè)備應(yīng)滿足檢測項目的要求，做到設(shè)備檔案齊全，每臺（件）設(shè)備需使用標(biāo)簽設(shè)備檔案齊全，每臺（件）設(shè)備需使用標(biāo)簽標(biāo)識，需檢定或校準(zhǔn)的設(shè)備表明狀態(tài)和有效標(biāo)識，需檢定或校準(zhǔn)的設(shè)備表明狀態(tài)和有效期限，儀器使用作業(yè)指導(dǎo)書，手冊和使用記期限，儀器使用作業(yè)指導(dǎo)書，手冊和使用

14、記錄，環(huán)境監(jiān)測記錄、維修記錄等，以保證其錄，環(huán)境監(jiān)測記錄、維修記錄等，以保證其正常使用。正常使用。儀器設(shè)備儀器設(shè)備v無菌實驗室配備的紫外消毒裝置，使用前后無菌實驗室配備的紫外消毒裝置，使用前后進行照射消毒，要定期進行紫外線強度和空進行照射消毒，要定期進行紫外線強度和空氣質(zhì)量監(jiān)測，高效過濾器應(yīng)定期進行風(fēng)速監(jiān)氣質(zhì)量監(jiān)測，高效過濾器應(yīng)定期進行風(fēng)速監(jiān)測，根據(jù)檢測的情況，必要時予以更換處理。測，根據(jù)檢測的情況，必要時予以更換處理。生物安全實驗室，要正常進行管理維護和工生物安全實驗室，要正常進行管理維護和工作人員隔離防護。作人員隔離防護。v高壓蒸汽滅菌器除定期校驗表壓和溫度外，高壓蒸汽滅菌器除定期校驗表壓

15、和溫度外，應(yīng)定期用生物指示劑對滅菌效果進行驗證。應(yīng)定期用生物指示劑對滅菌效果進行驗證。儀器設(shè)備儀器設(shè)備v其他微生物學(xué)檢驗所用的儀器，如培養(yǎng)箱、其他微生物學(xué)檢驗所用的儀器，如培養(yǎng)箱、電熱恒溫水浴箱、電熱恒溫干燥箱、酸度計、電熱恒溫水浴箱、電熱恒溫干燥箱、酸度計、電子天平、微量加樣器、光學(xué)光度計、冰箱、電子天平、微量加樣器、光學(xué)光度計、冰箱、低溫冰箱、光學(xué)顯微鏡、生物安柜等，應(yīng)嚴低溫冰箱、光學(xué)顯微鏡、生物安柜等，應(yīng)嚴格按規(guī)定進行檢查。格按規(guī)定進行檢查。v培養(yǎng)箱內(nèi)保持清潔，要定期進行細菌和霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)保持清潔，要定期進行細菌和霉菌的檢查。的檢查。實驗室維護實驗室維護v工作臺面：工作臺面：v測定樣品前

16、或開始工作前，必須用清潔劑測定樣品前或開始工作前，必須用清潔劑（消毒劑）徹底消潔臺面。（消毒劑）徹底消潔臺面。v工作結(jié)束（樣品制備、接種、轉(zhuǎn)移）或當(dāng)天工作結(jié)束（樣品制備、接種、轉(zhuǎn)移）或當(dāng)天工作結(jié)束后，臺面要再清潔消毒。工作結(jié)束后，臺面要再清潔消毒。v處理致病菌性物質(zhì)時，用處理致病菌性物質(zhì)時，用75%75%的乙醇，的乙醇，70709090% %的異丙醇或次氯酸鹽溶液消毒。的異丙醇或次氯酸鹽溶液消毒。實驗室維護實驗室維護v生物危害性物質(zhì)：生物危害性物質(zhì)：v所有物質(zhì)用后立即置于廠商建議濃度的消毒所有物質(zhì)用后立即置于廠商建議濃度的消毒液中（如液中（如5%5%的苯酚溶液），或直接扔到危害的苯酚溶液），或

17、直接扔到危害袋中。所有物質(zhì)在袋中。所有物質(zhì)在121121持續(xù)高壓滅菌至少持續(xù)高壓滅菌至少3030分鐘。分鐘。v滅菌后按規(guī)定丟棄所有具器。遵守廢棄物處滅菌后按規(guī)定丟棄所有具器。遵守廢棄物處理規(guī)定。理規(guī)定。培養(yǎng)基的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)v培養(yǎng)基分類上屬于培養(yǎng)基分類上屬于體外診斷試劑體外診斷試劑。其質(zhì)量控。其質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)有：制的標(biāo)準(zhǔn)有：v中華人民共和國質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局中華人民共和國質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局商商品化微生物培養(yǎng)基的質(zhì)量保證品化微生物培養(yǎng)基的質(zhì)量保證SNCCLS-1996SNCCLS-1996v中華人民共和國衛(wèi)生部中華人民共和國衛(wèi)生部商業(yè)性微生物養(yǎng)基商業(yè)性微生物養(yǎng)基質(zhì)量檢驗規(guī)程

18、質(zhì)量檢驗規(guī)程WS/T232-2002(WS/T232-2002(所謂所謂商業(yè)性商業(yè)性就就是即買即用的一次性培養(yǎng)基是即買即用的一次性培養(yǎng)基) )v中華人民共和國中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) YY/T 0577-YY/T養(yǎng)基的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)v中華人民共和國質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局培養(yǎng)中華人民共和國質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局培養(yǎng)基制備指南基制備指南 第第1 1部分部分實驗室培養(yǎng)基制備和實驗室培養(yǎng)基制備和質(zhì)量保證通則質(zhì)量保證通則SN/T1538.1-2005SN/T1538.1-2005v中華人民共和國藥典中華人民共和國藥典20052005年版年版v中國

19、藥品標(biāo)準(zhǔn)檢驗操作規(guī)范中國藥品標(biāo)準(zhǔn)檢驗操作規(guī)范20052005年版年版v中國合格評定國家認可委員會（中國合格評定國家認可委員會（CNAS-CNAS-CL09:2006)CL09:2006)檢測和校準(zhǔn)實驗室能力認可準(zhǔn)檢測和校準(zhǔn)實驗室能力認可準(zhǔn)則在微生物領(lǐng)域的應(yīng)用說明則在微生物領(lǐng)域的應(yīng)用說明培養(yǎng)基的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)v中華人民共和國質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局培養(yǎng)中華人民共和國質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局培養(yǎng)基制備指南基制備指南 第第2 2部分部分培養(yǎng)基性能測試實用培養(yǎng)基性能測試實用指南指南SN/T1538.2-2007SN/T1538.2-2007v中華人民共和國食品藥品監(jiān)督管理局中華人民共和國食品

