山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定

1、山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定【摘要】口的分離培養(yǎng)山羊的間充質(zhì)干細(xì)胞，并為其在骨組織工程研 究中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。方法應(yīng)用常規(guī)的密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng) 法從山羊骨髓中分離間充質(zhì)干細(xì)胞，并通過觀察分離培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài), 檢測其表面的cd分子表達(dá)，以及rt pcr和免疫組化病理染色方法 證實(shí)成骨、成軟骨、成脂肪多方向分化潛能來對細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果 分離的細(xì)胞具有成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，第三代細(xì)胞的表面分子cd29和 cd44陽性率為98. 70%、99. 54%,而cd62l和cd45陽性率為1. 10%和 0.73%。rt pcr和免疫組化病理染色證實(shí)分離細(xì)胞具有成骨、成軟 骨、成脂肪多方向分化

2、潛能。結(jié)論成功地分離培養(yǎng)山羊的骨髓間充質(zhì) 干細(xì)胞，使山羊間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于骨組織工程的研究成為可能。【關(guān)鍵詞】骨組織工程；山羊；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；鑒定abstract: objective to isolate and culture goat mesenchymal stem cells (mscs) from bone marrow, and explore their application in bone tissue engineering mcthodscclls were isolated from goat bone marrow by conventional methods

3、 the identification of cell was made by cell morphous, expression of cell epitope profile, and multilineage differentiation of osteogenesis, chondrogenesis, and adipogenesis assayed rtpcr and immunohistology staining. rcsultsthc cells were fibroblast like, whose positive rate of cd29 and cd44 were 9

4、8. 70% and 99. 54%, and the percentage of cd62l and cd45 were 1. 10% and 0. 73% the results of rt pcr and iminunohistology staining showed multilineage differentiation potential of cel 1. conclusion mscs were successful ly isolated from goat bone marrow and it is possible that they will be used in t

5、he research field of bone tissue engineering.keywords: bone tissue engineering; goat; bone marrow mesenchymal stem cel 1s; identification間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, mscs)是多潛能干細(xì)胞, 具有向骨、軟骨、脂肪等組織分化的能力1。目前研究發(fā)現(xiàn)其來源 廣泛，存在于骨髓組織、脂肪組織和臍血屮等24。來源于骨髓組織中的mscs具有增殖快、誘導(dǎo)成骨能力較強(qiáng)特點(diǎn)，因而成為目前骨 組織工程中重要的種子細(xì)胞來源，其與支架材料復(fù)合后移植體

6、內(nèi)能明 顯改善骨缺損的修復(fù)5。本實(shí)驗(yàn)對來源于山羊骨髓組織的mscs進(jìn)行 分離、純化和鑒定，為將其應(yīng)用于組織工程骨相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。1材料與方法1. imscs的純化與培養(yǎng)抽取體重為25 kg雄性山羊(由第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供)餡骨骨 髓10 ml,等量稀釋后加入到含有等體積的密度為1. 07 g/ml的percoll(amresco)分離液的離心管屮，以3 000 r/min離心20 min,吸取 中間乳白色云霧狀有核細(xì)胞層，漂洗后加入dmem/f 12培養(yǎng)基(hyclone)和體積比10%的胎牛血清(hyclone),制成單細(xì)胞懸液， 以2x106/cm2的細(xì)胞密度接種培養(yǎng)瓶，3 d后

7、首次全量換液，棄去大 量懸浮細(xì)胞，以后根據(jù)培養(yǎng)基的顏色，每23d換液。待細(xì)胞長滿單 層后，用含有0. 25%胰酶的edta溶液(0. 01%, w/v)消化傳代。12表面分子鑒定取傳3代后的貼壁細(xì)胞，pbs溶液洗3次，用含有0.25%胰酶的edta 溶液(0.01%, w/v)消化制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后制備流式細(xì)胞儀上 機(jī)樣品。其中一抗為cd29、cd60l和cd45 (均購自vmrd,小鼠單克隆 抗體，1 mg/ml), cd44 (購自abeam,大鼠單克隆抗體，1 mg/ml)； 二抗為 fitc (購自 southernbiotech,兔抗大鼠，1 mg/ml)和 pe (購 自生物晶

8、美，羊抗小鼠)。同上方法取第一代至第三代的mscs進(jìn)行cd29 和cd44雙染。1. 3體外分化1.3.1成骨分化取傳3代后的mscs接種后，用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（dmem/f 12培養(yǎng)基中加入0. 1 u mol/l地塞米松、10 mmol/l的b磷酸甘油和0. 05 mmol/l的維生素c,均購口 sigma）替換普通培養(yǎng) 基，每周換液2次6。1. 3. 2成軟骨分化取傳3代后的mscs, 1 000 r/min離心5 min在離 心管底形成細(xì)胞團(tuán)，將其移入培養(yǎng)瓶，輕輕加入含有0. 2 mmol/l維生 素c和1 ng/ml重組人的tgfb 1 （北京博奧森）的dmem/f 12培養(yǎng) 基繼續(xù)培

