試驗(yàn)七氨基酸的分離鑒定

1、實(shí)驗(yàn)七氨基酸的分離鑒定紙層析法一、目的通過氨基酸的分離，學(xué)習(xí)紙層析法的基本原理及操作方法。二、?原理紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法， 它是利用 不同的氨基酸在展層溶劑中的分配系數(shù)不同而得以分離的一種 方法。惰性支持物是新華一號(hào)濾紙， 其上含有很多的羥基， 與水有 較強(qiáng)的親和力因此把它看成是含有靜止水相的惰性支持物。 水相 因此稱為靜止相（固定相） ，有機(jī)溶劑稱為流動(dòng)相。展層溶劑由兩個(gè)互不相溶的有機(jī)溶劑和水組成， 它們互相混 合時(shí)便分成兩相： 一相是以水飽和了的有機(jī)相， 另一相是以有機(jī) 溶劑飽和了的水相。分配系數(shù)（a ）=溶質(zhì)在固定相的濃度/溶質(zhì)在流動(dòng)相的濃度。當(dāng)用濾紙進(jìn)行分配層析時(shí)

2、， 流動(dòng)相流經(jīng)支持物時(shí)與固定相之 間連續(xù)抽提，使氨基酸在兩相之間不斷分配而得以分離。不同的氨基酸在一定的條件下，有其一定的 Rf 值，故可根 據(jù) Rf 值定性鑒定氨基酸，但通常用已知的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸層析作對(duì) 照，本實(shí)驗(yàn)就是如此。紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法。層析溶劑由有機(jī)溶劑和水組成物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上的位置是用 Rf 值（比移值） 來表示的：Rf= 原點(diǎn)到層析點(diǎn)中心的距離 / 原點(diǎn)到溶劑前沿的距離 在一定的條件下某種物質(zhì)的 Rf 值是常數(shù)。 Rf 值的大小與 物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)；層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因 素有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)利用紙層析法分離氨基酸。三、材料與方法（1）、

3、材料：層析缸；毛細(xì)管；噴霧器；培養(yǎng)皿；層析濾紙； 正丁醇；冰醋酸；分液漏斗；燒杯；培養(yǎng)皿；賴氨酸；脯氨酸； 氨酸；苯丙氨酸；亮氨酸；茚三酮（2）操作步驟1. 配置層析液置于密閉的層析缸中。2準(zhǔn)備濾紙：取層析濾紙一張。在紙的一端距邊緣2cm 處用鉛筆劃一直線，在直線上每間隔2cm做一記號(hào)，標(biāo)出5個(gè)原點(diǎn)。3點(diǎn)樣：用毛細(xì)管將各氨基酸樣品點(diǎn)在5 個(gè)原點(diǎn)上，用量1020卩l(xiāng)，每點(diǎn)在紙上擴(kuò)散的直徑，最大不超過3mm邊點(diǎn)樣邊用電吹風(fēng)吹干，越小越好。干后再點(diǎn)一次。4擴(kuò)展 ?用線將濾紙縫成筒狀，紙的兩邊不能接觸。將盛 有約20mL擴(kuò)展劑的培養(yǎng)皿迅速置于密閉的層析缸中，并將濾紙 直立于培養(yǎng)皿中 （ 點(diǎn)樣的一端在下

4、，擴(kuò)展劑的液面需低于點(diǎn)樣線 1cm）。待溶劑上升1520cm時(shí)即取出濾紙，鉛筆描出溶劑前沿 界線，自然干燥或用吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)吹干。5.顯色？?用噴霧器均勻噴上0。1 %茚三酮正丁醇溶液，然 后置烘箱中烘烤5分鐘(100 C )或用熱風(fēng)吹干即可顯出各層析斑 點(diǎn)。6 .計(jì)算各種氨基酸的 Rf值四、結(jié)果與分析樣品上升高度(cm)R值層析液7.23賴氨酸1.880.24脯氨酸2.930.43亮氨酸4.320.62纈氨酸3.750.51苯丙氨酸4.020.59混合氨基酸1.85、2.63、3.880.34、0.47、0.61表1在顯色反應(yīng)中，脯氨酸與茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)，其余皆為紫色，因?yàn)楦彼釣閬啺被?/p>

