抗vegf受體單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用

1、抗抗 vegf 受體單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用受體單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用CN 101245106 B摘要摘要本發(fā)明涉及一種人源抗 VEGF 受體 II 單克隆抗體。提供了單克隆抗體的免疫球蛋白重鏈和輕鏈氨基酸序列，該單克隆抗體的制備方法和在制備抑制血管生長(zhǎng)藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的單克隆抗體適用于制備治療腫瘤和視網(wǎng)膜病變的藥物。 權(quán)利要求權(quán)利要求(8)1. 一種血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體 2 的單克隆抗體，具有 SEQ ID No. 1 所示的免疫球 蛋白重鏈氨基酸序列和 SEQ ID NO 2 所述的免疫球蛋白輕鏈氨基酸序列。2. 一種編碼權(quán)利要求 1 所述單克隆抗體的 DNA。3.根據(jù)權(quán)

2、利要求 2 所述的 DNA，其特征在于，所述的 DNA 序列為 cDNA。4. 一種含有權(quán)利要求 2 所述 DNA 的核酸載體序列。5. 一種攜帶權(quán)利要求 2 所述 DNA 的宿主細(xì)胞。6.權(quán)利要求 1 所述單克隆抗體的制備方法，依次包括如下步驟：(1)逆轉(zhuǎn)錄權(quán)利要求 5 所述的宿主細(xì)胞的總 RNA，獲得 cDNA ；(2)利用 SEQ ID No. 3 或 SEQ ID No. 4 為反向引物，以步驟所述的 cDNA 為模板，通 過(guò) PCR 擴(kuò)增獲得血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體 2 抗體重鏈和輕鏈的DNA 序列；(3)將步驟（2)所述的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體 2 抗體重鏈和輕鏈的 DNA 序列

3、分別 插入到哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒；(4)將步驟 C3)所述的質(zhì)粒純化，通過(guò)共轉(zhuǎn)染 CHO 細(xì)胞得到從質(zhì)粒表達(dá)的重組抗體； 或者，依次包括如下步驟：(1)將權(quán)利要求 3 所述的 cDNA 插入到編碼有二氫葉酸還原酶的質(zhì)粒，使重鏈和輕鏈的 cDNA 位于同一質(zhì)粒，并且分別由各自的 CMV 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，二氫葉酸還原酶基因由 SV40 早期 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)；(2)提取步驟（1)所述的質(zhì)粒并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)人二氫葉酸還原酶缺陷的 CHO 細(xì)胞；(3)選擇性培養(yǎng)經(jīng)過(guò)消化的步驟（所述的 CHO 細(xì)胞，篩選高表達(dá)的細(xì)胞株；(4)將步驟 C3)獲得的細(xì)胞株進(jìn)行 MTX 梯度加壓，MTX 濃度最終加至500-2000nM，選擇表

4、達(dá)量最高的克隆。7. 一種用于制備抑制血管生長(zhǎng)藥物的組合物，包含治療有效濃度的權(quán)利要求 1 所述單 克隆抗體和藥學(xué)上可接受的載體。8.根據(jù)權(quán)利要求 7 所述的組合物，其特征在于，所述的治療有效濃度范圍為靜脈注射 每千克體重 0. 1IOOmg 或眼內(nèi)玻璃體注射每眼 0. 01lOOmg。說(shuō)明說(shuō)明抗 VEGF 受體單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域0001 本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種單克隆抗體。 背景技術(shù)0002 血管新生（angiogenesis)是指從已經(jīng)存在的血管上生長(zhǎng)出新的血管的過(guò)程。對(duì) 絕大多數(shù)成年個(gè)體的器官來(lái)說(shuō)，正常情況下并無(wú)血管的新生。血管新生在正常生理狀況下 只見(jiàn)于極