20、藥品監(jiān)督管理局 國食藥國食藥監(jiān)械監(jiān)械20085352008535號號 培養(yǎng)基類產(chǎn)品分類界定培養(yǎng)基類產(chǎn)品分類界定等等v綜合上述的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，下面主要以綜合上述的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，下面主要以SN/T SN/T 15381538的標(biāo)準(zhǔn)為主要內(nèi)容簡述一下培養(yǎng)基的質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)為主要內(nèi)容簡述一下培養(yǎng)基的質(zhì)量保證與質(zhì)量控制。量保證與質(zhì)量控制。培養(yǎng)基制備指南培養(yǎng)基制備指南: :SN/T1538SN/T1538vSN/T1538.1-2005(2005-7-1SN/T1538.1-2005(2005-7-1實施實施) )v第第1 1部分：實驗室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則部分：實驗室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則v提出要求并制定系

21、統(tǒng)的控制計劃提出要求并制定系統(tǒng)的控制計劃v屬于質(zhì)量保證的范圍屬于質(zhì)量保證的范圍vSN/T1538.2-2007(2007-10-16SN/T1538.2-2007(2007-10-16實施實施) )v第第2 2部分：培養(yǎng)基性能測試實用指南部分：培養(yǎng)基性能測試實用指南v為保證提出的質(zhì)量要求所需要采取的技術(shù)操作為保證提出的質(zhì)量要求所需要采取的技術(shù)操作v屬于質(zhì)量控制的內(nèi)容屬于質(zhì)量控制的內(nèi)容SN/T1538SN/T1538標(biāo)準(zhǔn)制定情況標(biāo)準(zhǔn)制定情況v本部分為本部分為SN/T1538SN/T1538的第的第1 1部分對應(yīng)于：部分對應(yīng)于：vISO/TS11133-1:ISO/TS11133-1:食品和動物飼

22、料培養(yǎng)基制備指南食品和動物飼料培養(yǎng)基制備指南- -培養(yǎng)基制備指南培養(yǎng)基制備指南- -實驗室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則實驗室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則(2000(2000英文版英文版) )與其的一致性程度與其的一致性程度 (2005-07-01 (2005-07-01實施）實施）v本部分為本部分為SN/T1538SN/T1538的第的第2 2部分對應(yīng)于：部分對應(yīng)于：vISO/TS11133-2:2003ISO/TS11133-2:2003食品和動物飼料培養(yǎng)基制備食品和動物飼料培養(yǎng)基制備指南指南與其的一致性程度與其的一致性程度 (2007-10-16 (2007-10-16實施）實施）SN/T1538 S

23、N/T1538 標(biāo)準(zhǔn)的作用標(biāo)準(zhǔn)的作用v為培養(yǎng)基質(zhì)量保證和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)體系，有為培養(yǎng)基質(zhì)量保證和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)體系，有利于對培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)化管理，提高實驗室檢利于對培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)化管理，提高實驗室檢測質(zhì)量。測質(zhì)量。v第第1 1部分為質(zhì)量保證和培養(yǎng)基質(zhì)量基本要求。部分為質(zhì)量保證和培養(yǎng)基質(zhì)量基本要求。v第第2 2部分為質(zhì)量控制技術(shù)。部分為質(zhì)量控制技術(shù)。v為中國實驗室國家認可委員會（為中國實驗室國家認可委員會（C CNASNAS）合格）合格評定微生物實驗室認證工作提供參考依據(jù)。評定微生物實驗室認證工作提供參考依據(jù)。培養(yǎng)基的類型培養(yǎng)基的類型v各別成分培養(yǎng)基（自制培養(yǎng)基）：各別成分培養(yǎng)基（自制培養(yǎng)基）：v實驗室

24、用不同的化學(xué)試劑或生物工程試劑按實驗室用不同的化學(xué)試劑或生物工程試劑按照一定的配方、比例配置而成的培養(yǎng)基。照一定的配方、比例配置而成的培養(yǎng)基。v即用型培養(yǎng)基（商業(yè)培養(yǎng)基）：即用型培養(yǎng)基（商業(yè)培養(yǎng)基）：v以即用形式置于容器中（例如：平皿、試管以即用形式置于容器中（例如：平皿、試管、安瓿安瓿或其它容器）供應(yīng)的培養(yǎng)基?；蚱渌萜鳎┕?yīng)的培養(yǎng)基。v脫水合成培養(yǎng)基（干粉培養(yǎng)基）：脫水合成培養(yǎng)基（干粉培養(yǎng)基）：v不立即使用的干粉形式的（如：粉末、顆粒、不立即使用的干粉形式的（如：粉末、顆粒、凍干等形式）培養(yǎng)基凍干等形式）培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的分類培養(yǎng)基的分類v培養(yǎng)基是指以液體、半固體或固體形式，培養(yǎng)基是指以液體

25、、半固體或固體形式，包含天然或合成成分，用于促進微生物的包含天然或合成成分，用于促進微生物的繁殖或保持其活力的物質(zhì)組成。繁殖或保持其活力的物質(zhì)組成。v培養(yǎng)基分類培養(yǎng)基分類v按狀態(tài)分類：液體、固體、半固體培養(yǎng)基。按狀態(tài)分類：液體、固體、半固體培養(yǎng)基。v按用途分類按用途分類v運送培養(yǎng)基：保護和維持微生物活性，不運送培養(yǎng)基：保護和維持微生物活性，不含有使微生物增殖的物質(zhì)。含有使微生物增殖的物質(zhì)。培養(yǎng)基的分類培養(yǎng)基的分類v保存培養(yǎng)基；在一定期限內(nèi)保護和維持微生保存培養(yǎng)基；在一定期限內(nèi)保護和維持微生物活力，或使微生物在長期保存后容易復(fù)蘇物活力，或使微生物在長期保存后容易復(fù)蘇（如卵黃培養(yǎng)基）。（如卵黃培養(yǎng)

