腫瘤細胞與分化、凋亡一

1、腫瘤細胞與分化、凋亡(一)源于一位權(quán)威專家的課件，和大家一起分享前 言細胞分化與腫瘤細胞分化與腫瘤一、腫瘤細胞誘導(dǎo)分化的有關(guān)概念一、腫瘤細胞誘導(dǎo)分化的有關(guān)概念1. 分化分化(differentiation） 細胞分化是指幼稚的胚胎細胞生長發(fā)育為各種不同形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能代謝的成熟細胞的過程。如人起源于一個受精卵，通過細胞分裂形成內(nèi)、中、外三個胚層細胞。2. 反分化反分化 (retro-differentiation) 又稱去分化又稱去分化(dedifferentiation)，腫瘤的反分化，腫瘤的反分化是指細胞惡變后，細胞的多種表型又回到胚胎細胞是指細胞惡變后，細胞的多種表型又回到胚胎細胞表型的現(xiàn)

2、象表型的現(xiàn)象。惡性腫瘤細胞表現(xiàn)分化異常，不成熟。惡性腫瘤細胞表現(xiàn)分化異常，不成熟。3.3.再分化再分化（redifferentiation） 又稱逆轉(zhuǎn)又稱逆轉(zhuǎn)（reversion），），它是指在分化誘它是指在分化誘導(dǎo)劑的作用下，惡性腫瘤細胞被誘導(dǎo)而重新向?qū)┑淖饔孟?，惡性腫瘤細胞被誘導(dǎo)而重新向正常細胞的方向演變分化，表現(xiàn)為形態(tài)學(xué)、生正常細胞的方向演變分化，表現(xiàn)為形態(tài)學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)等諸多指標(biāo)均向正常細胞接近，物學(xué)、生物化學(xué)等諸多指標(biāo)均向正常細胞接近，甚至完全轉(zhuǎn)變?yōu)檎＜毎?。甚至完全轉(zhuǎn)變?yōu)檎＜毎?。二、分化誘導(dǎo)劑二、分化誘導(dǎo)劑1.1.內(nèi)源性分化誘導(dǎo)劑內(nèi)源性分化誘導(dǎo)劑 內(nèi)源性分化誘導(dǎo)劑是由腫瘤

3、或宿主細胞產(chǎn)生的具有分內(nèi)源性分化誘導(dǎo)劑是由腫瘤或宿主細胞產(chǎn)生的具有分化誘導(dǎo)作用的化學(xué)物質(zhì)。它有以下幾種：化誘導(dǎo)作用的化學(xué)物質(zhì)。它有以下幾種：集落刺激因子（集落刺激因子（csf）：分為）：分為csf-m和和csf-g；粒細胞巨噬細胞分化因子（粒細胞巨噬細胞分化因子（gmdf）；）；類固醇類化合物：如糖皮質(zhì)激素和類固醇類化合物：如糖皮質(zhì)激素和1，25-（oh）2-vitd3；細胞因子細胞因子:如如tnf-和和inf-；糖脂糖脂:如神經(jīng)節(jié)苷脂如神經(jīng)節(jié)苷脂gm3；其它，如其它，如camp等。等。2.2.外源性分化誘導(dǎo)劑外源性分化誘導(dǎo)劑 可分為以下幾類：可分為以下幾類：無機化合物：亞硒酸鈉等。無機化合物

4、：亞硒酸鈉等。簡單的有機化合物：正丁酸、二甲基亞砜簡單的有機化合物：正丁酸、二甲基亞砜(dmso)、六次、六次甲基二乙酰胺甲基二乙酰胺(hmba)等。等。維生素維生素a類化合物：維甲酸、類化合物：維甲酸、am80、芳維甲等。、芳維甲等。佛波酯類化合物：佛波酯類化合物：12-o-十四酯酰佛波十四酯酰佛波-13-乙酸乙酸(tpa)?？股仡悾悍啪€菌素抗生素類：放線菌素d、絲裂霉素等；、絲裂霉素等；抗癌藥：抗癌藥：6-巰基嘌呤、巰基嘌呤、5-氮胞嘧啶等。氮胞嘧啶等。 三、誘導(dǎo)腫瘤分化的研究、誘導(dǎo)腫瘤分化的研究 1.1.體外分化誘導(dǎo)模型體外分化誘導(dǎo)模型(1)(1)白血病細胞分化誘導(dǎo)模型白血病細胞分化誘

5、導(dǎo)模型 最常用的是急性最常用的是急性髓性髓性白血病細胞株白血病細胞株hl-60。它在分化誘。它在分化誘導(dǎo)劑作用下可出現(xiàn)分化表型如形態(tài)上由早幼粒白血病細胞分化導(dǎo)劑作用下可出現(xiàn)分化表型如形態(tài)上由早幼粒白血病細胞分化為中、晚幼粒、桿狀核細胞和分葉核細胞，生化方面出現(xiàn)硝基為中、晚幼粒、桿狀核細胞和分葉核細胞，生化方面出現(xiàn)硝基藍四氮唑還原性（藍四氮唑還原性（nbt），功能方面出現(xiàn)吞噬活性及趨化性，），功能方面出現(xiàn)吞噬活性及趨化性，生物學(xué)方面喪失了在軟瓊脂培養(yǎng)基上形成集落及裸鼠體內(nèi)移植生物學(xué)方面喪失了在軟瓊脂培養(yǎng)基上形成集落及裸鼠體內(nèi)移植成活的能力。成活的能力。 人胃癌分化誘導(dǎo)模型人胃癌分化誘導(dǎo)模型 國內(nèi)