5、少數(shù)的組織器官，例如月經(jīng)周期中的子宮內(nèi)膜等。但在某些病理狀態(tài)下，例如腫瘤 和創(chuàng)傷修復(fù)等過(guò)程中，可發(fā)生血管新生。業(yè)已證明，在腫瘤等疾病，血管新生是疾病發(fā)展過(guò) 程中的重要步驟。如果能抑制血管新生，便可阻止腫瘤等疾病的病情發(fā)展，從而達(dá)到治療 疾病之目的(Folkman, 2002, Role of angiogenesis in tumor growth and metastasis, Semin Oncol. 29(6Suppl 16) :15-8 ；Witmer et al. ,2003, Vascularendothelial growth factors and angiogenesis i

6、n eye disease, Prog RetinEye Res. 22:129。0003 血管新生受多種因子的調(diào)控，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascularendothelial cell growth factor, VEGF)是誘導(dǎo)血管新生的關(guān)鍵因子(Leung etal.，1989，Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenicmitogen, Science,246 ： 1306-1309 ；Ferrara et al.,2003, The biology ofVEGF and its receptors, N

7、ature Medicine 9:669-676)。VEGF 是一種多肽，可由多種細(xì)胞分泌產(chǎn)生，在腫瘤細(xì)胞 VEGF 的表 達(dá)量尤其高。且其表達(dá)量與腫瘤的惡性程度成正比。VEGF 與位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異受 體相結(jié)合，經(jīng)受體信號(hào)傳遞系統(tǒng)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂增生，形成新的血管。VEGF 可與兩 個(gè)受體結(jié)合，它們分別是 VEGF 受體 I (VEGFRl)和 VEGF 受體 II (VEGFR2)。其中 VEGFR2 是 傳導(dǎo) VEGF 信號(hào)，促進(jìn)血管形成的關(guān)鍵受體（Neufeld et al.，1999，Vascular endothelial growth factor (VEGF)and

8、itsrec 印tors，The FASEB Journal，13 :9-22)。VEGFR2 蛋白分 子由細(xì)胞外區(qū)，跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)三部分組成。VEGF 能與 VEGFR2 的細(xì)胞外區(qū)相結(jié)合，這一結(jié) 合可誘發(fā) VEGFR2 胞質(zhì)區(qū)酪氨酸激酶基團(tuán)的磷酸化，從而啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞，引起血管 內(nèi)皮細(xì)胞的增生、遷移和血管形成，并阻止血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。鑒于 VEGFR2 在促進(jìn)血管 新生信號(hào)傳遞過(guò)程中的關(guān)鍵性作用，抑制 VEGF 與 VEGF2 的結(jié)合便可達(dá)到阻止血管新生，冶 療疾病的作用。具有阻斷 VEGFR2功能的藥物便可用來(lái)治療腫瘤等血新生疾病。0004 單克隆抗體由于特異性強(qiáng)，體內(nèi)半衰期長(zhǎng)，

9、毒副作用小而成為了新一代的藥物形 式。尤其近年來(lái)開(kāi)發(fā)的人源化或全人源單克隆抗體避免了早期鼠源抗體的免疫反應(yīng)問(wèn)題， 是一種理想的藥物形式。在人體內(nèi)存在有成千上萬(wàn)分泌不同抗體的淋巴細(xì)胞。每一個(gè)淋巴 細(xì)胞只表達(dá)一種抗特定抗原決定簇的單克隆抗體。因此每一個(gè)人體內(nèi)都存在一個(gè)龐大的單 克隆抗體庫(kù)。在不同的個(gè)體中，由于接受到刺激的抗原不同，所分泌的抗體亦不盡相同。在 某些個(gè)體，由于自身生理或病理狀況的特殊狀態(tài)，亦可產(chǎn)生抗自身蛋白質(zhì)的抗體。因此分離 能分泌特異性抗體的人淋巴細(xì)胞是制備人源抗體的一個(gè)可行途徑。另外也可以用其他方法 制備全人源單抗，例如用人噬菌體抗體文庫(kù)篩選法或利用人 Ig 轉(zhuǎn)基因鼠等。中國(guó)專(zhuān)利申