26、基）。v復(fù)蘇培養(yǎng)基：能夠使受損或應(yīng)激的微生物修復(fù)蘇培養(yǎng)基：能夠使受損或應(yīng)激的微生物修復(fù)、使微生物恢復(fù)正常生長能力，但不促進復(fù)、使微生物恢復(fù)正常生長能力，但不促進微生物繁殖的培養(yǎng)基（如緩沖蛋白胨水）。微生物繁殖的培養(yǎng)基（如緩沖蛋白胨水）。v增菌培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)基（選擇性：如膽鹽乳糖增菌液、（選擇性：如膽鹽乳糖增菌液、非選擇性：如營養(yǎng)肉湯）。非選擇性：如營養(yǎng)肉湯）。培養(yǎng)基的分類培養(yǎng)基的分類v分離培養(yǎng)基分離培養(yǎng)基v選擇性分離培養(yǎng)基：支持特定微生物的生長選擇性分離培養(yǎng)基：支持特定微生物的生長而抑制其他微生物生長（如膽鹽硫乳瓊脂）而抑制其他微生物生長（如膽鹽硫乳瓊脂）v非選擇性分離培養(yǎng)基：對微生物沒有選擇

27、性非選擇性分離培養(yǎng)基：對微生物沒有選擇性的抑制作用（如營養(yǎng)瓊脂）的抑制作用（如營養(yǎng)瓊脂）v鑒別培養(yǎng)基：能夠進行一項或多項微生物生鑒別培養(yǎng)基：能夠進行一項或多項微生物生理學(xué)或生化特性鑒定試驗（如三糖鐵瓊脂）理學(xué)或生化特性鑒定試驗（如三糖鐵瓊脂）v鑒定培養(yǎng)基：能夠產(chǎn)生一個特定的鑒定反應(yīng)鑒定培養(yǎng)基：能夠產(chǎn)生一個特定的鑒定反應(yīng)而不需要做進一步確認實驗的培養(yǎng)基（如而不需要做進一步確認實驗的培養(yǎng)基（如MUGMUG培養(yǎng)基）培養(yǎng)基）培養(yǎng)基的質(zhì)量保證培養(yǎng)基的質(zhì)量保證v生產(chǎn)企業(yè)提供的材料：生產(chǎn)企業(yè)提供的材料：v培養(yǎng)基名稱、各種成分和增補劑名稱、產(chǎn)品培養(yǎng)基名稱、各種成分和增補劑名稱、產(chǎn)品批號。批號。v培養(yǎng)基使用前的

28、培養(yǎng)基使用前的PHPH值。值。v儲藏條件和有效期。儲藏條件和有效期。v技術(shù)數(shù)據(jù)清單。技術(shù)數(shù)據(jù)清單。v質(zhì)控證書（性能評價和所用的測試菌種）。質(zhì)控證書（性能評價和所用的測試菌種）。v必要的安全及危害數(shù)據(jù)。必要的安全及危害數(shù)據(jù)。培養(yǎng)基的質(zhì)量保證培養(yǎng)基的質(zhì)量保證v實驗室驗收：實驗室驗收：v保存有效的培養(yǎng)基目錄清單。保存有效的培養(yǎng)基目錄清單。v包裝情況和完整性。包裝情況和完整性。v培養(yǎng)基的名稱和批號。培養(yǎng)基的名稱和批號。v接收日期、有效期。接收日期、有效期。v首次開封日期。首次開封日期。v內(nèi)容物的感官檢查內(nèi)容物的感官檢查( (粉末的流動性、均勻性、粉末的流動性、均勻性、結(jié)塊情況和顏色變化結(jié)塊情況和顏色變

29、化) )。培養(yǎng)基的儲存培養(yǎng)基的儲存v例行常規(guī)檢查（干粉培養(yǎng)基）：例行常規(guī)檢查（干粉培養(yǎng)基）：v容器密封性復(fù)查；首次開封日期；內(nèi)容物感容器密封性復(fù)查；首次開封日期；內(nèi)容物感官檢查。官檢查。v使用前檢查（商業(yè)性培養(yǎng)基）：使用前檢查（商業(yè)性培養(yǎng)基）：v顏色是否發(fā)生變化？是否蒸發(fā)顏色是否發(fā)生變化？是否蒸發(fā)/ /脫水？脫水？ 是否是否有微生物污染？有微生物污染？v嚴格按照供應(yīng)商提供的儲藏條件、有效期和使用方嚴格按照供應(yīng)商提供的儲藏條件、有效期和使用方法進行培養(yǎng)基的保存和使用。法進行培養(yǎng)基的保存和使用。v有計劃購買，先購先用。有計劃購買，先購先用。培養(yǎng)基的儲存培養(yǎng)基的儲存v成品培養(yǎng)基（系指配好待用的培養(yǎng)基

30、成品培養(yǎng)基（系指配好待用的培養(yǎng)基, ,下同）下同）v已分裝好的培養(yǎng)基：避光、冷藏。已分裝好的培養(yǎng)基：避光、冷藏。v最終成分在使用前加入的培養(yǎng)基，冰箱保存最終成分在使用前加入的培養(yǎng)基，冰箱保存不超過三個月，室溫保存不超過一個月。不超過三個月，室溫保存不超過一個月。v不穩(wěn)定的選擇性添加成分應(yīng)在培養(yǎng)基制備的不穩(wěn)定的選擇性添加成分應(yīng)在培養(yǎng)基制備的當(dāng)天使用。當(dāng)天使用。v觀察任意顏色變化，記錄培養(yǎng)基蒸發(fā)或微生觀察任意顏色變化，記錄培養(yǎng)基蒸發(fā)或微生物生長情況。物生長情況。培養(yǎng)基的實驗室制備培養(yǎng)基的實驗室制備v使用商品化的脫水合成培養(yǎng)基時，應(yīng)嚴格按使用商品化的脫水合成培養(yǎng)基時，應(yīng)嚴格按照廠商提供的使用說明配置

31、，如重量照廠商提供的使用說明配置，如重量/ /體積、體積、PHPH值、制備的數(shù)據(jù)、滅菌條件、操作步驟。值、制備的數(shù)據(jù)、滅菌條件、操作步驟。v使用獨立成分制備培養(yǎng)基時，按配方準(zhǔn)確配使用獨立成分制備培養(yǎng)基時，按配方準(zhǔn)確配置并記錄配置步驟。置并記錄配置步驟。培養(yǎng)基的實驗室制備培養(yǎng)基的實驗室制備v水：要求使用蒸餾水或相同質(zhì)量的水，不含水：要求使用蒸餾水或相同質(zhì)量的水，不含有抑制或影響微生物生長的物質(zhì)。有抑制或影響微生物生長的物質(zhì)。v稱量和復(fù)水：防止培養(yǎng)基結(jié)塊。稱量和復(fù)水：防止培養(yǎng)基結(jié)塊。v溶解和分裝：適當(dāng)加熱重復(fù)攪拌。溶解和分裝：適當(dāng)加熱重復(fù)攪拌。v pHpH值的測定和調(diào)整：使用值的測定和調(diào)整：使用