6、外有人用dmso、hmba、suramin、維甲酸、大蒜油及大蒜與其烯丙基硫化合物等處理胃癌細胞株時，癌細胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能代謝和生物學(xué)等方面均出現(xiàn)分化特征。 人神經(jīng)母細胞瘤分化誘導(dǎo)實驗人神經(jīng)母細胞瘤分化誘導(dǎo)實驗 在正丁酸、苯丁酸及其鹽類作用后，瘤細胞可形成樹突狀結(jié)構(gòu)，功能上能產(chǎn)生神經(jīng)遞質(zhì)合成酶，生物學(xué)上其致瘤性明顯降低，表現(xiàn)出分化的特點。 人粘液表皮樣癌分化誘導(dǎo)實驗人粘液表皮樣癌分化誘導(dǎo)實驗 mec-1細胞是上皮樣細胞，體外增殖迅速，形態(tài)異型性明顯，裸鼠體內(nèi)成瘤性，在hmba的作用下出現(xiàn)分化表型：生長抑制、核異型性降低、表面微絨毛減少、胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增加和出現(xiàn)特征性的成熟分泌顆粒、dna含

7、量減少及倍體趨向二倍體等。 其它實體瘤分化誘導(dǎo)模型其它實體瘤分化誘導(dǎo)模型 其它實體瘤如黑色素瘤、肝癌、前列腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤、肺癌等均有報道。 2.2.體內(nèi)分化誘導(dǎo)模型體內(nèi)分化誘導(dǎo)模型 目前，體內(nèi)分化誘導(dǎo)尚無理想的模型。人白血病細胞一般采用小鼠腹腔擴散法及裸鼠皮下移植法;人實體瘤采用小鼠腎包膜下移植和裸鼠移植建立分化誘導(dǎo)模型。分化誘導(dǎo)效果主要根據(jù)腫瘤生長抑制和荷瘤鼠生命延長，細胞標(biāo)記酶、抗原以及形態(tài)的變化來判斷。國內(nèi)用nb4細胞株建立了scid小鼠人apl腹水細胞模型，在atra作用下能發(fā)生分化，如明顯提高nbt還原率和cd11b的表達，小鼠的生存期明顯延長。該模型的建立是評價新的或已有的治療

8、apl藥物和臨床前期實驗研究的理想模型。3.3.分化誘導(dǎo)的臨床試驗分化誘導(dǎo)的臨床試驗 盡管誘導(dǎo)分化研究取得了成績，但其最終目的是能應(yīng)用于臨床，atra治療apml能有效地達到臨床緩解，被認為是人類惡性腫瘤分化治療的成功典范。atra能誘導(dǎo)apl病人惡性腫瘤細胞分化成熟，口服atra可使大多數(shù)患者達到完全臨床緩解，即使是傳統(tǒng)化療失敗后亦是如此。在歐洲的隨機實驗證實，atra加化療比單用化療方案能明顯降低復(fù)發(fā)率和延長生存期。四、誘導(dǎo)腫瘤細胞分化的調(diào)控機制四、誘導(dǎo)腫瘤細胞分化的調(diào)控機制1.1.核內(nèi)受體途徑核內(nèi)受體途徑 維甲類化合物誘導(dǎo)腫瘤細胞分化主要通過核內(nèi)受體途徑。維甲酸受體(rar)是廣泛存在各

9、種組織細胞核內(nèi)的一類受體蛋白，有rars和rxrs兩類，每一類又有、三種類型，比較其dna序列和結(jié)構(gòu)特點，二者屬于類固醇-甲狀腺素-vitd3受體在內(nèi)的核內(nèi)受體超家族。在細胞液內(nèi)存在ra結(jié)合蛋白，能將ra從細胞漿運輸?shù)胶藘?nèi)染色體上的受體部位，自身則釋放回到胞漿。ra經(jīng)胞質(zhì)內(nèi)ra結(jié)合蛋白運輸?shù)饺旧w上的受體部位，與核受體以二聚體形式結(jié)合某些靶序列，進而引起特定基因的轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制來誘導(dǎo)細胞分化。 manfredini 等用atra和vitd3誘導(dǎo)白血病母細胞分化實驗中發(fā)現(xiàn)，m0、m1對二者不敏感，m3在atra誘導(dǎo)下向粒細胞方向分化，m2則在二者誘導(dǎo)下向單核細胞分化。進一步研究方發(fā)現(xiàn)，atr

10、a和vitd3有效地增加核內(nèi)vdr，vdr與rxr形成二聚體，再結(jié)合到dr3型vd反應(yīng)元件，從而激活vd反應(yīng)元件調(diào)控的報告基因的轉(zhuǎn)錄，啟動了m2向單核細胞方向分化。 2. 影響基因轉(zhuǎn)錄影響基因轉(zhuǎn)錄 naka 等用等用9-cis-維甲酸誘導(dǎo)胃癌細胞株分化研究中，發(fā)維甲酸誘導(dǎo)胃癌細胞株分化研究中，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)胃癌細胞株能合成現(xiàn)大多數(shù)胃癌細胞株能合成rars和和rxrs mrna，其中一，其中一些細胞株并不停滯于些細胞株并不停滯于g0/g1期，但可一過性增加期，但可一過性增加p21waf1蛋蛋白表達，降低白表達，降低cdk7、egfr及及cyclind蛋白量，減少蛋白量，減少rb基因基因產(chǎn)物磷酸化。認