10、請(qǐng) 00805856. 3 公開(kāi)了一種與KDR(即 VEGFR2)結(jié)合的，親和性和人類(lèi) VEGF 可比的，能夠中和3KDR 的激活的免疫球蛋白分子，并公開(kāi)了其氨基酸序列。目前尚沒(méi)有與本發(fā)明相同或相近的 氨基酸序列的全人源抗 VEGFR2 單克隆抗體，用于抑制血管增生、治療血管增生性疾病的報(bào) 道。發(fā)明內(nèi)容0005 所要解決的技術(shù)問(wèn)題0006 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種抗 VRGF 受體單克隆抗體及其制備方法和 用途，以填補(bǔ)目前在抗 VRGF 受體單克隆抗體種類(lèi)上的空白，克服現(xiàn)有抗血管新生藥物特異 性和人源化等方面的缺陷。0007 技術(shù)方案0008 本發(fā)明的技術(shù)方案之一是提供一種 VEGF

11、R2 的單克隆抗體，具有 SEQ IDNo. 1 所示 的免疫球蛋白重鏈氨基酸序列和 SEQ ID NO 2 所述的免疫球蛋白輕鏈氨基酸序列，或者添 加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸的同源序列，或其等位基因及其衍生序列所對(duì)應(yīng)的 氨基酸序列。0009 本發(fā)明的技術(shù)方案之二是提供一種編碼上述 VEGFR2 單克隆抗體的 DNA 序列。優(yōu) 選所述的 DNA 序列為 cDNA。0010 本發(fā)明的技術(shù)方案之三是提供一種含有上述 VEGFR2 單克隆抗體的 DNA 序列的核 酸載體序列。所述核酸載體序列是指質(zhì)粒、病毒序列等攜帶有所述 DNA 序列的核酸。0011 本發(fā)明的技術(shù)方案之四是提供一種攜帶上述

12、 VEGFR2 單克隆抗體 DNA 序列的宿主 細(xì)胞。0012 本發(fā)明的技術(shù)方案之五是提供上述全人源抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體 II 的單克隆 抗體的制備方法，依次包括如下步驟：0013 (1)通過(guò)細(xì)胞移植在免疫缺陷的小鼠體內(nèi)擴(kuò)增人源的分泌特異性抗 VEGFR2 抗體 的淋巴細(xì)胞；0014 (2)用步驟所述的淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞相融合，制備分泌單克隆抗體 的雜交瘤細(xì)胞；0015 (3)篩選分離獲得抗 VEGFR2 的雜交瘤細(xì)胞株；0016 或者，依次包括如下步驟：0017 (1)逆轉(zhuǎn)錄宿主細(xì)胞的總 RNA，獲得 cDNA ；0018 (2)利用 SEQ ID No. 3 或 SEQ ID No

13、. 4 為反向引物，以步驟（1)所述的 cDNA 為模 板，通過(guò) PCR 擴(kuò)增獲得 VEGFR2 抗體重鏈和輕鏈的 DNA 序列；0019 (3)將步驟所述的 VEGFR2 抗體重鏈和輕鏈的 DNA 序列分別插入到哺乳動(dòng)物表 達(dá)質(zhì)粒；0020 (4)將步驟（所述的質(zhì)粒純化，通過(guò)共轉(zhuǎn)染 CHO 細(xì)胞得到從質(zhì)粒表達(dá)的重組抗 體；0021 或者，依次包括如下步驟：0022 (1)將帶有 VEGFR2 單克隆抗體編碼序列的 cDNA 插入到編碼有二氫葉酸還原酶 (DHFR)的質(zhì)粒，使重鏈和輕鏈的 cDNA 位于同一質(zhì)粒，并且分別由各自的 CMV 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)， DHFR 基因由 SV40 早期啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)

14、；40023 (2)提取步驟（1)所述的質(zhì)粒并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)人 DHFR 缺陷的 CHO 細(xì)胞；0024 (3)選擇性培養(yǎng)經(jīng)過(guò)消化的步驟（2)所述的 CHO 細(xì)胞，篩選高表達(dá)的細(xì)胞株；0025 (4)將步驟（3)獲得的細(xì)胞株進(jìn)行 MTX 梯度加壓，MTX 濃度最終加至 500-2000nM，選擇表達(dá)量最高的克隆。0026 本發(fā)明的技術(shù)方案之六是提供一種用于制備抑制血管生長(zhǎng)藥物的組合物，包含治 療有效濃度的上述單克隆抗體和藥學(xué)上可接受的載體。優(yōu)選地，所述的治療有效濃度范圍 為靜脈注射每千克體重 0. 1IOOmg 或眼內(nèi)玻璃體注射每眼 0. 01lOOmg。0027 本發(fā)明的技術(shù)方案之七是提供一種中和