32、pHpH計。計。 1mol/L1mol/L的氫氧化鈉溶液或的氫氧化鈉溶液或1mol/L1mol/L的鹽酸溶液的鹽酸溶液進行進行pHpH值的調(diào)整。值的調(diào)整。培養(yǎng)基的實驗室制備培養(yǎng)基的實驗室制備v分裝分裝v滅菌滅菌 v濕熱滅菌：按使用說明規(guī)定進行濕熱滅菌：按使用說明規(guī)定進行 ，監(jiān)控高壓，監(jiān)控高壓滅菌過程，保證滅菌溫度，避免過度加熱。滅菌過程，保證滅菌溫度，避免過度加熱。v過濾除菌：真空負壓或正壓條件下進行，濾過濾除菌：真空負壓或正壓條件下進行，濾膜和濾墊除菌。濾器膜和濾墊除菌。濾器121121滅菌滅菌2020分鐘。分鐘。培養(yǎng)基的使用培養(yǎng)基的使用v瓊脂培養(yǎng)基的融化瓊脂培養(yǎng)基的融化 避免過度加熱，融化

33、后避免過度加熱，融化后的培養(yǎng)基應(yīng)盡快使用，不要放置超過的培養(yǎng)基應(yīng)盡快使用，不要放置超過4 4小時。小時。v對熱不穩(wěn)定的添加成分應(yīng)在培養(yǎng)基冷卻至對熱不穩(wěn)定的添加成分應(yīng)在培養(yǎng)基冷卻至48482 2時加入。時加入。v平板培養(yǎng)基的保存：暗處存放一周或平板培養(yǎng)基的保存：暗處存放一周或4 41212冰箱密封袋，存放三周或按廠商提供標(biāo)冰箱密封袋，存放三周或按廠商提供標(biāo)準(zhǔn)進行。作好標(biāo)記（名稱、制備日期、有效準(zhǔn)進行。作好標(biāo)記（名稱、制備日期、有效期）。期）。v平板冷卻后裝袋避免產(chǎn)生冷凝水。平板冷卻后裝袋避免產(chǎn)生冷凝水。培養(yǎng)基的使用培養(yǎng)基的使用v平板培養(yǎng)基的培養(yǎng)平板培養(yǎng)基的培養(yǎng) 每垛最多堆放六個平板，平板間要留有

34、空隙每垛最多堆放六個平板，平板間要留有空隙 進行空氣流通，使溫度盡快達到一致。進行空氣流通，使溫度盡快達到一致。v培養(yǎng)基的棄置培養(yǎng)基的棄置v所有污染和未使用的培養(yǎng)基的棄置必須采用安全的所有污染和未使用的培養(yǎng)基的棄置必須采用安全的方式，并且要符合相關(guān)法規(guī)（廢棄物處理程序）的方式，并且要符合相關(guān)法規(guī)（廢棄物處理程序）的規(guī)定。規(guī)定。 成品培養(yǎng)基的質(zhì)量控制成品培養(yǎng)基的質(zhì)量控制v物理質(zhì)量的控制物理質(zhì)量的控制v20202525時的時的pHpH值。值。v液體培養(yǎng)基：外觀透明、清亮、無混濁、無液體培養(yǎng)基：外觀透明、清亮、無混濁、無沉淀。沉淀。v固體培養(yǎng)基：具有特定顏色、表面濕潤無水固體培養(yǎng)基：具有特定顏色、表

35、面濕潤無水氣、平整光潔無凹坑和氣泡、無雜質(zhì)氣、平整光潔無凹坑和氣泡、無雜質(zhì) 厚度厚度3 34mm4mm。成品培養(yǎng)基的質(zhì)量控制成品培養(yǎng)基的質(zhì)量控制v無菌實驗無菌實驗v壓力蒸汽滅菌后的固體培養(yǎng)基，隨機抽取一壓力蒸汽滅菌后的固體培養(yǎng)基，隨機抽取一定數(shù)量放定數(shù)量放3 36 61 1溫箱培養(yǎng)溫箱培養(yǎng)2424小時。小時。v煮沸消毒的選擇性培養(yǎng)基可取部分瓊脂，放煮沸消毒的選擇性培養(yǎng)基可取部分瓊脂，放入無菌肉湯培養(yǎng)入無菌肉湯培養(yǎng)2424小時。小時。v培養(yǎng)后無細菌生長視為合格。培養(yǎng)后無細菌生長視為合格。成品培養(yǎng)基的質(zhì)量控制成品培養(yǎng)基的質(zhì)量控制v細菌生長實驗細菌生長實驗：用已知標(biāo)準(zhǔn)菌株做質(zhì)控。：用已知標(biāo)準(zhǔn)菌株做質(zhì)

36、控。v測試菌種要求測試菌種要求 v具有穩(wěn)定特性，能代表其種并能有效證明實具有穩(wěn)定特性，能代表其種并能有效證明實驗室特定培養(yǎng)基的最佳性能。驗室特定培養(yǎng)基的最佳性能。v可溯源至國家或國際公認的菌種收藏中心?？伤菰粗羾一驀H公認的菌種收藏中心。v可使用實驗室自己分離的具有良好特性的菌可使用實驗室自己分離的具有良好特性的菌種，但必須對照標(biāo)準(zhǔn)菌株進行鑒定。種，但必須對照標(biāo)準(zhǔn)菌株進行鑒定。成品培養(yǎng)基的質(zhì)量控制成品培養(yǎng)基的質(zhì)量控制v質(zhì)控菌種要求具有穩(wěn)定特性，能代表其種并質(zhì)控菌種要求具有穩(wěn)定特性，能代表其種并能有效的證明實驗室特定培養(yǎng)基的最佳性能能有效的證明實驗室特定培養(yǎng)基的最佳性能的菌種。測試菌種主要購于

