LACCLR2細(xì)菌漆酶性質(zhì)及其脫色作用的研究

1、LACCLR2細(xì)菌漆酶性質(zhì)及其脫色作用的研究Study of LACCLR2 Bacterial Laccase Properties and DecolorizationLiu Yan1 et al.（ 1Guangdong Food and Drug Vocational College，Guangzhou 510520 ， China ）Abstract： In thisexperiment ， LACCLR2as researchsubject ， we studied its enzymatic properties and dyedecolorization，conclusion

2、as below： The optimumreaction temperature is 50， The optimum reaction pHis 6 ， the optimum copper ion concentration is 0.01%.Indigo decolorization most significant effect，decolorization rate is 77.4%.Key words ：Bacterial Laccases ；Enzymatic properties ； Decolorization1 引言漆酶（）又名藍(lán)色多銅氧化酶，是一種含銅的多酚氧化酶，其與

3、植物中的抗壞血酸氧化酶、哺乳動(dòng)物的血漿銅藍(lán)蛋白都是屬于藍(lán)色多銅氧化酶家族1 。漆酶是一種可催化漆固化過(guò)程的蛋白質(zhì)，由日本學(xué)者吉田在漆樹的漆液中首先發(fā)現(xiàn)。漆酶可以氧化包括酚類、多酚類、苯胺、木質(zhì)素、多環(huán)芳香烴甚至無(wú)機(jī)物等一系列物質(zhì)，以分子氧氣為電子受體，生成唯一的副產(chǎn)物是水。漆酶在印染廢水處理、食品生產(chǎn)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，受到了世界科學(xué)界的重視。長(zhǎng)期以來(lái)，人們一直以為漆酶僅僅存在于真核生物。1993 年， Givaudan 在水稻根周圍的土壤中分離出一株產(chǎn)漆酶的脂固氮螺菌， 證實(shí)了原核生物也可以產(chǎn)生漆酶 2 。2000年， Alexandre 通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)，證實(shí)漆酶普遍存在于原核生物

4、中。如今人們?cè)诖竽c桿菌、枯草芽孢桿菌、抗生鏈霉菌、交互單胞菌、嗜熱棲熱菌等多種原核生物中都檢測(cè)到了漆酶的存在。漆酶主要有三類，分別是植物漆酶、真菌漆酶和細(xì)菌漆酶。其中，植物漆酶很難被檢測(cè)和純化，真菌漆酶又不耐受高溫和堿性環(huán)境，而通過(guò)對(duì)細(xì)菌漆酶的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌一般為單體蛋白，具有較好的穩(wěn)定性，偏向堿性的最適作用 pH，抑制劑少，可以克服植物漆酶和真菌漆酶應(yīng)用的缺點(diǎn)，因而具有巨大的應(yīng)用潛力。但目前關(guān)于細(xì)菌漆酶的研究還較少，嚴(yán)重阻礙了細(xì)菌漆酶的應(yīng)用，因此，開展對(duì)細(xì)菌漆酶的廣泛研究具有重要的意義。2 材料與方法2.1主要材料產(chǎn)漆酶細(xì)菌菌種本課題組提供。試驗(yàn)器皿 三角瓶、 燒杯、量筒、試管、玻璃棒、容量

5、瓶、 滴管、試管架、 比色皿、 移液槍、 離心管、 保鮮膜、 pH 試紙、培養(yǎng)皿、 pH 計(jì)。試驗(yàn)設(shè)備 GT16-3 小型臺(tái)高速離心機(jī)（廣州市正一科技有限公司） ； BCD-222HC華凌冰箱（華凌集團(tuán)有限公司）；722G可見光分光光度計(jì) （上海儀器分析儀器有限公司）；SW-CJ-2FD雙人潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司） ； HR-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司） ；電子天平（廣州市正一科技有限公司） ； YH系列電熱器（江蘇建湖近湖鎮(zhèn)教學(xué)儀器廠） ；精密電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；PHS-25 實(shí)驗(yàn)室 pH 計(jì)（上海虹益儀器儀表有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（

6、上海三申醫(yī)療器械有限公司） ； JY92-IIN 超聲波細(xì)胞破碎機(jī) （寧波新芝生物科技股份有限公司）。試劑愈創(chuàng)木酚（阿拉?。?； 95%乙醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司） ；硫酸銅（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；NaCl（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；酵母膏（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；蛋白胨（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；結(jié)晶紫（阿拉?。?；橙黃（阿拉?。?；剛果紅（阿拉?。汇t黑 T（天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心）；麗春紅 S（阿拉丁）；磷酸氫二鉀（天津市大茂化學(xué)試劑廠）。改良 LB 培養(yǎng)基酵母膏 0.5%、蛋白胨1%、NaCl0.5%、硫酸銅0.04%、瓊脂 1.5%、 pH 為 7.43。2