15、 VEGFR2 的方法包括，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞施 用有效濃度的上述的抗體使之中和 VEGFR2。0028 本發(fā)明的技術(shù)方案之八是提供一種抑制腫瘤或視網(wǎng)膜血管生長(zhǎng)的方法包括，對(duì)哺 乳動(dòng)物細(xì)胞施用有效濃度的上述的抗體使之中和 VEGFR2。0029 本發(fā)明是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)的：0030 為了制備人源的單克隆抗體，本發(fā)明首先篩選了大量病人的血清，從中發(fā)現(xiàn)了一 例呈抗 VEGFR2 陽(yáng)性的樣品。進(jìn)一步用細(xì)胞移植的方法在免疫缺陷的小鼠擴(kuò)增特異性抗 VEGFR2抗體的淋巴細(xì)胞，再用該淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞相融合制備分泌單克隆抗體的 雜交瘤細(xì)胞。利用這一方法，本發(fā)明分離到了若干抗 VEGFR2 的雜交瘤細(xì)胞株

16、。通過(guò)進(jìn)一步 的實(shí)驗(yàn)，得到了一個(gè)能阻斷 VEGFR2 與其配體 VEGF 相結(jié)合的全人源抗人 VEGFR2 單克隆抗 體。0031 本發(fā)明提供了該抗 VEGFR2 單克隆抗體的氨基酸序列。該單克隆抗體重鏈的氨基 酸序列如 SEQ NO 1，其輕鏈的氨基酸序列如 SEQ NO 2。該單克隆抗體的 DNA 序列從該抗體 的雜交瘤細(xì)胞的 RNA 經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄制備才 DNA 和 PCR 擴(kuò)增后直接獲得。根據(jù)分子生物學(xué)的常識(shí)， 同一氨基酸可由不同的 DNA 序列所編碼.因此，該單克隆抗體可以由不同的 DNA 序列所編 碼，這些序列都屬于本發(fā)明的內(nèi)容之內(nèi)。同時(shí)，根據(jù)抗體的結(jié)構(gòu)知識(shí)，對(duì)抗體的氨基酸序列 作一定的

17、改變后，仍能保持抗體的生物學(xué)活性，有時(shí)氨基酸序列的改變還能增強(qiáng)抗體的生 物學(xué)活性或改善原抗體的某些特牲。因此，可以利用基因工程的方法改變?cè)摽贵w的氨基酸 序列，得到在生化或生物學(xué)特性上與原抗體類(lèi)似或有差別的抗體蛋白質(zhì)。這些改變了氨基 酸序列的抗體是本發(fā)明抗 VEGFR2 抗體的變種，屬于本發(fā)明的內(nèi)容之內(nèi)。0032 在獲得了抗體的 DNA 序列后，可以用基因工程的方法生產(chǎn)該單克隆抗體。一般而 言，可以將編碼有抗體重鏈和輕鏈的 DNA 插入到適當(dāng)?shù)妮d體（vector)內(nèi)。本發(fā)明的實(shí)例中 以細(xì)菌質(zhì)粒（plasmid)為載體。但其他載體也可以用來(lái)表達(dá)或生產(chǎn)該單克隆抗體，例如病 毒，DNA片段等。在載體內(nèi)

18、，編碼抗體的 DNA 閱讀框位于啟動(dòng)子的下游。啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)抗體閱 讀框mRNA 的轉(zhuǎn)錄?？贵w閱讀框包括含有起始密碼和終止密碼。重鏈和輕鏈的 DNA 可以插 入到同一載體中，也可以分別插入到兩個(gè)獨(dú)立的載體。0033 帶有抗體 DNA 序列的載體可以用適當(dāng)?shù)姆椒▽?dǎo)入到宿主細(xì)胞中，用來(lái)表達(dá)重組單 克隆抗體。多種細(xì)胞可用來(lái)作為宿主細(xì)胞。然而，由于單克隆抗體含有糖基化的氨基酸，用 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的抗體具有與自然抗體較似的糖基修飾，因此是比較理想的宿主細(xì)胞。 常用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO)，小鼠骨髓瘤細(xì)胞，HEK293 細(xì)胞，等等。 除此以外，其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞也可用來(lái)表達(dá)該抗體，因此也包