37、參考菌種的菌種的菌種。測試菌種主要購于參考菌種的菌種保藏中心。保藏中心。 v中國醫(yī)學(xué)細菌保藏管理中心中國醫(yī)學(xué)細菌保藏管理中心 CMCCCMCC 。v美國細菌收集和分型中心美國細菌收集和分型中心 ATCCATCC 。成品培養(yǎng)基的質(zhì)量控制成品培養(yǎng)基的質(zhì)量控制v培養(yǎng)基的測試菌種應(yīng)具備以下性能：培養(yǎng)基的測試菌種應(yīng)具備以下性能：v典型反應(yīng)的強陽性菌種；典型反應(yīng)的強陽性菌種；v弱生長的陽性菌種（選擇更敏感的菌種）；弱生長的陽性菌種（選擇更敏感的菌種）；v生化反應(yīng)菌種（顯示不同發(fā)酵和熒光反應(yīng)的生化反應(yīng)菌種（顯示不同發(fā)酵和熒光反應(yīng)的菌種）；菌種）；v完全抑制菌種。完全抑制菌種。成品培養(yǎng)基的質(zhì)量控制成品培養(yǎng)基的

38、質(zhì)量控制v菌液制備菌液制備v將工作用的質(zhì)控菌株在培養(yǎng)平板上轉(zhuǎn)種，培將工作用的質(zhì)控菌株在培養(yǎng)平板上轉(zhuǎn)種，培養(yǎng)后取養(yǎng)后取3 35 5個單個的菌落懸浮于少量的滅菌個單個的菌落懸浮于少量的滅菌TSBTSB中，培養(yǎng)中，培養(yǎng)4h4h5h5h。v用分光光度計調(diào)整濁度至用分光光度計調(diào)整濁度至0.50.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)或在麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)或在625nm625nm吸光度值為吸光度值為0.080.080.10.1，使菌落計數(shù)達，使菌落計數(shù)達到到(1(12)2)10108 8 CFU/mL CFU/mL。成品固體培養(yǎng)基的質(zhì)量控制成品固體培養(yǎng)基的質(zhì)量控制v將將363611培養(yǎng)培養(yǎng)181824h24h的的新鮮菌懸液新鮮菌懸液用生理用生

39、理鹽水作鹽水作1 1: :1010稀釋，在每個待測培養(yǎng)基上用稀釋，在每個待測培養(yǎng)基上用3mm3mm接種環(huán)或接種環(huán)或0 0. .1mL1mL稀釋懸液接種稀釋懸液接種, ,使?jié)舛冗_到使?jié)舛冗_到100 100 CFU/CFU/碟。碟。v至少使用兩塊平板，每塊平板的菌落平均數(shù)至少使用兩塊平板，每塊平板的菌落平均數(shù)應(yīng)為應(yīng)為100cfu100cfu。v按適宜的溫度培養(yǎng)，觀察平板上細菌的生長按適宜的溫度培養(yǎng)，觀察平板上細菌的生長特征。結(jié)果應(yīng)生長良好。特征。結(jié)果應(yīng)生長良好。成品固體培養(yǎng)基的質(zhì)量控制成品固體培養(yǎng)基的質(zhì)量控制v平板培養(yǎng)技術(shù)：平板培養(yǎng)技術(shù)：v傾注法傾注法v涂布法涂布法v旋轉(zhuǎn)涂布法旋轉(zhuǎn)涂布法成品液體培

40、養(yǎng)基的質(zhì)量控制成品液體培養(yǎng)基的質(zhì)量控制v將將363611培養(yǎng)培養(yǎng)18182424小時的小時的新鮮菌懸液新鮮菌懸液用生理鹽水作用生理鹽水作1:101:10稀釋，取稀釋，取5050100cfu 100cfu 接種至試驗培養(yǎng)基和參照培養(yǎng)基中。接種至試驗培養(yǎng)基和參照培養(yǎng)基中。v按適宜的溫度進行培養(yǎng)。按適宜的溫度進行培養(yǎng)。v觀察每瓶（管）細菌的生長情況，結(jié)果應(yīng)觀察每瓶（管）細菌的生長情況，結(jié)果應(yīng)生長良好。生長良好。v對于不透明的培養(yǎng)基，在確定生長時需接對于不透明的培養(yǎng)基，在確定生長時需接種到瓊脂培養(yǎng)基上。種到瓊脂培養(yǎng)基上。成品培養(yǎng)基質(zhì)量檢查記錄成品培養(yǎng)基質(zhì)量檢查記錄v培養(yǎng)基質(zhì)量檢查記錄表培養(yǎng)基名稱生產(chǎn)廠

41、家批號外觀顏色澄清度pH軟硬度微生物學(xué)性能檢定結(jié)論檢驗者/時間備注微生物檢驗的量值溯源微生物檢驗的量值溯源v為滿足培養(yǎng)基、試劑盒和試劑的質(zhì)量測定和為滿足培養(yǎng)基、試劑盒和試劑的質(zhì)量測定和微生物工程檢測過程的質(zhì)量控制需要，實驗微生物工程檢測過程的質(zhì)量控制需要，實驗室應(yīng)準(zhǔn)備好足夠種類和數(shù)量的參考菌株和參室應(yīng)準(zhǔn)備好足夠種類和數(shù)量的參考菌株和參考培養(yǎng)物。考培養(yǎng)物。v參考菌株和參考培養(yǎng)物可以由有資質(zhì)的單位參考菌株和參考培養(yǎng)物可以由有資質(zhì)的單位提供或經(jīng)過準(zhǔn)確鑒定的分離株。提供或經(jīng)過準(zhǔn)確鑒定的分離株。v菌種：個體形態(tài)以及菌落特征相近，而且生菌種：個體形態(tài)以及菌落特征相近，而且生化反應(yīng)、基因特征、血清型均保持一

42、致的細化反應(yīng)、基因特征、血清型均保持一致的細胞菌落。胞菌落。微生物檢驗的量值溯源微生物檢驗的量值溯源v參考菌種：至少定到屬或種水平的菌種，按參考菌種：至少定到屬或種水平的菌種，按其特征進行分類和描述。其特征進行分類和描述。v參考參考原種原種：將實驗室獲得的或供應(yīng)商提供的：將實驗室獲得的或供應(yīng)商提供的標(biāo)準(zhǔn)菌種在實驗室經(jīng)過一代轉(zhuǎn)接后獲得的一標(biāo)準(zhǔn)菌種在實驗室經(jīng)過一代轉(zhuǎn)接后獲得的一套獨立的相同的菌種。套獨立的相同的菌種。v工作菌種：由參考原株轉(zhuǎn)接一代獲得的菌種。工作菌種：由參考原株轉(zhuǎn)接一代獲得的菌種。菌種保藏的目的菌種保藏的目的v菌種保藏的目的：菌種保藏的目的：v保持菌種較高的存活率；保持菌種較高的存