11、為產(chǎn)物磷酸化。認為9-cis-維甲酸抑制細胞生長是通過調(diào)控細維甲酸抑制細胞生長是通過調(diào)控細胞周期，影響維甲酸受體胞周期，影響維甲酸受體mrna轉(zhuǎn)錄來實現(xiàn)的。轉(zhuǎn)錄來實現(xiàn)的。 okabe 發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)tpa可誘導(dǎo)可誘導(dǎo)ph陽性白血病細胞陽性白血病細胞 mc3向巨核細向巨核細胞系分化，血小板糖蛋白胞系分化，血小板糖蛋白gpb表達增強，表達增強，gpb mrna水平水平增高，處理組有增高，處理組有g(shù)ata-1表達，而表達，而gata-3不表達，未處理組僅不表達，未處理組僅gata-2轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄。tpa則通過影響則通過影響gpb及及gatas轉(zhuǎn)錄來誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄來誘導(dǎo)mc3細胞分化。細胞分化。 garingo在誘

12、導(dǎo)在誘導(dǎo)mel分化中發(fā)現(xiàn)紅細胞特異性基因轉(zhuǎn)錄活分化中發(fā)現(xiàn)紅細胞特異性基因轉(zhuǎn)錄活化，化，pka缺陷時則轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)障礙。轉(zhuǎn)錄因子缺陷時則轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)障礙。轉(zhuǎn)錄因子nf-e2是提高球蛋是提高球蛋白位點控制區(qū)活性的必須成分。白位點控制區(qū)活性的必須成分。dna與與nf-e2結(jié)合，結(jié)合，-球蛋白球蛋白位點控制區(qū)增強子活性在位點控制區(qū)增強子活性在pka缺陷細胞中明顯低于具有缺陷細胞中明顯低于具有pka活活性的細胞，性的細胞，pka對轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控影響了紅細胞特異基因轉(zhuǎn)錄對轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控影響了紅細胞特異基因轉(zhuǎn)錄而誘導(dǎo)而誘導(dǎo)mel細胞分化。細胞分化。 研究表明，染色質(zhì)重塑在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中有重要作用，而組蛋白乙?；?、去

13、乙酰化修飾是影響染色質(zhì)重塑的重要因素。我們前期研究的基礎(chǔ)上，建立人胃癌mgc803細胞裸鼠移植瘤模型，以被證實有顯著誘導(dǎo)腫瘤細胞分化的藥物丁酸鈉（sodium butyrate, sb）為陽性對照，觀察dads（diallyl disulfide）在體內(nèi)外誘導(dǎo)mgc803細胞分化時，對其核組蛋白乙?；磉_的調(diào)控作用，以及二者之間的關(guān)系，進一步探討dads對mgc803細胞抑制和誘導(dǎo)分化的作用機理。treatment factoresaverage density(od)050100150200250controldads(15mg/l)dads(30mg/l)dads(60mg/l)sb(5m

14、m)sb(5mm) and dads(30mg/l) h3-actindads(mgl-1): 15 30 60 30sb(mm) : 5 5dads對體外培養(yǎng)對體外培養(yǎng)mgc803細胞組蛋白乙酰化的影響細胞組蛋白乙?；挠绊?treatment factoresaverage density(od)050100150200250controldads(15mg/l)dads(30mg/l)dads(60mg/l)sb(5mm)sb(5mm) and dads(30mg/l)h4-actindads(mgl-1) : 15 30 60 30sb(mm) : 5 5dads對體外培養(yǎng)對體外培養(yǎng)m

15、gc803細胞組蛋白乙?；挠绊懠毎M蛋白乙酰化的影響 0 1 5 3 0 6 0 d a d s co n terta tio n s (m g /l )average density(od)02 04 06 08 01 0 01 2 01 4 01 6 01 2 h2 4 hp21waf1-actin 處理時間處理時間 （h） : 12h 24h 12h 24h 12h 24h 12h 24hdads(mgl-1) : 0 0 15 15 30 30 60 60dads對對mgc803細胞細胞p21waf1蛋白表達的影響蛋白表達的影響 dads對各組移植瘤組織中乙?；M蛋白表達的影響對各組

16、移植瘤組織中乙酰化組蛋白表達的影響 groupsaverage density(od)050100150200250nssb(66mg/kg)dads(50mg/kg)dads(100mg/kg)dads(200mg/kg)h3-actin各處理因素各處理因素 ： ns sb dads dads dads濃度濃度(mgkg-1)： 66 50 100 200 groupsaverage density(od)050100150200250nssb(66mg/kg)dads(50mg/kg)dads(100mg/kg)dads(200mg/kg)h4-actin各處理因素各處理因素 ： ns s

17、b dads dads dads濃度濃度(mgkg-1)： 66 50 100 200 dads對移植瘤細胞對移植瘤細胞p21waf1表達的影響表達的影響groupsaverage density(od)020406080100120140160180200nssb(66mg/kg)dads(50mg/kg)dads(100mg/kg)dads(200mg/kg)p21waf1-actin各處理因素各處理因素 ： ns sb dads dads dads濃度濃度(mgkg-1) ： 66 50 100 2003 3. . 對癌基因和抑癌基因的影響對癌基因和抑癌基因的影響 細胞的基因控制細胞的生