19、括在本發(fā)明的抗體所適用的 宿主細(xì)胞范圍。同時(shí)，也可以用非哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)或生產(chǎn)本發(fā)明所描述的抗體。適用的5 非哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括其他真核生物的細(xì)胞，例如植物細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞，酵母細(xì)胞等任何真核 細(xì)胞。適用的非哺乳動(dòng)物細(xì)胞還包括細(xì)菌，真菌等任何原核生物的細(xì)胞。因此，表達(dá)本發(fā)明 單克隆抗體的宿主細(xì)胞可以是任何真核或原核細(xì)胞。將含有抗體序列的載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞 的方法包括分子生物學(xué)中所用的方法。對(duì)于質(zhì)粒來(lái)說(shuō)，常用的方法有電鉆孔轉(zhuǎn)染法和脂質(zhì) 體轉(zhuǎn)染法等。本發(fā)明采用電鉆孔轉(zhuǎn)染法，但其他許多方法都可以用來(lái)達(dá)到同樣的目的。0034 除了用細(xì)胞培養(yǎng)的方法外，還可以用其他方法生產(chǎn)本發(fā)明的單克隆抗體。根據(jù)生 物技術(shù)的知

20、識(shí)，單克隆抗體可以用轉(zhuǎn)基因的方法在動(dòng)物的器官內(nèi)表達(dá)，例如通過(guò)轉(zhuǎn)基因在 動(dòng)物的乳腺，肌肉和卵等表達(dá)。此外，該單克隆抗體還可以用轉(zhuǎn)基因的方法在植物的器官表 達(dá)，例如轉(zhuǎn)基因植物的葉子等。0035 本發(fā)明還提供了該抗體的從細(xì)胞培養(yǎng)上請(qǐng)液純化的初步工藝。純化后的單克隆抗 體蛋白與制劑輔料相混合，得到最終的單克隆抗體藥物。0036 本發(fā)明還進(jìn)一步用實(shí)施例揭示了該抗體的生物學(xué)活性。0037 有益效果0038 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明該抗體在蛋白質(zhì)水平上能阻斷 VEGF 受體 II 與 VEGF 的結(jié)合，在 細(xì)胞水平上能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生，因此該抗體具有抑制血管新生的作用，可用于治 療腫瘤，視網(wǎng)膜病變，老年性黃斑

21、變性等血管新生疾病。具體實(shí)施方式0039 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定 的范圍。0040 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如：分子克隆操作 手冊(cè) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press)禾口 Antibodies :A

22、Laboratory Manual, (Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press)，等等，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。0041 實(shí)施例 1.人源抗 VEGFR2 單克隆抗體的制備0042 為了制備全人源抗 VEGFR2 抗體，本發(fā)明首先對(duì)病人血清用 ELISA 法篩選抗 VEGF 受體 II 抗件陽(yáng)性的病人。該方法首先用 VEGFR2 重組蛋白質(zhì)包被 96 孔板，用 2%牛血清白 蛋白封閉，加入浠釋的病人血清，再與 HRP 際記的羊抗人抗體反應(yīng)，并用過(guò)氧化物酶底物顯 色，用酶標(biāo)儀讀取 OD 值。利用該方法，篩選到

23、了一個(gè)抗 VEGF 受體 II 抗件陽(yáng)牲的病人。取 該病人外周血，用 Ficoll 密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC)，然后將人 PBMC 移 植入 SCID 小鼠。用純化的 VEGFR2 重組蛋白質(zhì)對(duì)已植入人 PBMC 的 SCID 小鼠進(jìn)行多次免疫。 用 ELISA 確定小鼠血清內(nèi)抗 VEGFR2 的含量。待小鼠血清獲得高效抗 VEGFR2 滴度后，取小 鼠脾臟，分離脾臟細(xì)胞，然后按照雜交瘤技術(shù)的常規(guī)方法將脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓細(xì)胞相融 合。將融合的細(xì)胞在 96 孔板用選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到雜交瘤細(xì)胞克隆。0043 實(shí)例 2.抗 VEGFR2 單抗能有效地與 VEGFR2 結(jié)合00