9、養(yǎng)，每周換液2次7。1. 3. 3成脂分化取傳3代后的mscs,在dmem/f 12培養(yǎng)基中加入 1%胎牛血清、0. 1 u mol/l地塞米松和1 nmol/l胰島素（購自sigma）, 每周換液2次7。1.4rt pcr收集成骨、成軟骨和成脂誘導(dǎo)21 d的細(xì)胞，以未經(jīng)任何誘導(dǎo)的第三 代mscs作為對照，按照qiagen rneasy mini kit的使用說明書，將 細(xì)胞裂解、抽提和純化得到相應(yīng)的rnao通過分光光度計(jì)測得rna濃 度，按照promega試劑盒說明，在制定20 u l的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中加 入1 ug的rna和0.5 pg的隨機(jī)引物，在m mlv （rtasell ）逆 轉(zhuǎn)錄

10、酶的作用下，25 °c保溫5 min, 42 °c保溫60 min, 70 °c滅火15 min,得到cdnao成骨方向分化表達(dá)的基因：轉(zhuǎn)錄因了核心結(jié)合因 子 1 (core binding factor alpha subunit 1, cbfa 1), i 型 膠原(collagen type i )，堿性磷酸酶(alp),骨橋蛋白(osteopontin,opn),骨結(jié)合素(osleoneclin, on)。成軟骨方向分化表達(dá)的基因：ii 型膠原(collagen type ii )和 x 型膠原(col lagen type x )。成 脂方向分化表達(dá)的基

11、因:過氧化物酶體增牛物激活受體y (peroxisomeproliferator activated receptor y, ppar y )o 根據(jù)天根 taq 酶mix kit設(shè)計(jì)25 u l的pcr反應(yīng)體系加入1 u l的cdna產(chǎn)物(rtpcr引物序列見表1),反應(yīng)過程如下：94 °c 3 min, 1個(gè)循環(huán)；94 °c 30 s,退火溫度 30 s, 72 °c 60 s, 35 個(gè)循環(huán)；72 °c 5 min, 1 個(gè) 循環(huán)。取5 ul的pcr產(chǎn)物上樣，2%的tae瓊脂糖凝膠電泳成像。表 1rt pcr引物序列1. 5免疫組織化學(xué)與病理染色取

12、傳3代后的mscs接種于滅菌的蓋玻片上，分別按照上述成骨、成 軟骨和成脂誘導(dǎo)21 d。收集蓋玻片，pbs溶液清洗后，4%多聚甲醛溶 液固定30 min,按照晶美免疫組化試劑盒(抗小鼠和兔，histostainplus kit)說明和免疫組織化學(xué)常規(guī)染色方法操作。用于成骨表達(dá) 的一抗：i 型膠原(collagen type t, col t)和骨鈣素(osteocalcin, 0c),均購自abeam,小鼠抗羊單克隆抗體。用于成軟骨表達(dá)的一抗： ii型膠原(collagen type ii ),購自santa cruz,兔抗多克隆抗體。用于成骨誘導(dǎo)檢測的鈣結(jié)節(jié)染色為茜素紅和von kossa；成

13、脂誘導(dǎo)檢 測的為油紅0染色。2結(jié)果2. imscs及誘導(dǎo)后細(xì)胞的形態(tài)原代培養(yǎng)的mscs形態(tài)表現(xiàn)為條索狀或是具有明顯折光性的圓形，少 數(shù)呈多角狀，個(gè)別不規(guī)則，胞核明顯，可見12個(gè)核仁。7d后，細(xì) 胞增殖變密集，條索狀細(xì)胞增多。14d時(shí)細(xì)胞已可長滿培養(yǎng)瓶底，細(xì) 胞呈條索狀排列牛長。第二代細(xì)胞形態(tài)比較規(guī)則，大多數(shù)呈條索狀。 第三代細(xì)胞可呈漩渦狀生長。成骨誘導(dǎo)后7 d可見細(xì)胞開始變得扁平，呈多角形，10 d已可見大 量細(xì)胞聚集形成大小不等的結(jié)節(jié),21 d可見大量鈣化的結(jié)節(jié)和結(jié)晶體。 成軟骨誘導(dǎo)3 d即可見細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，7 d可見分泌的 基質(zhì)將細(xì)胞包裹形成白色的細(xì)胞團(tuán)，21 d時(shí)細(xì)胞團(tuán)變得更

14、緊密。成脂 誘導(dǎo)7 d可見胞漿內(nèi)脂滴出現(xiàn)，以后脂滴逐漸增多變大，細(xì)胞核被增 大的脂滴擠至胞漿的一側(cè)，21 d可見大量充滿脂滴的細(xì)胞出現(xiàn)在視野 中。2. 2mscs表面分子的表達(dá)第三代mscs的表面分子cd29陽性率為98.70%, cd44陽性率為 99. 54%,而cd62l陽性率僅為1. 10%, cd45則為0. 73%。第一代至第 三代mscs的cd29和cd44雙染后cd29陽性率依次為67. 94%、8171 % 和 98. 30%；而 cd44 陽性率依次為 99.36%、99.67%和 99. 51 %。2. 3mscs成骨、成軟骨和成脂誘導(dǎo)后相關(guān)基因的表達(dá)mscs經(jīng)過成骨誘導(dǎo)