5、，與茚三酮反應(yīng)并不釋放氨氣， 而直接產(chǎn)生黃色物質(zhì)?；旌习被嵋欢ㄓ匈嚢彼岷透彼?，可能有纈氨酸和苯丙氨酸， 因?yàn)楦彼崤c茚三酮反應(yīng)生成黃色物質(zhì)，賴氨酸、亮氨酸、纈氨 酸和苯丙氨酸與茚三酮反應(yīng)生成紫色物質(zhì)。五、討論與結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵是層析液的制備， 點(diǎn)樣點(diǎn)要小。 由于層析時(shí)間較短， 混合氨基酸沒有完全分開，所以本次實(shí)驗(yàn)失敗。六、思考題1. 何為紙層析法？ 答：紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法。2. 何謂 Rf 值？影響 Rf 的主要因素是什么？ 答：（1）氨基酸被分離后在紙層析圖譜上的位置是用Rf 值（ 比移）來表示的：Rf?=?原點(diǎn)到層析中心的距離？/?原點(diǎn)到溶劑前沿的距 離。（2

6、）在一定的條件下某種物質(zhì)的Rf 值是常數(shù)。 Rf 值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因 素有關(guān)。3. 怎樣制備擴(kuò)展劑？答：擴(kuò)展劑？800-1000mL是4份水飽和的正丁醇和1份醋酸的混 合物。將20?mL正丁醇和5?mL冰醋酸放人分液漏斗中，與 15mL 水混合，充分振蕩，靜置后分層放出下層水層。取漏斗內(nèi)的擴(kuò)展 劑約5mL置于小燒杯中做平衡溶劑，其余的倒人培養(yǎng)皿中備用。4. 層析缸中平衡溶劑的作用是什么？ 答：(1)防止或減少邊緣效應(yīng)的出現(xiàn) . 所謂邊緣效應(yīng) , 是指并列點(diǎn) 樣的同一物質(zhì)經(jīng)薄層展開后薄板邊緣處的比移值比中間的要大 的現(xiàn)象。(2)平衡劑起到使紙層析上

7、吸附的溶劑達(dá)到飽和。是物 質(zhì)在展開劑和紙層析上吸附的溶劑中溶解度不同而進(jìn)行分離。七、參考文獻(xiàn)1、 牛文琪張慶國汪宏喜吳堅(jiān) . 氨基酸的分離與分析 "實(shí)驗(yàn)教學(xué) 設(shè)計(jì) J. 中國電力教育 .2009,(16):127-1282、黎景麗，文一彪 . 對(duì)氨基酸的分離及其顯色的研究 J. 中國 調(diào)味品 .2002,(2):8-123、翁連進(jìn)，王士斌，蔡曉 . 混合氨基酸的分離技 J. 化工進(jìn) 展.2000,19(2):51-534、營愛玲，王建，王曉琳 . 納濾膜對(duì)氨基酸的分離研究 D. 北 京科技大學(xué)學(xué)報(bào) .2004,26(6):642-6475、馬立周 . 生物轉(zhuǎn)化制備 L- 絲氨酸的研究 D. 江南大學(xué)碩士 學(xué)位論文 ,20086、付勇 . 蘇氨酸母液中氨基酸的分離純化研究 D. 江南大學(xué) 碩士學(xué)位論文 .20077、吳國華，林山杉，王為民 . 味精廢液中堿性氨基酸的分離 J.發(fā)酵科技通訊 .2009,38(3):6-98、王立華，王永利，吳江. 養(yǎng)液中多種氨基酸的分離與測定 J. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào) .2009,25(13):26-329、楊曉玲，趙宗云，劉永軍 . 用紙層析分離鑒定氨