全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)分析

1、全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)分析1. 簡(jiǎn)介(Introduction)通過(guò)高通量測(cè)序識(shí)別發(fā)現(xiàn)de novo的somatic和germ line 突變，結(jié)構(gòu)變異-SNV，包括重排突變（deletioin, duplication 以及copy number variation）以及SNP的座位；針對(duì)重排突變和SNP的功能性進(jìn)行綜合分析；我們將分析基因功能（包括miRNA），重組率（Recombination）情況，雜合性缺失（LOH）以及進(jìn)化選擇與mutation之間的關(guān)系；以及這些關(guān)系將怎樣使得在disease（cancer）genome中的mutation產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的易感機(jī)制和功能。我們將在基因組學(xué)以及

2、比較基因組學(xué)，群體遺傳學(xué)綜合層面上深入探索疾病基因組和癌癥基因組。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣本（1）Case-Control 對(duì)照組設(shè)計(jì) ；（2）家庭成員組設(shè)計(jì)：父母-子女組（4人、3人組或多人）；初級(jí)數(shù)據(jù)分析1數(shù)據(jù)量產(chǎn)出： 總堿基數(shù)量、Total Mapping Reads、Uniquely Mapping Reads統(tǒng)計(jì)，測(cè)序深度分析。2一致性序列組裝：與參考基因組序列（Reference genome sequence）的比對(duì)分析，利用貝葉斯統(tǒng)計(jì)模型檢測(cè)出每個(gè)堿基位點(diǎn)的最大可能性基因型，并組裝出該個(gè)體基因組的一致序列。3SNP檢測(cè)及在基因組中的分布：提取全基因組中所有多態(tài)性位點(diǎn)，結(jié)合質(zhì)量值、測(cè)序深度、

3、重復(fù)性等因素作進(jìn)一步的過(guò)濾篩選，最終得到可信度高的SNP數(shù)據(jù)集。并根據(jù)參考基因組信息對(duì)檢測(cè)到的變異進(jìn)行注釋。4InDel檢測(cè)及在基因組的分布: 在進(jìn)行mapping的過(guò)程中，進(jìn)行容gap的比對(duì)并檢測(cè)可信的short InDel。在檢測(cè)過(guò)程中，gap的長(zhǎng)度為15個(gè)堿基。對(duì)于每個(gè)InDel的檢測(cè)，至少需要3個(gè)Paired-End序列的支持。5Structure Variation檢測(cè)及在基因組中的分布: 能夠檢測(cè)到的結(jié)構(gòu)變異類型主要有：插入、缺失、復(fù)制、倒位、易位等。根據(jù)測(cè)序個(gè)體序列與參考基因組序列比對(duì)分析結(jié)果，檢測(cè)全基因組水平的結(jié)構(gòu)變異并對(duì)檢測(cè)到的變異進(jìn)行注釋。高級(jí)數(shù)據(jù)分析1.測(cè)序短序列匹配（R

4、ead Mapping）（1）屏蔽掉Y染色體上假體染色體區(qū)域（pseudo-autosomal region）, 將Read與參考序列NCBI36進(jìn)行匹配（包括所有染色體，未定位的contig，以及線粒體序列mtDNA（將用校正的劍橋參考序列做替代）)。采用標(biāo)準(zhǔn)序列匹配處理對(duì)原始序列文件進(jìn)行基因組匹配， 將Read與參考基因組進(jìn)行初始匹配；給出匹配的平均質(zhì)量得分分布；（2）堿基質(zhì)量得分的校準(zhǔn)。我們采用堿基質(zhì)量校準(zhǔn)算法對(duì)每個(gè)Read中每個(gè)堿基的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)分，并校準(zhǔn)一些顯著性誤差，包括來(lái)自測(cè)序循環(huán)和雙核苷酸結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的誤差。（3）測(cè)序誤差率估計(jì)。 pseudoautosomal contigs，sh

5、ort repeat regions（包括segmental duplication，simple repeat sequence-通過(guò)tandem repeat識(shí)別算法識(shí)別）將被過(guò)濾；2. SNP Calling 計(jì)算 （SNP Calling）我們可以采用整合多種SNP探測(cè)算法的結(jié)果，綜合地，更準(zhǔn)確地識(shí)別出SNP。通過(guò)對(duì)多種算法各自識(shí)別的SNP進(jìn)行一致性分析，保留具有高度一致性的SNP作為最終SNP結(jié)果。這些具有高度一致性的SNP同時(shí)具有非常高的可信度。在分析中使用到的SNP識(shí)別算法包括基于貝葉斯和基因型似然值計(jì)算的方法，以及使用連鎖不平衡LD或推斷技術(shù)用于優(yōu)化SNP識(shí)別檢出的準(zhǔn)確性。統(tǒng)計(jì)