24、44 在獲得雜交瘤細(xì)胞株后，將雜交瘤細(xì)胞用 RPMI-1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)在 96 孔細(xì)胞 培養(yǎng)板。取各雜交瘤細(xì)胞株的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用 ELISA 法檢測(cè)特異性抗體。該方法用可溶6 性 VEGFR2 重組蛋白質(zhì)包被 ELISA 板，2% BSA 封閉，加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液。清洗后加 入 HRP 標(biāo)記的羊抗人 IgG 抗體。過(guò)氧化物酶底物顯色后，用酶標(biāo)閱讀儀在 650 納米波長(zhǎng)讀 取 OD 值。用該法篩選到了若干分泌抗 VEGFR2 抗體的雜交瘤細(xì)胞株。將分泌抗 VEGFR2特 異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株在六孔細(xì)胞培養(yǎng)板及 T175 培養(yǎng)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)。收集雜交瘤細(xì)胞培 養(yǎng)上請(qǐng)液。用 IgG

25、亞型 ELISA 試劑盒 anvitrogen 公司）確定各雜交瘤細(xì)胞株分泌抗體的 亞型，以相應(yīng)亞型的純化 IgG 作標(biāo)淮曲線(xiàn)用 ELISA 方法確定細(xì)胞培養(yǎng)上請(qǐng)液中抗體的含量。 將各上清液的抗體調(diào)節(jié)至相同濃度，并進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?ELISA 方法比較各單抗與 VEGFR2 的結(jié)合能力，確定具高親和力的抗體克隆。用這一方法，本發(fā)明獲得若干株對(duì) VEGFR2 具高 親和力的單克隆抗體克隆。0045 實(shí)例 3.抗 VEGFR2 單抗能完全阻斷 VEGFR2 與 VEGF 的結(jié)合0046 經(jīng)初篩得到具有高親和力的抗 VEGFR2 抗體雜交瘤后，本發(fā)明進(jìn)一步確定了這些 抗體對(duì) VEGF 與 VEGFR

26、2 的結(jié)合的阻斷能力。將 96 孔酶標(biāo)板用 VEGF 包被，加 BSA 封閉酶標(biāo) 板。同時(shí)，在另一酶標(biāo)板將待測(cè)的單克隆抗體與 VEGFR2 重組蛋白相混合，置 37C 反應(yīng) 1 小時(shí)，將單抗和 VEGFR2 的混合物加入到上述封閉洗滌后的 ELISA 板內(nèi)。孵育并洗滌后，加 入 HRP 標(biāo)記山羊抗人 IgG Fe。孵育并洗滌。加入底物液，用酶標(biāo)閱讀儀在 650 納米波長(zhǎng)讀 取 OD 值。經(jīng)此法獲得了一株能完全阻斷 VEGFR2 與 VEGF 結(jié)合的抗 VEGFR2 單克隆抗體克隆 AC88。用人單克隆亞型抗體檢測(cè)，確定 AC88 抗體是人 IgGl 亞型。0047 實(shí)例 4.抗 VEGFR2

27、單抗能完全阻斷 VEGF 誘導(dǎo)的 HUVEC 細(xì)胞分裂增生0048 為了證明這一新的抗 VEGFR2 單抗的抗血管新生作用，本發(fā)明進(jìn)一步檢測(cè)了其對(duì) 血管內(nèi)皮細(xì)胞增生的作用。人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)是血管新生研究中最常用的體 外細(xì)胞培養(yǎng)模形。由于 HUVEC 表面具有 VEGF 受體，HUVEC 細(xì)胞可在 VEGF 刺激下發(fā)生分裂增 生，因此可以利用這一體外細(xì)胞培養(yǎng)模型確定抗體對(duì) VEGF 受體的中和能力。在此實(shí)驗(yàn)中， 將 HUVEC 細(xì)胞接種于 M 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，24 小時(shí)后，換含有每毫升 5-20ng VEGF 的基礎(chǔ)培養(yǎng) 基，加入不同濃度（0. l-5yg/ml)的 AC88 抗