43、活率；v降低菌種的變異幅度；降低菌種的變異幅度；v防止其他微生物污染；防止其他微生物污染；v在適宜條件下，菌種可以重新恢復(fù)原有在適宜條件下，菌種可以重新恢復(fù)原有生物學(xué)活性。生物學(xué)活性。菌種保藏的原理菌種保藏的原理v菌種保藏的原則是根據(jù)菌種的生理、生化特菌種保藏的原則是根據(jù)菌種的生理、生化特性，在人工創(chuàng)造的條件下盡量降低微生物細性，在人工創(chuàng)造的條件下盡量降低微生物細胞的代謝強度，使細胞處于休眠狀態(tài)，生長胞的代謝強度，使細胞處于休眠狀態(tài)，生長繁殖受到抑制但又不至于死亡，以減少菌的繁殖受到抑制但又不至于死亡，以減少菌的變異率。低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)等環(huán)變異率。低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)等環(huán)境條件

44、都有抑制微生物的代謝作用。因此低境條件都有抑制微生物的代謝作用。因此低溫、干燥、真空是用于菌種保藏的重要手段。溫、干燥、真空是用于菌種保藏的重要手段。菌種的管理菌種的管理v1、實驗用菌、毒種的申購，應(yīng)有科室負責(zé)人實驗用菌、毒種的申購，應(yīng)有科室負責(zé)人簽字。申購單應(yīng)注明菌種名、菌號、數(shù)量及簽字。申購單應(yīng)注明菌種名、菌號、數(shù)量及請購單位蓋章。請購單位蓋章。v2 2、菌種應(yīng)有專人保管，管理人員應(yīng)具有較強、菌種應(yīng)有專人保管，管理人員應(yīng)具有較強的責(zé)任心。從指定單位購到的菌毒種，應(yīng)有的責(zé)任心。從指定單位購到的菌毒種，應(yīng)有登記。一一核對菌種、菌號、數(shù)量，無誤后登記。一一核對菌種、菌號、數(shù)量，無誤后方可轉(zhuǎn)種。方

45、可轉(zhuǎn)種。v3 3、用適宜培養(yǎng)基將凍干菌種稀釋、轉(zhuǎn)種、培、用適宜培養(yǎng)基將凍干菌種稀釋、轉(zhuǎn)種、培養(yǎng)。該菌種經(jīng)鑒定無誤后可作為對照菌用。養(yǎng)。該菌種經(jīng)鑒定無誤后可作為對照菌用。如發(fā)現(xiàn)菌株特性不符，不得使用。如發(fā)現(xiàn)菌株特性不符，不得使用。菌種的管理菌種的管理v4 4、 試驗用菌種在使用過程中，應(yīng)檢查其生試驗用菌種在使用過程中，應(yīng)檢查其生物學(xué)特性。如有變異或污染雜菌，均不得使物學(xué)特性。如有變異或污染雜菌，均不得使用。發(fā)現(xiàn)染菌用。發(fā)現(xiàn)染菌 或變異、衰退等現(xiàn)象時，應(yīng)及或變異、衰退等現(xiàn)象時，應(yīng)及時恢復(fù)或廢棄。時恢復(fù)或廢棄。v5 5 、試驗菌種不得任意帶出實驗室。外單位、試驗菌種不得任意帶出實驗室。外單位索取菌種

46、時，應(yīng)經(jīng)領(lǐng)導(dǎo)同意，包裝嚴密，妥索取菌種時，應(yīng)經(jīng)領(lǐng)導(dǎo)同意，包裝嚴密，妥善攜帶。善攜帶。 菌種保藏菌種保藏v菌種的保藏是微生物檢驗工作中的一項常規(guī)菌種的保藏是微生物檢驗工作中的一項常規(guī)技術(shù)，科學(xué)的保藏和管理直接關(guān)系到檢驗結(jié)技術(shù)，科學(xué)的保藏和管理直接關(guān)系到檢驗結(jié)果的正確與否。果的正確與否。v不同微生物根據(jù)其特征選擇最適宜的保藏方不同微生物根據(jù)其特征選擇最適宜的保藏方法，菌種保藏方法一般分四個階段（法，菌種保藏方法一般分四個階段（1 1）挑選）挑選特征典型的純菌菌落。（特征典型的純菌菌落。（2 2）能產(chǎn)生孢子或芽）能產(chǎn)生孢子或芽孢的微生物應(yīng)用孢子和芽孢進行保存。（孢的微生物應(yīng)用孢子和芽孢進行保存。（3

47、 3）選擇最適宜的方法保藏。（選擇最適宜的方法保藏。（4 4）定期對保藏菌）定期對保藏菌種進行檢查。種進行檢查。標(biāo)準(zhǔn)菌株的儲備標(biāo)準(zhǔn)菌株的儲備v標(biāo)準(zhǔn)菌株在實驗室經(jīng)過一次傳代獲得的一組標(biāo)準(zhǔn)菌株在實驗室經(jīng)過一次傳代獲得的一組完全相同的菌株。完全相同的菌株。v傳代菌株應(yīng)當(dāng)完全具備標(biāo)準(zhǔn)菌株的所有性狀。傳代菌株應(yīng)當(dāng)完全具備標(biāo)準(zhǔn)菌株的所有性狀。v傳代時要保證一定的量，以減少傳代的次數(shù)傳代時要保證一定的量，以減少傳代的次數(shù)v每株菌株盡量避免多次使用。每株菌株盡量避免多次使用。v采用不同的保存方法保存期限不同（如斜面采用不同的保存方法保存期限不同（如斜面保存法、穿刺法，液體石蠟法等保存期限的保存法、穿刺法，液體

48、石蠟法等保存期限的長短都不一樣）。長短都不一樣）。常用菌種的保藏方法常用菌種的保藏方法v菌種保藏方法有多種，如瓊脂斜面低溫保藏菌種保藏方法有多種，如瓊脂斜面低溫保藏法、液體石蠟保藏法、干燥（沙土）保藏法、法、液體石蠟保藏法、干燥（沙土）保藏法、玻璃珠保藏法、冷凍真空保藏法、超低溫保玻璃珠保藏法、冷凍真空保藏法、超低溫保藏法、液氮保藏法等。但對不同的微生物應(yīng)藏法、液氮保藏法等。但對不同的微生物應(yīng)通過保藏試驗來選擇最適宜的保藏方法。通過保藏試驗來選擇最適宜的保藏方法。v注意事項注意事項: :保藏的菌種均應(yīng)是新鮮純菌培養(yǎng)物保藏的菌種均應(yīng)是新鮮純菌培養(yǎng)物, ,至少應(yīng)是第三代的培養(yǎng)物。不同細菌用不同至少