18、長與分化，而這些基因的變化細胞的基因控制細胞的生長與分化，而這些基因的變化則影響基因的表達或功能被認為是癌變的主要原因。則影響基因的表達或功能被認為是癌變的主要原因。ras基因基因在細胞內(nèi)有在細胞內(nèi)有h-，k-，n-ras，編碼分子量為，編碼分子量為21kd的蛋白，的蛋白，p21ras蛋白具有蛋白具有g(shù)tp酶活性。酶活性。ras能使能使3t3細胞惡性轉(zhuǎn)化，促細胞惡性轉(zhuǎn)化，促使細胞增殖。使細胞增殖。c-myc過表達可以促進基因轉(zhuǎn)錄和細胞分裂，過表達可以促進基因轉(zhuǎn)錄和細胞分裂，與腫瘤的形成關(guān)系密切。與腫瘤的形成關(guān)系密切。p53基因編碼基因編碼p53蛋白，蛋白，p53蛋白有蛋白有野生型和突變型，野生

19、型野生型和突變型，野生型p53基因具有抑制細胞增殖和轉(zhuǎn)化的基因具有抑制細胞增殖和轉(zhuǎn)化的作用。作用。 李曉光等用大蒜油誘導(dǎo)李曉光等用大蒜油誘導(dǎo)mgc803細胞分化和凋亡研究細胞分化和凋亡研究中，發(fā)現(xiàn)處理組細胞形態(tài)接近正常細胞，細胞的致瘤性明顯中，發(fā)現(xiàn)處理組細胞形態(tài)接近正常細胞，細胞的致瘤性明顯下降，下降，northern雜交有雜交有p53和和p21表達增強，提示大蒜油通表達增強，提示大蒜油通過促進抑癌基因過促進抑癌基因p53、p21的表達，抑制細胞惡性增殖、誘的表達，抑制細胞惡性增殖、誘導(dǎo)凋亡和促進細胞分化。導(dǎo)凋亡和促進細胞分化。 王代樹等用王代樹等用hmba誘導(dǎo)誘導(dǎo)mgc803細胞分化時發(fā)現(xiàn)細

20、胞分化時發(fā)現(xiàn)c-myc和和c-h-ras表達抑制。表達抑制。naka 用用9-順順-維甲酸誘導(dǎo)胃癌細胞分維甲酸誘導(dǎo)胃癌細胞分化時則有化時則有p21蛋白一過性增加。蛋白一過性增加。 這些基因在誘導(dǎo)癌細胞分化過程中的改變進一步影響其這些基因在誘導(dǎo)癌細胞分化過程中的改變進一步影響其調(diào)控的基因表達而實現(xiàn)瘤細胞分化的效應(yīng)。調(diào)控的基因表達而實現(xiàn)瘤細胞分化的效應(yīng)。 我們發(fā)現(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)，dads作用下，作用下，mgc803細胞明顯抑制，且呈細胞明顯抑制，且呈劑量劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系；瘤細胞對效應(yīng)依賴關(guān)系；瘤細胞對con a的凝集率、的凝集率、 集落形成率集落形成率與與alp比活性下降；瘤細胞異形性降低，核漿比下

21、降，細胞比活性下降；瘤細胞異形性降低，核漿比下降，細胞表面微絨毛數(shù)目減少，胞漿內(nèi)細胞器豐富，胞核及部分細胞表面微絨毛數(shù)目減少，胞漿內(nèi)細胞器豐富，胞核及部分細胞器呈退行性變，可見細胞間連接結(jié)構(gòu)；細胞骨架蛋白合成增器呈退行性變，可見細胞間連接結(jié)構(gòu)；細胞骨架蛋白合成增加與重組，細胞間縫隙連接通訊功能恢復(fù)，提示加與重組，細胞間縫隙連接通訊功能恢復(fù)，提示dads可誘導(dǎo)可誘導(dǎo)mgc803細胞分化。細胞分化。dads處理后的處理后的mgc803細胞細胞s期細胞含期細胞含量減少，量減少，g2期細胞含量增加，細胞停滯于期細胞含量增加，細胞停滯于g2期，期，p21waf1、rb表達增強，表達增強，p21ras、c

22、-myc、突變型、突變型p53表達減弱。表達減弱。 表表4 dads 作作用用mgc803 細細胞胞96 小小時時后后od570值值 n6 dads（g/ml） 0對照 45 40 35 30 25 20 x 0.73 0.25 0.27 0.27 0.34 0.46 0.62 s 0.068 0.051 0.024 0.065 0.055 0.049 0.038 抑制率(%) 65.8 63.1 63.1 56.2 37.0 15.1 fig 3 time-dependent growth inhibition effects of dads on mgc803 cells010203040

23、5060708024487296hoursir （%）dmsot8035ug/ml25ug/ml倒置顯微鏡觀察mgc803細胞（細胞（ 20）dads組組 （ 20）普通光鏡觀察 mgc803細胞細胞 he （ 20）dads處理組處理組 he（ 20）電鏡觀察 微絨毛是良惡性細胞區(qū)分的重要標(biāo)志之一，本實驗通過微絨毛是良惡性細胞區(qū)分的重要標(biāo)志之一，本實驗通過透射電鏡和透射電鏡和con a凝集性實驗證實了凝集性實驗證實了mgc803細胞在細胞在dads處理后，細胞表面微絨毛明顯減少，對處理后，細胞表面微絨毛明顯減少，對con a的凝集率下降，的凝集率下降，表明表明mgc803細胞生物學(xué)行為表現(xiàn)出