7、.2試驗(yàn)方法漆酶粗酶液的制備（ 1）從平板中將單菌落接入5mL液體培養(yǎng)基的試管里， 37培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d。（ 2）把試管的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入100mL錐形瓶中， 37培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d。（3）將培養(yǎng)好的菌液倒入4mL的離心管， 然后離心3min，離心速度為 9 000r/min ，舍棄上清液。 （4）用 40mL水將離心沉淀的菌體復(fù)溶。（ 5）用細(xì)胞破碎儀破碎菌體，設(shè)定參數(shù)為全程破碎時(shí)間 60min，功率為 45%，每次 3s，每次間隔 3s。（6）破碎完畢，將細(xì)胞破碎液以 12 000r/min 的速度離心 20min ，丟棄沉淀，上清液即為所需粗酶液， 置于 4冰箱保藏備用。酶活的測(cè)定 制備 4mL的反

8、應(yīng)體系，其愈創(chuàng)木酚的濃度為 0.05%，硫酸銅的濃度為 0.01%。然后每 4mL的反應(yīng)體系中分別加入 0.2mL 之前制備的粗酶液， 在 50水浴中反應(yīng) 30min ，測(cè)出反應(yīng)后 OD465差值。每個(gè)反應(yīng)都須平行三次。以每 1min 消耗 1mol 底物定義為一個(gè)漆酶活力單位，以 U/L 表示。漆酶酶學(xué)性質(zhì)的研究最適 Cu2+濃度 取 4mL反應(yīng)體系，愈創(chuàng)木酚的濃度為 0.05%（ 50L愈創(chuàng)木酚加到 100mL去離子水），而 Cu2+濃度各個(gè)不相同，其濃度依次為0.0025%、 0.005%、 0.01%、0.02%、0.04%、0.08%、0.16%。將全部反應(yīng)體系置于37預(yù)熱 5min

9、 后，每個(gè)反應(yīng)體系加入0.2mL 粗酶液，對(duì)照組添加相同量的滅活酶液。均置于37恒溫水浴鍋中水浴30min ，測(cè)其反應(yīng)前后OD465，每組平行三次，求平均值。最適溫度制備 4mL的反應(yīng)體系，其愈創(chuàng)木酚的濃度為0.05%，硫酸銅的濃度為0.01%，每 4mL的反應(yīng)體系中加入0.2mL 制備的粗酶液，然后搖勻。不同反應(yīng)體系分別放入 30、 35、 40、 45、 50、 55、 60恒溫水浴鍋水浴 30min，對(duì)照組添加相同量的滅活酶液，測(cè)其 OD465，每組平行三次，求平均值。最適 pH 制備 4mLpH分別為 3、4、5、6、7、8、9 的反應(yīng)體系，其愈創(chuàng)木酚的濃度為0.05%，硫酸銅的濃度為

10、 0.01%。向每個(gè)反應(yīng)體系加入 0.2mL 粗酶液，對(duì)照組添加相同量的滅活酶液。均置于 50恒溫水浴鍋中水浴 30min ，測(cè)其反應(yīng)前后 OD465，每組平行三次，求平均值。溫度穩(wěn)定性 制備 4mL反應(yīng)體系，其愈創(chuàng)木酚的濃度為 0.05%，硫酸銅的濃度為 0.01%。向每個(gè)反應(yīng)體系分別加入 0.2mL 經(jīng)過(guò) 50、 60、 70、 80水浴預(yù)處理過(guò)的粗酶液。對(duì)照組則添加相同量的滅活酶液。搖勻后均置于50恒溫水浴鍋中水浴30min ，測(cè)其反應(yīng)前后OD465，每組平行三次，求平均值。漆酶對(duì)染料的脫色效果研究（1）酶對(duì)靛藍(lán)的脫色。制備4mL靛藍(lán)溶液反應(yīng)體系，其中硫酸銅的濃度為0.01%，向每個(gè)反應(yīng)

11、體系加入0.2mL 粗酶液，對(duì)照組添加相同量的滅活酶液。均置于50恒溫水浴鍋中水浴30min，測(cè)其反應(yīng)前后OD465，每組平行三次，求平均值。（2）其他染料的脫色。按照對(duì)靛藍(lán)的脫色實(shí)驗(yàn)，對(duì)結(jié)晶紫、剛果紅、橙黃、麗春紅S、橙黃 G、鉻黑 T 做相似的脫色實(shí)驗(yàn)，算出脫色率，比較各個(gè)染料的脫色效果（表1）。2.3 COD/BOD測(cè)定 COD按照國(guó)標(biāo)GB11914-1989 測(cè)定，BOD按照標(biāo)準(zhǔn)HJ505-2009 測(cè)定。2.4計(jì)算酶活力的計(jì)算酶活力以樣品與底物反應(yīng)30min后變化的OD值表示，以1min 單位體積酶液消耗酶底物定義為一個(gè)漆酶活力單位，以U/L 表示 41mol 漆。已知愈創(chuàng)木酚在 4