6、SNV的等位基因頻率在全基因組上的分布稀有等位基因數(shù)目在不同類別的SNV中的比率分布（a）；SNV的類別主要考慮：（1）無(wú)義（nonsense）,（2）化學(xué)結(jié)構(gòu)中非同義，（3）所有非同義，（4）保守的非同義，（5）非編碼，（6）同義，等類型SNV； 另外，針對(duì)保守性的討論，我們將分析非編碼區(qū)域SNV的保守型情況及其分布（圖a, b）3. 短插入/缺失探測(cè)（Short Insertion /Deletion （Indel）Call）(1). 計(jì)算全基因組的indel變異和基因型檢出值的過(guò)程計(jì)算過(guò)程主要包含3步：（1）潛在的indel的探測(cè)；（2）通過(guò)局部重匹配計(jì)算基因型的似然值；（3）基于LD連

7、鎖不平衡的基因型推斷和檢出識(shí)別。Indel在X，Y染色體上沒(méi)有檢出值得出。(2). Indel 過(guò)濾處理4. 融合基因的發(fā)現(xiàn)（Fusion gene Discovery）選擇注釋的基因信息來(lái)自于當(dāng)前最新版本的Ensemble Gene數(shù)據(jù)庫(kù)，RefSeq數(shù)據(jù)庫(kù)和Vega Gene數(shù)據(jù)庫(kù)。下面圖例給出的是融合基因的形成，即來(lái)自不同染色體的各自外顯子經(jīng)過(guò)重組形成融合基因的模式圖。5.  結(jié)構(gòu)變異（Structure Variation）結(jié)構(gòu)變異（Structure VariationSV）是基因組變異的一類主要來(lái)源，主要由大片段序列（一般>1kb）的拷貝數(shù)變異（copy

8、number variation, CNV）以及非平衡倒位（unbalance inversion）事件構(gòu)成。目前主要一些基因組研究探測(cè)識(shí)別的SV大約有20,000個(gè)（DGV數(shù)據(jù)庫(kù)）。在某些區(qū)域上，甚至SV形成的速率要大于SNP的速率，并與疾病臨床表型具有很大關(guān)聯(lián)。我們不僅可以通過(guò)測(cè)序方式識(shí)別公共的SV，也可以識(shí)別全新的SV。全新的SV的生成一般在germ line和突變機(jī)制方面都具有所報(bào)道。然而，當(dāng)前對(duì)SV的精確解析需要更好的算法實(shí)現(xiàn)。同時(shí)，我們也需要對(duì)SV的形成機(jī)制要有更重要的認(rèn)知，尤其是SV否起始于祖先基因組座位的插入或缺失，而不簡(jiǎn)單的根據(jù)等位基因頻率或則與參考基因組序列比對(duì)判斷。SV的

9、功能性也結(jié)合群體遺傳學(xué)和進(jìn)化生物學(xué)結(jié)合起來(lái)，我們綜合的考察SV的形成機(jī)制類別。SV形成機(jī)制分析，包括以下幾種可能存在的主要機(jī)制的識(shí)別發(fā)現(xiàn)：（A）同源性介導(dǎo)的直系同源序列區(qū)段重組（NAHR）；（B）與DNA雙鏈斷裂修復(fù)或復(fù)制叉停頓修復(fù)相關(guān)的非同源重組（NHR）；（C）通過(guò)擴(kuò)展和壓縮機(jī)制形成可變數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR）；（D）轉(zhuǎn)座元件插入（一般主要是長(zhǎng)短間隔序列元件LINE/SINE或者伴隨TEI相關(guān)事件的兩者的組合）。結(jié)構(gòu)變異探測(cè)和擴(kuò)增子（Amplicon）的探測(cè)與識(shí)別分析:如下圖所示6. 測(cè)序深度分析測(cè)序深度分析就是指根據(jù)基因組框內(nèi)覆蓋度深度與期望覆蓋度深度進(jìn)行關(guān)聯(lián)，并識(shí)別出SV。我們也