24、惡性性下降。細胞生物學(xué)行為表現(xiàn)出惡性性下降。 未處理組未處理組mgc803細胞核漿比例大，核仁均質(zhì)，以細胞核漿比例大，核仁均質(zhì)，以1-2個核仁細胞為主；胞質(zhì)內(nèi)細胞器稀少，細胞分化程度低。個核仁細胞為主；胞質(zhì)內(nèi)細胞器稀少，細胞分化程度低。 dads處理的處理的mgc803細胞表面微絨毛減少，細胞核漿細胞表面微絨毛減少，細胞核漿比例下降，胞質(zhì)內(nèi)細胞器豐富，有散在的核糖體，細胞核和比例下降，胞質(zhì)內(nèi)細胞器豐富，有散在的核糖體，細胞核和線粒體水腫退變，細胞之間有腺腔結(jié)構(gòu)形成并可見細胞間連線粒體水腫退變，細胞之間有腺腔結(jié)構(gòu)形成并可見細胞間連接結(jié)構(gòu)，細胞分化好接結(jié)構(gòu)，細胞分化好 。mgc803細胞核漿比例大

25、，核畸形，線粒體水腫（5000倍）圖示圖示dads組組細胞電鏡結(jié)構(gòu)細胞電鏡結(jié)構(gòu)圖示圖示dads組組細胞電鏡結(jié)細胞電鏡結(jié)構(gòu)構(gòu) 結(jié)構(gòu)的破壞及功能的抑制都是細胞轉(zhuǎn)化早期的異常表現(xiàn)，并與細胞增殖失控及其它惡性行為有關(guān)，而微管解聚與dna合成的啟動有關(guān)。本實驗中觀察到dads處理后，mgc803細胞出現(xiàn)微絲微管合成增加與重組裝，呈現(xiàn)規(guī)則的放射狀分布，提示瘤細胞惡性表型下降，表現(xiàn)為去惡化。 mgc803細胞骨架細胞骨架 考馬絲亮藍染色（考馬絲亮藍染色（ 20） dads組細胞骨架組細胞骨架 考馬絲亮藍染色（考馬絲亮藍染色（ 20）細胞結(jié)構(gòu)觀察mgc803細胞骨架呈彌散熒光細胞骨架呈彌散熒光 間接免疫熒光染

26、色（間接免疫熒光染色（ 100）dads組細胞骨架陽性，呈黃組細胞骨架陽性，呈黃綠色熒光環(huán)繞胞核。綠色熒光環(huán)繞胞核。 間接間接免疫熒光染色（免疫熒光染色（ 100） 劃痕標(biāo)記后數(shù)分鐘即可觀察到黃色熒光傳播，人胃癌mgc-803細胞不顯示熒光染料的傳播，表明無間縫隙連接通訊功能。 dads處理后，黃色熒光分布在傷沿細胞列和相鄰的數(shù)列細胞內(nèi)，熒光強度從傷沿細胞列到臨近數(shù)列細胞逐漸減弱，以傷沿細胞列最強，表明間縫隙連接通訊功能恢復(fù) 。 細胞間縫隙連接通細胞間縫隙連接通訊功能訊功能 未處理人胃癌細胞 lucifer yellow 10處理組人胃癌細胞 lucifer yellow 10 mgc803細

27、胞細胞 (+)p53表達表達dads組組 ()p21waf1表達表達dads組組 （）（）mgc803細胞細胞 （）（）mgc803細胞細胞 ()dads組組 （）（）prb表達表達mgc803細胞細胞 （）（）dads組組 （）（）p21ras表達表達mgc803細胞細胞 (+)dads組組 ()c-myc表達表達裸鼠移植瘤裸鼠移植瘤形成實驗形成實驗移植瘤形成實驗移植瘤形成實驗表表1. dads處理后各組裸鼠移植瘤重量變化情況處理后各組裸鼠移植瘤重量變化情況group dose(mg/kg) tumor weight inhibition rate(%)ns-1.150.23-sb660.4

28、40.1461.7 adads500.830.1627.8 adads1000.390.1166.1 bdads2000.310.0873.0 b移植瘤光學(xué)顯微鏡下形態(tài)變化移植瘤光學(xué)顯微鏡下形態(tài)變化 he40(a: 未處理組；未處理組；b: 100mgkg-1dads處理組處理組) groupstumor weight(g)0.0.2.4.6.81.01.21.41.61.8nssb(66mg/kg)dads(50mg/kg)dads(100mg/kg)dads(200mg/kg)pcna-actin 各處理因素各處理因素 ： ns sb dads dads dads濃度濃度(mgkg-1)

29、： 66 50 100 200dads處理移植瘤后處理移植瘤后pcna蛋白表達蛋白表達 ssh技術(shù)成功構(gòu)建技術(shù)成功構(gòu)建dads誘導(dǎo)人胃癌細胞誘導(dǎo)人胃癌細胞mgc803細胞細胞差異表達基因的差異表達基因的cdna文庫。文庫。 差異表達片段差異表達片段dads1，長，長208bp，為人類，為人類-synuclein基因部分序列，其上調(diào)可能與基因部分序列，其上調(diào)可能與dads誘導(dǎo)人胃癌誘導(dǎo)人胃癌mgc803細胞分化相關(guān)。細胞分化相關(guān)。 差異表達片段差異表達片段dads2，長，長272bp，與魚類，與魚類hepcidin-like precursor mrna具有高同源性，其上調(diào)可能與具有高同源性，其