12、65nm處消光系數(shù) =48mmol?L-1?cm-1 。公式如下：U=OD×Vt×× 10 - 6×V0 （ 2）式中： OD：吸光度增加值； t ：反應(yīng)時(shí)間（ min）；V：反應(yīng)體積（ mL）；：消光系數(shù)； V0：酶液體積（ mL）。脫色率的計(jì)算根據(jù)染料溶液顏色深淺與吸光值呈現(xiàn)線性關(guān)系，可用分光光度計(jì)在相對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)下測(cè)量該染料的吸光值便可反應(yīng)出染料的顏色變化。公式如下：脫色率（ %）= （ Ao-A）/Ao ×100式中： A經(jīng)脫色反應(yīng)后溶液的吸光值；A0脫色反應(yīng)前溶液的吸光值。3 結(jié)果與分析3.1 酶活力的測(cè)定 以愈創(chuàng)木酚為底物， 50反應(yīng)

13、 30min ，用分光光度法測(cè)其 OD值，每組平行三次，求其平均值，可得該漆酶的酶活力為8 750U/L （表 2）。3.2漆酶的酶學(xué)性質(zhì)最適 Cu2+濃度以愈創(chuàng)木酚為反應(yīng)底物，添加不同濃度的Cu2+，50反應(yīng)30min，用分光光度法測(cè)其OD值，每組平行三次，求其平均值。采用Design-Expert軟件處理對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。如圖1 所示，Cu2+濃度在0.0025 0.01，酶活力隨著Cu2+濃度增加而增加，在0.01 0.05隨著銅離子的濃度增加有少量下降， 在 0.05 0.16 ，酶活較為穩(wěn)定，其中在 Cu2+濃度在 0.01%時(shí)，酶活力達(dá)到最大值。由此判斷 0.01%為實(shí)驗(yàn)漆酶

14、的最適 Cu2+濃度。當(dāng) Cu2+濃度超過(guò) 0.01%時(shí)，酶活力會(huì)有所下降，但是下降幅度并不大，故少量 Cu2+可以提高漆酶活力，但過(guò)高 Cu2+濃度也會(huì)抑制漆酶酶活力。最適溫度 制備 4mL的反應(yīng)體系，其愈創(chuàng)木酚的濃度為 0.05%，硫酸銅的濃度為 0.01%，每 4mL的反應(yīng)體系中加入 0.2mL 制備的粗酶液，然后搖勻，再至于不同的溫度下反應(yīng) 30min，用分光光度法測(cè)其 OD值，每組平行三次，求其平均值。采用 Design-Expert 軟件處理對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。如圖2 所示，當(dāng)反應(yīng)體系的溫度在3050時(shí)，隨著溫度的增加酶活力也相對(duì)應(yīng)地增加，并在 50時(shí)酶活力達(dá)到最大值，故50為

15、最適溫度。在5060，酶活力有所下降，故溫度過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)抑制漆酶的酶活力，反應(yīng)中應(yīng)該注意讓反應(yīng)溫度在最適溫度附近，利于漆酶催化反應(yīng)。由圖 2 可知，在 60的時(shí)候，酶活力還相對(duì)較高，故可推斷出說(shuō)明該酶能在較高溫度催化反應(yīng)。最適 pH 制備 4mLpH分別為 3、 4、 5、6、 7、 8、9 的反應(yīng)體系，其愈創(chuàng)木酚的濃度為0.05%，硫酸銅的濃度為 0.01%。向每個(gè)反應(yīng)體系加入0.2mL 粗酶液， 50下反應(yīng)30min 。采用 Design-Expert軟件處理對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。如圖3 所示， pH 為 3 時(shí)酶基本喪失活性，而在pH49，雖有所下降，但是下降幅度非常小，仍具有較高的酶活力，其中當(dāng)pH 為 6 時(shí)酶活最高，是酶的最適作用pH。試驗(yàn)證明本漆酶對(duì)pH 有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，在偏酸性、中性和偏堿性條件下該漆酶均可以發(fā)揮催化作用，這有利于其在工業(yè)上的應(yīng)用。漆酶的熱穩(wěn)定性制備 4mL反應(yīng)體系，其愈創(chuàng)木酚的濃度為0.05%，硫酸銅的濃度為