10、將采用不同算法識(shí)別原始測(cè)序數(shù)據(jù)中的缺失片段（deletion）和重復(fù)片段（duplication）。7. SV探測(cè)識(shí)別結(jié)果的整合與FDR推斷(可選步驟)(1). PCR或者芯片方式驗(yàn)證SV(2). 計(jì)算FDR-錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（配合驗(yàn)證試驗(yàn)由客戶指定）(3)  篩選SV檢出結(jié)果用于SV的合并和后續(xù)分析：我們通過(guò)不同方式探測(cè)識(shí)別SV的目的極大程度的檢出SV，并且降低其FDR（<=10%）。通過(guò)下屬篩選方法決定后續(xù)分析所使用到的SV集合。每種SV探測(cè)識(shí)別算法得到的SV的FDR要求小于10%，并將各自符合條件的SV合并；對(duì)于FDR大于10% 的算法計(jì)算識(shí)別的SV結(jié)果，如果有PCR

11、和芯片平臺(tái)驗(yàn)證數(shù)據(jù)，同樣可以納入后續(xù)SV分析中。最后，針對(duì)不同算法得到的SV，整合處理根據(jù)breakpoint斷點(diǎn)左右重合覆蓋度的置信區(qū)間來(lái)評(píng)定；8. 變異屬性分析(1) neutral coalescent分析測(cè)序數(shù)據(jù)可以探測(cè)到低頻率的變異體（MAF<=5%）。根據(jù)來(lái)自群體遺傳學(xué)理論（neutral coalescent理論）的期望值可以計(jì)算低頻度變異的分布。我們用不同等位基因頻率下每Mb變異數(shù)目與neutral coalescent 選擇下的期望值比值，即每Mb 基因組windows內(nèi)的theta觀測(cè)值，來(lái)刻畫(huà)和反映自然純化選擇與種群（cancer cell-line可以特定的認(rèn)為是

12、可以區(qū)分的種群）增長(zhǎng)速率。該分布分別考察SNP（藍(lán)色線），Indel（紅色線），具有基因型的大片段缺失（黑色線），以及外顯子區(qū)域上的 SNP（綠色線）在不同等位基因頻率區(qū)間上的theta情況（參見(jiàn)下圖）。        (2). 全新變異體(novel variant)的等位基因頻率和數(shù)量分布分析對(duì)象包括全新預(yù)測(cè)的SNP，indel，large deletion, 以及外顯子SNP在每個(gè)等位基因頻率類別下的數(shù)目比率（fraction）（參見(jiàn)下圖）；全新預(yù)測(cè)是指預(yù)測(cè)分析結(jié)果與dbSNP（當(dāng)前版本129）以及delet

13、ion數(shù)據(jù)庫(kù)dbVar（2010年6月份版本）和已經(jīng)發(fā)表的有關(guān)indels研究的基因組數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)比較后識(shí)別確定的全新的SNP，indel以及deletion。dbSNP包含SNP和indels; dbVAR包含有deletion,duplication,以及mobile element insertion。dbRIP以及其他基因組學(xué)研究（JC Ventrer 以及Watson 基因組，炎黃計(jì)劃亞洲人基因組）結(jié)果提供的short indels和large deletion。       (3). 變異體的大小分布以及新穎性分布計(jì)

14、算SNP，Deletion，以及Insertion 大小分布；計(jì)算SNP，Deletion，以及Insertion中屬于全新預(yù)測(cè)結(jié)果的數(shù)目占已有各自參考數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)目的比例（相對(duì)于dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)；dbSNP包含SNP和indels;dbVAR包含有deletion,duplication,以及mobile element insertion。dbRIP以及其他基因組學(xué)研究（JC Ventrer 以及Watson 基因組，炎黃計(jì)劃亞洲人基因組）結(jié)果提供的short indels和large deletion）其中，可以給出LINE，Alu的特征位置。(4). 結(jié)構(gòu)變異SV的斷點(diǎn)聯(lián)結(jié)點(diǎn)(BreakP

15、oint Junction)分析根據(jù)SV不同檢出結(jié)果經(jīng)過(guò)一些列篩選步驟構(gòu)建所有結(jié)構(gòu)變異SV的斷點(diǎn)聯(lián)結(jié)點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)，保留長(zhǎng)度大于等于50bp的SV；分析斷點(diǎn)聯(lián)結(jié)點(diǎn)處具有homology或者microhomology的SV；并將同一染色體，起始和終止位置坐標(biāo)下的不同SV進(jìn)行去冗余處理。分析識(shí)別SV 的斷點(diǎn)聯(lián)結(jié)點(diǎn)（Breakpoint）: 將Breakpoint按照可能形成的方式可以分類為以下幾類：（a）非等位基因同源重組型（non-allelic homologous recombination-NAHR）;（b）非同源重組（nonhomologous recombination-NHR），包括non