30、上調(diào)可能與dads造成造成細胞內(nèi)低鐵低氧環(huán)境，繼而誘導(dǎo)人胃癌細胞內(nèi)低鐵低氧環(huán)境，繼而誘導(dǎo)人胃癌mgc803細胞分化細胞分化相關(guān)。相關(guān)。 不同濃度的不同濃度的dads可顯著抑制可顯著抑制hl-60細胞的增殖，且細胞的增殖，且與藥物濃度有明顯依賴關(guān)系；與藥物濃度有明顯依賴關(guān)系；0.625-2.5 g/ml時，時，nbt還還原反應(yīng)顯著增強，且在原反應(yīng)顯著增強，且在1.25gml-1時誘導(dǎo)分化作用達峰時誘導(dǎo)分化作用達峰值；值；dads小鼠腎囊膜下移植的小鼠腎囊膜下移植的hl-60細胞具有顯著的生細胞具有顯著的生長抑制作用，并呈劑量依賴關(guān)系，長抑制作用，并呈劑量依賴關(guān)系，21 mg/kg 時抑瘤率達時抑

31、瘤率達49.5%；2142mg/kgdads可誘導(dǎo)可誘導(dǎo)hl-60細胞向中性粒系細胞向中性粒系方向分化。方向分化。 dads對對hl-60細胞作用的研究細胞作用的研究01020304050607080tween800.6251.252.551020atraag490ug/mlir(%)dads對對hl-60細胞呈濃度依賴性的生長抑制效應(yīng)細胞呈濃度依賴性的生長抑制效應(yīng)00.20.40.60.811.21.41.60244872time/hnbt reduction ability(a570nm)1.25 gml-1dads 處理處理hl-60細胞不同時期細胞不同時期nbt還原還原反應(yīng)的變化反應(yīng)的

32、變化 未處理的hl-60細胞 處理的處理的hl-60 細胞細胞 dads對小鼠腎囊膜下hl-60細胞的誘導(dǎo)分化作用 4.4.影響細胞周期蛋白活性影響細胞周期蛋白活性 研究者們認為，細胞周期的失調(diào)控是癌癥發(fā)生發(fā)展的研究者們認為，細胞周期的失調(diào)控是癌癥發(fā)生發(fā)展的原因，而細胞周期素原因，而細胞周期素cyclins、細胞周期素依賴性激酶、細胞周期素依賴性激酶cdks及調(diào)節(jié)及調(diào)節(jié)cdks的激酶和磷酸酶則是細胞周期調(diào)控的分子基的激酶和磷酸酶則是細胞周期調(diào)控的分子基礎(chǔ)。在真核生物細胞進行有絲分裂時，其細胞周期可分為礎(chǔ)。在真核生物細胞進行有絲分裂時，其細胞周期可分為間期（間期（g1期、期、s期、期、g2期）和

33、期）和m期，期，g1期細胞可進入持續(xù)期細胞可進入持續(xù)時間不等的時間不等的g0期。期。 我們我們上述研究結(jié)果顯示，上述研究結(jié)果顯示，prb、p21表達的增強表達的增強和和c-myc、ras及突變型及突變型p53表達減弱均可導(dǎo)致細胞停表達減弱均可導(dǎo)致細胞停滯于滯于g1期。本實驗采用流式細胞儀檢測了期。本實驗采用流式細胞儀檢測了mgc803細胞在細胞在dads作用后細胞周期的分布，結(jié)果表明細胞作用后細胞周期的分布，結(jié)果表明細胞停滯于停滯于g2期而非期而非g1期。期。dads可誘導(dǎo)可誘導(dǎo)hl-60細胞表面細胞表面分化抗原分化抗原cd11b表達升高，表達升高，cd33表達下降及細胞周表達下降及細胞周期阻

34、滯在期阻滯在g0/g1期。期。 dads對人胃癌mgc803細胞周期的影響 0gml-1 dads 0.625gml-1 dads 1.25gml-1 dads 2.5gml-1 dads 5gml-1 dads atra dads對白血病hl-60細胞周期的影響 010203040506070control0.6251.252.55artaag490ug/mldna contentsg1sg2dads對hl-60細胞周期的dna含量的 影響 cd11b cd33dads對對hl-60細胞表面分化抗原的影響細胞表面分化抗原的影響 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示經(jīng)流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示經(jīng)sb和和100m

35、g/kg、200 mg/kg dads作用后，作用后，mgc803細胞移植瘤細胞移植瘤細胞細胞g2/m期百分率分別比期百分率分別比ns對照組增加對照組增加1.92、2.22和和3.37倍倍 (p0.05)，表明，表明dads呈濃度依賴呈濃度依賴性對移植瘤細胞有性對移植瘤細胞有g(shù)2/m期阻滯期阻滯 。不同濃度不同濃度dads處理后移植瘤細胞周期的變化處理后移植瘤細胞周期的變化 ns組組 sb組組 dads 50mgkg-1組組dads 100mgkg-1組組 dads 200mgkg-1組組 研究表明，研究表明，cyclin有有7種，它們的表達隨細胞周期時相的種，它們的表達隨細胞周期時相的轉(zhuǎn)換而