28、體，在 37 攝氏度 10 %的二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù) 培養(yǎng)。48 小時(shí)后消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)。對(duì)照組加入不同濃度的正常 IgG。結(jié)果顯示，在加入了 每毫升 1 微克的抗 VEGFR2 單抗的培養(yǎng)孔中，HUVEC 細(xì)胞分裂受到完全抑制，而在加入了同 濃度正常 IgG 的對(duì)照組中，HUVEC 細(xì)胞分裂沒(méi)有受到影響。因此，本發(fā)明所獲得的抗 VEGFR2 單抗能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生，從而能抑制血管的新生。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)克隆 AC88 抗 體對(duì)鼠 VEGFR2 無(wú)結(jié)合能力，因此不宜用小鼠實(shí)驗(yàn)評(píng)估該抗體在體內(nèi)的生物學(xué)活性。0049 實(shí)例 5.抗 VEGFR2 單克隆抗體的基因克隆及重組抗體蛋白質(zhì)在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

29、中的 表達(dá)0050 雜交瘤細(xì)胞不適于單克隆抗體的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。為了表達(dá)重組單克隆抗體， 本發(fā)明利用分子生物學(xué)方法克隆了 AC88 的 DNA 序列。由于抗體的可變區(qū)是未知序列，本發(fā) 明用cDNA 末端快速擴(kuò)增法（Rapid amplification ofcDNA ends,RACE)獲得重鏈和輕鏈的 DNA 序列。取培養(yǎng)的 AC88 雜交瘤細(xì)胞，用總 RNA 試劑盒（Promega 公司）提取細(xì)胞總 RNA， 再用逆轉(zhuǎn)錄酶（BDBiosciences 公司)制備 cDNA。用 PCR 從 AC88 的 cDNA 用 RACE cDNA 擴(kuò) 增試劑盒（BD Biosciences 公司）擴(kuò)

30、增抗體重鏈和輕鏈的 DNA 序列。PCR 反應(yīng)的正向引物 來(lái)自試劑盒，反向引物為 IgGl 重鏈恒定區(qū)末端序列（SEQ IDNO 幻或 kappa 輕鏈末端序列 (SEQ ID NO 4)。PCR 反應(yīng)條件為根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)定。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳監(jiān)定。7 然后，將 PCR 產(chǎn)物插入 TA cloning 載體（Invitrogen 公司）。用限制性?xún)?nèi)切酶消化確定含插 入片斷的克隆。所得質(zhì)粒經(jīng) DNA 測(cè)序確定插入片斷的 DNA 序列，從而獲得了 AC88 的重鏈和 輕鏈的 DNA 序列。進(jìn)一步的序列分析顯示所獲得的抗體重鏈序列中含有 IgG 可變區(qū)和恒定 區(qū)，輕鏈序列含 kappa 輕

31、鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)。AC88 的重鏈恒定區(qū)序列與人 IgGl 相一致。 將確證后的抗體重鏈或輕鏈 DNA 用內(nèi)切酶消化，分別插入到哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3. 1。 將含有抗體重鏈或輕鏈 cDNA 的 pcDNA3. 1 質(zhì)粒純化，用 Iipofectamine 試劑盒 Qnvitrogen 公司）將重鏈和輕鏈質(zhì)粒 DNA 共轉(zhuǎn)染入 CHO 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后 48-72 小時(shí)后用 ELISA 法檢測(cè)上 清液中抗體的含量。經(jīng)此法本發(fā)明得到了從質(zhì)粒表達(dá)的 AC88 重組抗體，說(shuō)明 AC88 可用基 因工程的方法生產(chǎn)。0051 實(shí)例 6.抗 VEGFR2 單克隆抗體高效表達(dá)細(xì)胞株的建立0052 為了高