16、homologous end-joining (NHEJ)和fork stalling /template switching（FoSTeS/MMBIR）；（c）可變串聯(lián)重復(fù)（VNTR）（d）轉(zhuǎn)座插入元件（TEI）。     圖 CSV形成偏好性分析分析SV形成機(jī)制與斷裂點(diǎn)臨近區(qū)域序列的關(guān)系，包括染色質(zhì)界標(biāo)（端粒，中心粒），重組高發(fā)熱點(diǎn)區(qū)域，重復(fù)序列以及含量，短DNA motif和微同源區(qū)域（microhomology region）。9.突變率估計(jì)針對(duì)以家庭成員為單位的測(cè)序方案，我們主要探測(cè)de novo的突變（DNM）；通過(guò)采用不同的方法/

17、算法，我們給出每個(gè)家庭一份推斷的DNM報(bào)表；(1) 根據(jù)基因型推斷結(jié)果，分別對(duì)每人每堿基位置上的de novo突變進(jìn)行綜合度量；(2) 采用貝葉斯方法計(jì)算家庭組設(shè)計(jì)中DNM的后驗(yàn)概率10. SNP，SNV功能分析與注釋(1). 祖先等位基因的注釋通過(guò)將人類（NCBI36），黑猩猩（chimpanzee2.1），猩猩（PPYG2）以及恒河猴（MMUL1）4種基因組進(jìn)行基因組比對(duì)，發(fā)現(xiàn)保守的序列區(qū)域，計(jì)算祖先等位基因；以及duplication/deletion事件的進(jìn)化分析。(2). 分析基因結(jié)構(gòu)序列上不同區(qū)域的多樣性（Diversity）與分歧進(jìn)化（divergence）根據(jù)基因型分析結(jié)果計(jì)算

18、基因結(jié)構(gòu)序列上的多樣性程度，即雜合度(heterozygosity); 雜合度指標(biāo)可以說(shuō)明選擇效應(yīng)的存在以及局部變異的結(jié)構(gòu)分布特征模式。我們將考慮基因5UTR上游200bp ，5UTR ，第一個(gè)外顯子，第一個(gè)內(nèi)含子，中間外顯子，中間內(nèi)含子，最末外顯子和內(nèi)含子，以及3UTR及其下游200bp區(qū)域左右考察的范圍(參見(jiàn)下圖a)。   分析編碼轉(zhuǎn)錄本的起始/終止位置臨近區(qū)域的多樣性和進(jìn)化分歧度（參見(jiàn)下圖b）。(3). 疾病變異體探測(cè)將樣本測(cè)序中分析得到SV與HGMD疾病變異體數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，得到交叉記錄的錯(cuò)義和無(wú)義的SNP；通過(guò)將HGMD疾病關(guān)聯(lián)突變與CUI（疾病概念分類標(biāo)

19、識(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)）比對(duì)獲得HGMD中所有SV的疾病表型，并獲得HGMD與測(cè)序數(shù)據(jù)分析得到的SV的疾病表型；并通過(guò)Fisher檢驗(yàn)和Bonferroni多重假設(shè)檢驗(yàn)校正計(jì)算樣本SV所富集的疾病表型。(4). 拷貝數(shù)變異CNV所含基因的功能注釋將CNV是否覆蓋區(qū)段重復(fù)SD區(qū)域分類為2大類，每類CNV的所含基因的功能富集情況計(jì)算，顯著性在橫軸表示；各種顯著性功能在縱軸表示。 (5). 變異的功能性分析與注釋（a）. SNP, Indels以及大的結(jié)構(gòu)變異SV的功能注釋;（b）. 對(duì)包含翻譯起始注釋信息的轉(zhuǎn)錄本編碼區(qū)上的SNP分類為：同義SNP，非同義SNP和無(wú)義SNP（引入終止子），干擾終止子的S

20、NP，以及干擾剪接位點(diǎn)的SNP；為了降低假陽(yáng)性，我們采用嚴(yán)格的篩選方式過(guò)濾來(lái)自indels的錯(cuò)誤；（c）.對(duì)錯(cuò)義編碼區(qū)突變的功能性分析: 通過(guò)信息學(xué)分析算法評(píng)估相對(duì)于生殖系變異的體細(xì)胞突變對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的影響效應(yīng)。(6). SNV，SNP與miRNA研究之間的關(guān)聯(lián)分析miRNA是起重要的調(diào)控作用的小分子，我們將對(duì)miRNA的pri-mRNA，pre-miRNA以及miRNA靶基因序列進(jìn)行分析，識(shí)別潛在的SNP功能位點(diǎn)。據(jù)文獻(xiàn)研究提供證據(jù)表明Human pre-miRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)中存在不同位置上的SNP，我們將通過(guò)熱力學(xué)穩(wěn)定性分析方法評(píng)估SNP對(duì)pre-miRNA結(jié)構(gòu)的影響；另外，我們也