36、發(fā)生改變，不同轉(zhuǎn)換而發(fā)生改變，不同cyclin須與相應(yīng)的須與相應(yīng)的cdk結(jié)合才能促使結(jié)合才能促使細胞周期的完成。細胞增殖分裂過程中，細胞周期的完成。細胞增殖分裂過程中，cyclins有如下變化：有如下變化：細胞由細胞由g0期進入期進入g1期時，期時，cyclind1-3合成均增加；合成均增加；g1/s期時，期時，cyclinds及及cycline降解，降解，cyclina合成增加；合成增加；s期進入期進入g2期時，期時，cyclinb合成逐漸增加積累；合成逐漸增加積累；g2/m期轉(zhuǎn)換時，期轉(zhuǎn)換時，cyclina、b降降解，解，cyclinds、e合成增加。合成增加。cyclind1在細胞增殖過

37、程中意義在細胞增殖過程中意義最大，是最大，是g1期細胞增殖信號的關(guān)鍵蛋白。許多作者將它視期細胞增殖信號的關(guān)鍵蛋白。許多作者將它視為一種癌基因，其過度表達可導(dǎo)致細胞增殖失控，最終形成為一種癌基因，其過度表達可導(dǎo)致細胞增殖失控，最終形成腫瘤。腫瘤。 cdks由由cdk1-7 組成，其在細胞周期的特定時間與組成，其在細胞周期的特定時間與相應(yīng)的相應(yīng)的cyclin結(jié)合后，并經(jīng)磷酸化或去磷酸化后方具有生物結(jié)合后，并經(jīng)磷酸化或去磷酸化后方具有生物活性，促使與細胞周期有關(guān)蛋白的基因表達，從而對活性，促使與細胞周期有關(guān)蛋白的基因表達，從而對dna合成及有絲分裂進行調(diào)控。合成及有絲分裂進行調(diào)控。 g1/s期有不同

38、的期有不同的cyclin/cdk復(fù)合體，復(fù)合體，cyclind/ cdk4和和cycline/cdk2激酶活性是細胞周期激酶活性是細胞周期g1/s期轉(zhuǎn)換所必須的，期轉(zhuǎn)換所必須的，與與cyclina、e結(jié)合的結(jié)合的cdk2激酶活性在激酶活性在g1/s期轉(zhuǎn)換時升高，期轉(zhuǎn)換時升高，而在而在m期則降低。期則降低。 cyclinb/cdc2復(fù)合體的活性是細胞進入復(fù)合體的活性是細胞進入m期所必的，而期所必的，而g1/s期轉(zhuǎn)換，關(guān)系到細胞周期的啟動，期轉(zhuǎn)換，關(guān)系到細胞周期的啟動，g2/m期轉(zhuǎn)換則是細期轉(zhuǎn)換則是細胞進行有絲分裂增殖的前提。胞進行有絲分裂增殖的前提。 cdis是是cdks的負調(diào)控因子，可使的負調(diào)

39、控因子，可使cdks失活；失活；cyclins是是cdks的正調(diào)控因子，使的正調(diào)控因子，使cdks活化，二者對活化，二者對cdk活性的活性的影響控制細胞周期各時相的轉(zhuǎn)換。影響控制細胞周期各時相的轉(zhuǎn)換。cdis可分為兩類，一類是可分為兩類，一類是p16家族，包括家族，包括p16、p18、p15、p19，特異地抑制，特異地抑制cdk4和和cdk6；另一類是；另一類是p21家族，它包括家族，它包括p21、p27、p57，對，對cdk具有廣譜的抑制作用。具有廣譜的抑制作用。 lee 用用flavopiridol處理處理nsclc細胞株細胞株nci-h358時，發(fā)時，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)flavopiridol可使該

40、細胞生長停止和誘導(dǎo)分化，且分化的啟可使該細胞生長停止和誘導(dǎo)分化，且分化的啟動與動與cdk2失活相一致，失活相一致，western blot分析處理后細胞的有分析處理后細胞的有cycline和和d1的缺失，表明的缺失，表明cdks調(diào)控亞單位缺失是調(diào)控亞單位缺失是cdk2激激酶失活的一個原因，同樣酶失活的一個原因，同樣cdk1、2、5的抑制劑的抑制劑roscovitine也可以誘導(dǎo)也可以誘導(dǎo)nci-h358細胞分化，因此誘導(dǎo)分化劑可能通過細胞分化，因此誘導(dǎo)分化劑可能通過阻抑阻抑cdk2的活性誘導(dǎo)細胞分化。的活性誘導(dǎo)細胞分化。 我們應(yīng)用我們應(yīng)用western blot分析發(fā)現(xiàn)，在分析發(fā)現(xiàn)，在g2/m

41、期阻滯同時期阻滯同時有有cdc25c蛋白表達下降，但蛋白表達下降，但cdk1蛋白表達不受蛋白表達不受 dads 作作用的影響。表明用的影響。表明 dads對對mgc803細胞的抑制增殖作用與細胞的抑制增殖作用與g2/m期阻滯有關(guān)，其分子機理可能與降低期阻滯有關(guān)，其分子機理可能與降低cdc25c蛋白水蛋白水平有關(guān)。平有關(guān)。p38通路調(diào)節(jié)通路調(diào)節(jié)cdc25c磷酸酶的表達在磷酸酶的表達在dads誘導(dǎo)誘導(dǎo)mgc803細胞細胞g2/m期阻滯中起著重要作用。期阻滯中起著重要作用。 dads對人胃癌對人胃癌mgc803和和bgc823細胞細胞g2/m期檢查點期檢查點激酶通路的影響激酶通路的影響rt-pcr檢