49、應(yīng)是第三代的培養(yǎng)物。不同細菌用不同培養(yǎng)基，定期檢查菌種保存環(huán)境做好記錄。培養(yǎng)基，定期檢查菌種保存環(huán)境做好記錄。v1 1、瓊脂斜面低溫保藏方法、瓊脂斜面低溫保藏方法 常用菌種的保藏方法常用菌種的保藏方法v2 2、半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)、半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)v3 3、液體石蠟覆蓋保藏法：本法是用石蠟將培、液體石蠟覆蓋保藏法：本法是用石蠟將培養(yǎng)物與空氣隔絕，以降低菌種的生理、升化養(yǎng)物與空氣隔絕，以降低菌種的生理、升化水平，延長菌種保藏時間。水平，延長菌種保藏時間。方法：選擇優(yōu)質(zhì)液體石蠟，方法：選擇優(yōu)質(zhì)液體石蠟，121121高壓滅菌高壓滅菌30min30min后在后在1 16 600烘箱烘箱1

50、12h2h除去掉水分冷卻后除去掉水分冷卻后備用。取經(jīng)培養(yǎng)的高層半固體菌管加入液體備用。取經(jīng)培養(yǎng)的高層半固體菌管加入液體石蠟，高出培養(yǎng)基面石蠟，高出培養(yǎng)基面1cm1cm為宜，放入為宜，放入4 4 保藏。保藏?？杀４姘肽昊蛞荒辍？杀４姘肽昊蛞荒辍３Ｓ镁N的保藏方法常用菌種的保藏方法v4 4、冷凍真空保藏法、冷凍真空保藏法v保護劑：有多種，多用脫脂牛奶。將牛奶煮沸、靜保護劑：有多種，多用脫脂牛奶。將牛奶煮沸、靜止、冷卻除去上面一層脂肪，重復(fù)止、冷卻除去上面一層脂肪，重復(fù)3 3次后用脫脂棉次后用脫脂棉過濾，滅菌。過濾，滅菌。v菌懸液制備：直接刮取用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)的細菌懸液制備：直接刮取用營養(yǎng)瓊脂培

51、養(yǎng)基培養(yǎng)的細菌，懸浮于分散劑中。用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的細菌，菌，懸浮于分散劑中。用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的細菌，哀告離心沉淀傾出上清液，加入分散劑。哀告離心沉淀傾出上清液，加入分散劑。v菌懸液濃度：菌懸液濃度：10109 910101212cfu/mlcfu/ml。v低溫、冷凍、真空干燥置低溫、冷凍、真空干燥置-35 -35 保存。保存。常用菌種的保藏方法常用菌種的保藏方法v5 5、液氮保藏法、液氮保藏法v保存：制備菌懸液，用甘油或二甲亞砜作保保存：制備菌懸液，用甘油或二甲亞砜作保護劑，分裝安瓿，每管護劑，分裝安瓿，每管0.5ml0.5ml，預(yù)凍至，預(yù)凍至-40-40（控制溫度下降速率為（控制溫度下降速率

52、為1/min)1/min)，放入液氮，放入液氮生物貯存罐中保存。生物貯存罐中保存。v恢復(fù)：直接浸入恢復(fù)：直接浸入3838水浴中解凍水浴中解凍5 510min10min，轉(zhuǎn)種于適宜培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)種于適宜培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。v注意：大多數(shù)屬種適于慢速凍結(jié)和快速凍結(jié)。注意：大多數(shù)屬種適于慢速凍結(jié)和快速凍結(jié)。蒸餾水保藏法蒸餾水保藏法v6 6、蒸餾水保藏法蒸餾水保藏法v在斜面培養(yǎng)基上加無菌蒸餾水在斜面培養(yǎng)基上加無菌蒸餾水5 56ml6ml，用吸，用吸管輕輕吹散表面菌苔，移入滅菌螺旋口小試管輕輕吹散表面菌苔，移入滅菌螺旋口小試管中，蓋嚴蓋子在室溫保存。管中，蓋嚴蓋子在室溫保存。v霉菌、酵母和放線菌、植物病原菌

53、可在室溫霉菌、酵母和放線菌、植物病原菌可在室溫保存數(shù)年。保存數(shù)年。玻璃珠保藏法玻璃珠保藏法v7、玻璃珠保藏法、玻璃珠保藏法v無菌操作將菌懸液加入玻璃瓶中，充分攪動包被無菌操作將菌懸液加入玻璃瓶中，充分攪動包被玻璃珠，移去多余懸液。玻璃珠，移去多余懸液。v標(biāo)記后保存標(biāo)記后保存-60-608585冰柜。冰柜。v不同顏色有助菌株辨別。不同顏色有助菌株辨別。v使用使取出使用使取出1 1粒用相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)粒用相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)v需氧菌需氧菌營養(yǎng)肉湯，厭氧菌營養(yǎng)肉湯，厭氧菌強化梭狀芽孢桿強化梭狀芽孢桿菌培養(yǎng)基。菌培養(yǎng)基。 v嗜鹽菌嗜鹽菌鹽營養(yǎng)肉湯加鹽營養(yǎng)肉湯加15%15%甘油。甘油。甘油低溫保藏法甘油低溫保藏

54、法v8 8、甘油低溫保藏法甘油低溫保藏法v菌種懸浮在菌種懸浮在10%10%15%15%甘油蒸餾水，超低溫甘油蒸餾水，超低溫冰箱保藏（冰箱保藏（ -70-7080 80 ）。）。v菌種最好培養(yǎng)至對數(shù)生長期。菌種最好培養(yǎng)至對數(shù)生長期。v使用液體培養(yǎng)基時，可直接加到已滅菌的使用液體培養(yǎng)基時，可直接加到已滅菌的甘油中，使甘油終濃度甘油中，使甘油終濃度10%10%30%30%。v分裝于凍存管中，避免反復(fù)凍融。分裝于凍存管中，避免反復(fù)凍融。v基因工程菌及難以冷凍干燥的絲狀真菌?；蚬こ叹半y以冷凍干燥的絲狀真菌。適用菌種的保藏方法適用菌種的保藏方法v液氮保藏法適用菌種：病毒、支原體、各類液氮保藏法適用菌種