21、將對(duì)miRNA-Target靶基因相互作用位點(diǎn)做分析，評(píng)估對(duì)SNP對(duì)靶基因靶向性的影響。(7). SNV，SNP與GWAS研究之間的關(guān)聯(lián)分析分析GWAS研究中得到的易感基因在基因組上不同坐標(biāo)上的OR值分布情況； 將當(dāng)前已知的GWAS研究成果與SNP進(jìn)行比較；根據(jù)LD連鎖不平衡將SNP與易感基因的關(guān)系進(jìn)行深入討論;直接與間接關(guān)聯(lián)方法可以分別識(shí)別與表型相關(guān)的SNP，對(duì)于不易獲得（missing）和定位的SNP，通過(guò)LD連鎖不平衡推斷疾病易感基因突變座位。 (8) 生物學(xué)通路（代謝通路，信號(hào)通路）分析生物學(xué)通路（Biological pathway），包括代謝通路和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是生物功能的

22、重要組成部分，我們將各種形式的突變、變異，包括SNV和SNP，的對(duì)應(yīng)基因放到生物學(xué)通路中進(jìn)行綜合分析，考察功能性突變對(duì)pathway的影響程度和影響的規(guī)律。通過(guò)GSEA（配合芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)），KS檢驗(yàn)，超幾何分布檢驗(yàn)等方法對(duì)變異基因在某些pathway的富集程度進(jìn)行排序，識(shí)別發(fā)生功能改變的潛在通路。(9). 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析蛋白質(zhì)相互作用也是生物分子功能增益和缺失的重要途徑，因此我們針對(duì)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中的突變的蛋白及其收到影響的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)蛋白進(jìn)行系統(tǒng)分析，并對(duì)收到影響的網(wǎng)絡(luò)子結(jié)構(gòu)進(jìn)行功能注釋分析和聚類富分析。我們采用網(wǎng)絡(luò)分析算法對(duì)由于各種突變所受到影響的子網(wǎng)絡(luò)（sub

23、network）進(jìn)行功能富集度的分析；(10). 順式基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模塊（CRM）分析(a) 啟動(dòng)子序列分析    包括動(dòng)子區(qū)域上的Motif預(yù)測(cè)，并與已知轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)TRANSFAC和JASPAR中的TFBS結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)；    啟動(dòng)子區(qū)域上保守性分析，分析突變位置和保守性區(qū)域的關(guān)聯(lián)；(b) 計(jì)算全基因組保守性。確定TFBS的保守性以及mutation位置的保守性；（11）重排（arrangements）與突變（mutation）的全基因組統(tǒng)計(jì)（a）. 體細(xì)胞(somatic)和生殖系（germline）重排

24、（arrangements）體細(xì)胞突變是相對(duì)于germ line 突變的一類需要重要分析的內(nèi)容，我們針對(duì)Case-control設(shè)計(jì)的測(cè)序方案可以分別分析突變的情況，包括SNV，indel，以及CNV；如果僅在tumor/disease(Case組)出現(xiàn)而不在normal（對(duì)照組）出現(xiàn)的突變我們可以認(rèn)為是somatic體細(xì)胞突變。將somatic mutation 與dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)可以發(fā)現(xiàn)潛在的全新的突變和有記錄的突變位置。然后，將突變分別比對(duì)到基因區(qū)域和非基因區(qū)域?；騾^(qū)域具體包括：內(nèi)含子區(qū)，UTR，剪接位點(diǎn)區(qū)和外顯子區(qū)。其中外顯子區(qū)分別統(tǒng)計(jì)：同義（synonymous），缺失（deletion），閱讀框移位（frameshift），插入（insertion）,錯(cuò)義（missense）,無(wú)義（nonsense）以及非編碼蛋白外顯子（non-protein coding exon）等不同類型。綜合不同方面分析的結(jié)果，并按照突變分類給出各重排(arrangements)類型：SNV，CNV的數(shù)目統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表（參見(jiàn)下圖） 。對(duì)每一測(cè)序樣