15、21 d后，cbfa 1、i型膠原、alp和骨橋蛋白 基因表達(dá)，而骨結(jié)合素基因未表達(dá)。經(jīng)過成軟骨誘導(dǎo)21 d后，ii型膠 原、iia/b型膠原和x型膠原基因表達(dá)。經(jīng)過成脂誘導(dǎo)21 d后，ppar y基因表達(dá)。2. 4mscs成骨、成軟骨和成脂誘導(dǎo)后免疫組化和病理染 色檢測mscs經(jīng)過成骨誘導(dǎo)21 d后，i型膠原組化染色可見細(xì)胞漿里充滿棕 黃色的顆粒，胞核著藍(lán)色；骨鈣素染色也可見大量陽性棕黃色顆粒。mscs成軟骨誘導(dǎo)21 d后，ii型膠原染色可見胞漿和細(xì)胞外基質(zhì)著棕 黃色。茜素紅和von kossa染色可見經(jīng)過成骨誘導(dǎo)21 d后的細(xì)胞分泌 的細(xì)胞外基質(zhì)著色；油紅0染色可見成脂誘導(dǎo)21 d的細(xì)胞胞

16、漿里的油 滴呈桔紅色，胞核呈藍(lán)色。3討論骨髓mscs主耍來源于骨髓網(wǎng)狀間質(zhì)，在骨髓中含量很低，估計(jì)約 0.001%0.01% 1,因此，從骨髓中分離、培養(yǎng)達(dá)到一定數(shù)量滿足 實(shí)驗(yàn)和臨床需求就顯得尤為重要。利用密度剃度離心的方法獲得骨髓 中單個(gè)核細(xì)胞，進(jìn)而再利用貼壁特性純化細(xì)胞,提高了 mscs的克隆性。 木實(shí)驗(yàn)證實(shí),利用此種方法獲得的山羊的mscs具有良好的克隆形成能 力，原代培養(yǎng)5 d即可形成明顯的克隆，14d即可長滿單層傳代。體 外傳12代，細(xì)胞增殖能力仍較強(qiáng)，形態(tài)良好，仍具備多潛能分化能力。mscs的鑒定口前尚缺乏嚴(yán)格、統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)細(xì)胞治療國際社會(huì) 推薦的標(biāo)準(zhǔn) （internation

17、al society for cellular therapy, isct）8 ,人的mscs的鑒定標(biāo)準(zhǔn)如下：細(xì)胞表現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，可 以貼壁生長；具有特異的表面分子表達(dá)；具有向骨細(xì)胞、軟骨細(xì) 胞和脂肪細(xì)胞分化的多潛能。該標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)提出標(biāo)準(zhǔn)和在各種動(dòng)物 間都符合，但是標(biāo)準(zhǔn)在各動(dòng)物間可能存在差異。本研究分離純化得 到的mscs具有貼壁生長的特性，形態(tài)類似成纖維細(xì)胞；笫三代mscs 表面分子cd29和cd44陽性（比例大于95%）,而cd45和cd62l陰性（比例小于2%）；通過成骨、成軟骨和成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)21 d后, 通過i型膠原和骨鈣素免疫組化染色以及茜素紅和von kossa病理染

18、色證實(shí)分化為成骨細(xì)胞，通過ii型膠原免疫組化染色證實(shí)分化為軟骨 細(xì)胞，通過油紅0染色證實(shí)分化為脂肪細(xì)胞。進(jìn)一步，我們還通過檢 測相應(yīng)的成骨、成軟骨和成脂肪基因的表達(dá)來證實(shí)mscs的分化情況。 因此，根據(jù)目前比較廣泛的可被大多數(shù)研究者接受的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，我們 從山羊骨髓中獲取的這些細(xì)胞即是mscs,其具有mscs的基本特性。骨缺損修復(fù)一直是醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，迄今為止，臨床上對于創(chuàng) 傷、感染和腫瘤等造成的大范圍的骨缺損的修復(fù)治療仍舊缺乏理想的 解決方案。伴隨著組織工程概念的提出，在骨組織的缺損替代治療方 面，通過mscs結(jié)合組織工程支架材料構(gòu)建的組織工程骨表現(xiàn)出良好的 應(yīng)用前景。已有大量的研究顯示

19、911,通過應(yīng)用mscs和支架材料體外構(gòu)建的復(fù)合物，可以顯著增強(qiáng)移植物在節(jié)段性骨缺損處形成骨 組織，有利于缺損的修復(fù)。這些為我們希望通過mscs作為種子細(xì)胞構(gòu) 建抗感染的組織工程骨，修復(fù)由于感染造成的骨缺損奠定基礎(chǔ)，也將 成為我們應(yīng)用mscs修復(fù)骨缺損的理論依據(jù)。【參考文獻(xiàn)】1 pi ttenger mf, mackay am, beck sc, et al. mui tilineage potential of adult human mesenchymal stem cells j science, 1999, 284(5411):143-147.2 jiang y, jahagirdar

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