55、：病毒、支原體、各類細菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌、動物細細菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌、動物細胞等。胞等。v甘油低溫保藏法適用菌種：細菌、酵母菌、甘油低溫保藏法適用菌種：細菌、酵母菌、絲狀真菌、基放線菌和基因工程等。絲狀真菌、基放線菌和基因工程等。v液體石蠟覆蓋保藏法適用菌種：真菌、酵母液體石蠟覆蓋保藏法適用菌種：真菌、酵母菌、多種細菌。不適用菌種：乳酸桿菌、分菌、多種細菌。不適用菌種：乳酸桿菌、分枝桿菌等。枝桿菌等。菌種的傳代菌種的傳代v 將在適宜的培養(yǎng)基上生長良好的培養(yǎng)物（庖將在適宜的培養(yǎng)基上生長良好的培養(yǎng)物（庖肉培養(yǎng)基、半固體、高層瓊脂）放置在低溫肉培養(yǎng)基、半固體、高層瓊脂）放置在低溫

56、處保存，使細菌停止生長或緩慢生長。處保存，使細菌停止生長或緩慢生長。v當(dāng)培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分被利用完以前或尚未陳當(dāng)培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分被利用完以前或尚未陳舊以前，將它重新移植于新鮮培養(yǎng)基，再于舊以前，將它重新移植于新鮮培養(yǎng)基，再于適宜條件培養(yǎng)，生長良好后，再置低溫保存。適宜條件培養(yǎng)，生長良好后，再置低溫保存。菌種的傳代菌種的傳代 v最好每株接種兩管以上，需定期移種。最好每株接種兩管以上，需定期移種。v培養(yǎng)基表面需加滅菌液體石蠟，用橡皮塞代培養(yǎng)基表面需加滅菌液體石蠟，用橡皮塞代替棉塞，以防止干燥脫水。替棉塞，以防止干燥脫水。v傳代菌株采用斜面、穿刺方法、液體。傳代菌株采用斜面、穿刺方法、液體。v多數(shù)菌株

57、要求保藏溫度為多數(shù)菌株要求保藏溫度為4 45 5。 v反復(fù)傳代后，在使用前需進行確認試驗。反復(fù)傳代后，在使用前需進行確認試驗。v一般一般1 1個月個月6 6個月傳代一次。個月傳代一次。v適用菌種：適用菌種：大腸、沙門、銅綠、金葡、生孢、枯大腸、沙門、銅綠、金葡、生孢、枯草、短小、藤黃、白念、黑曲等。草、短小、藤黃、白念、黑曲等。菌種檢查和復(fù)壯菌種檢查和復(fù)壯v經(jīng)過長期保藏和傳代的菌種，由于種種原因經(jīng)過長期保藏和傳代的菌種，由于種種原因易發(fā)生衰退、變異或死亡，因此各類菌種在易發(fā)生衰退、變異或死亡，因此各類菌種在保藏期間必須定期檢查，發(fā)現(xiàn)變異或衰退，保藏期間必須定期檢查，發(fā)現(xiàn)變異或衰退，應(yīng)及時給予恢

58、復(fù)。應(yīng)及時給予恢復(fù)。v定期檢查：定期檢查： 在一定間隔時間需重新復(fù)活、分在一定間隔時間需重新復(fù)活、分離、純化、鑒定再保藏。離、純化、鑒定再保藏。v檢查項目：菌落形態(tài)、革蘭染色、顯微鏡下檢查項目：菌落形態(tài)、革蘭染色、顯微鏡下菌體形態(tài)、生化特性及血清學(xué)檢查。菌體形態(tài)、生化特性及血清學(xué)檢查。 防止菌種衰退防止菌種衰退v控制傳代次數(shù)?？刂苽鞔螖?shù)。v采用有效的菌種保藏方法。采用有效的菌種保藏方法。v創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件。創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件。v利用不同類型細胞進行接種傳代。利用不同類型細胞進行接種傳代。菌種的復(fù)蘇菌種的復(fù)蘇v對已保藏的菌種進行恢復(fù)培養(yǎng)，使其恢復(fù)至對已保藏的菌種進行恢復(fù)培養(yǎng)，使其恢復(fù)至保藏前

59、狀態(tài)。保藏前狀態(tài)。v液氮超低溫保存：配置合適的培養(yǎng)基；解凍液氮超低溫保存：配置合適的培養(yǎng)基；解凍與恢復(fù)培養(yǎng)（迅速放入與恢復(fù)培養(yǎng)（迅速放入38384040水浴中震水浴中震蕩蕩5 51010min min 解凍）；開啟安瓿，將菌種移入解凍）；開啟安瓿，將菌種移入相應(yīng)的培養(yǎng)基中，在適宜的溫度下培養(yǎng)。相應(yīng)的培養(yǎng)基中，在適宜的溫度下培養(yǎng)。菌種的復(fù)蘇菌種的復(fù)蘇v使用真空冷凍干燥保存：開啟安瓿瓶，滴使用真空冷凍干燥保存：開啟安瓿瓶，滴入無菌生理鹽水或營養(yǎng)肉湯入無菌生理鹽水或營養(yǎng)肉湯0.5ml0.5ml，溶解，溶解后搖勻，懸液移入相應(yīng)的培養(yǎng)基中，在適后搖勻，懸液移入相應(yīng)的培養(yǎng)基中，在適宜的溫度下培養(yǎng)。宜的溫度

60、下培養(yǎng)。v冷凍菌種復(fù)原：使用復(fù)蘇培養(yǎng)液，對活性冷凍菌種復(fù)原：使用復(fù)蘇培養(yǎng)液，對活性較弱的菌種（弧菌屬）可另加入其他物質(zhì)較弱的菌種（弧菌屬）可另加入其他物質(zhì)提高存活率。提高存活率。菌種的使用菌種的使用 v專人負責(zé)專人負責(zé)v詳細登記詳細登記v定期移種定期移種v安全管理安全管理v確認實驗確認實驗v復(fù)壯復(fù)壯v注意事項注意事項菌種的使用菌種的使用v傳代保藏的菌種，最多使用到第五代，每次傳代保藏的菌種，最多使用到第五代，每次轉(zhuǎn)接盡量擴大子代管數(shù)。轉(zhuǎn)接盡量擴大子代管數(shù)。v經(jīng)冷凍保存的菌種，復(fù)蘇時應(yīng)一次用完，避經(jīng)冷凍保存的菌種，復(fù)蘇時應(yīng)一次用完，避免反復(fù)凍融。免反復(fù)凍融。v菌種使用完畢，應(yīng)按規(guī)定方法滅菌后棄置