42、測檢測chk1和和chk2在在mrna水平的改變水平的改變 western blot檢測各蛋白的改變檢測各蛋白的改變 免疫共沉淀檢測免疫共沉淀檢測chk1、chk2與與cdc25c結(jié)合結(jié)合 m 1 2 3 4 5 6 600bp300bpchk1-actinrt-pcr 檢測檢測mgc803、bgc823細胞細胞 chk1mrna表達水平表達水平 m：marker；1：mgc803細胞對照組；細胞對照組； 2-3：dads 處理處理mgc803細胞細胞1d、2d；4: bgc823細胞對照組；細胞對照組；5-6：dads 處理處理bgc823細胞細胞1d、2d m 1 2 3 4 5 6 60

43、0bp300bpchk2-actinrt-pcr 檢測檢測mgc803、bgc823細胞細胞 chk2mrna表達水平表達水平m：marker；1：mgc803細胞對照組；細胞對照組；23：dads 處理處理mgc803細胞細胞1d、2d；4: bgc823細胞；細胞；56： dads處理處理bgc823細胞細胞1d、2d dads誘導(dǎo)誘導(dǎo)mgc803和和bgc823細胞細胞chk1和和p-chk1表達表達 0 1 2 4 8 12 (hr)p-chk1(ser345)chk1-actin dads對對mgc803細胞磷酸化細胞磷酸化chk1表達的影響表達的影響p-chk1(ser345)ch

44、k1-actin dads對對bgc823細胞磷酸化細胞磷酸化chk1表達的影響表達的影響 0 1 2 4 8 12 (hr) dads誘導(dǎo)誘導(dǎo)mgc803和和bgc823細胞細胞chk2和和p-chk2表達表達 0 1 2 4 8 12 (hr) p-chk2chk2-actin dads對對mgc803細胞磷酸化細胞磷酸化chk2表達的影響表達的影響0 1 2 4 8 12 (hr)p-chk2 chk2-actin dads對對bgc823細胞磷酸化細胞磷酸化chk2表達的影響表達的影響dads誘導(dǎo)誘導(dǎo)mgc803和和bgc823細胞細胞atr和和p-atr的表達的表達 0 15 30

45、60 90 120 (min)p-atr（ser428） atr -actin dads對對mgc803細胞磷酸化細胞磷酸化atr表達的影響表達的影響0 15 30 60 90 120 (min) p-atr（ser428） atr -actin 圖圖27 dads對對bgc823細胞磷酸化細胞磷酸化atr表達的影響表達的影響dads誘導(dǎo)誘導(dǎo)bgc823細胞細胞chk下游分子下游分子cdc25c、cyclin b1的表達的表達 0 12 24 36 48 (hr)cdc25c-actindads對對bgc823細胞細胞cdc25c磷酸酶表達的影響磷酸酶表達的影響 0 12 24 36 48 (

46、hr)cyclin b1 actin圖圖25 dads對對bgc803細胞細胞cyclinb1表達的影響表達的影響免疫共沉淀檢測免疫共沉淀檢測chk1激酶活性激酶活性 chk1cdc25c mgc803細胞細胞 bgc823細胞細胞 untreatedtreated by dads negative controluntreatedtreated by dads negative control圖圖29 免疫共沉淀免疫共沉淀western-blot分析分析 mgc803和和bgc823細胞中的細胞中的chk1表達表達免疫共沉淀檢測免疫共沉淀檢測chk2激酶活性激酶活性 chk2 cdc25cn

47、egative controluntreatedtreated by dads negative controluntreatedtreated by dads mgc803細胞細胞 bgc823細胞細胞 免疫共沉淀免疫共沉淀western-blot分析分析 mgc803和和bgc823細胞中細胞中chk2的表達的表達chk1和和chk2 基因沉默對基因沉默對dads g2/m期阻滯作用期阻滯作用及檢查點激酶通路的影響及檢查點激酶通路的影響1. 實時熒光定量實時熒光定量pcr檢測檢測rnai后后chk1和和chk2 mrna表表達的改變達的改變 2. chk1和和chk2 rnai后后chk1

48、和和chk2蛋白表達的改變蛋白表達的改變 3. chk1 、chk2基因沉默后基因沉默后mtt比色實驗結(jié)果比色實驗結(jié)果 4. 干擾后細胞周期的改變干擾后細胞周期的改變 5. chk1和和chk2 rnai后下游蛋白表達的改變后下游蛋白表達的改變 定量定量rt-pcr檢測檢測mgc803細胞細胞chk1 mrna表達的改變表達的改變樣品樣品 gapdh chk1 chk1/gapdh mgc803 1.03e-01 5.93e-03 5.76e-02 mgc803+vector 2.02e-01 9.34e-03 4.62e-02 mgc803+dads 2.93e-01 4.05e-03 1.38e-02 mgc803+dads+vector 2.98e-01 4.07e-03 1.37e-02 定量定量rt-pcr檢測檢測bgc823細胞細胞 chk1 mrna表達的改變表達的改變 樣品