第五 高效液相色譜法PPT課件

1、2021-11-17石油醚碳酸鈣顆粒色素玻璃柱p 液相色譜是如何完成混合物的分離？ 混合物中各組分在固定相和流動相之間會發(fā)生吸附、溶解或其他親和作用，這種作用存在差異，從而使各組分在色譜柱中的遷移速度不同得到分離第1頁/共64頁分析對象及范圍流動相的選擇操作條件GC能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣品，占有機(jī)物的20%流動相為有限的幾種“惰性”氣體，只起運(yùn)載作用，對組分作用小加溫常壓操作HPLC溶解后能制成溶液的樣品，高沸點(diǎn)、高分子量、難氣化、離子型的穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，占有機(jī)物的80%流動相為液體或各種液體的混合。它除了起運(yùn)載作用外，還可通過溶劑來控制和改進(jìn)分離。室溫、高壓下進(jìn)行第2頁/共6

2、4頁2021-11-17二、 高效液相色譜的類型及選擇1. 分配色譜（液分配色譜（液-液分配色譜）液分配色譜）p 液液分配色譜法 固定相 將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面 化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的有機(jī)鍵合層 如C18（十八烷基硅烷）、 C8（辛烷基）、氨基鍵合硅膠 固定相類型 極性固定相：正相色譜（適合于分析極性化合物）以極性有機(jī)基團(tuán)如胺基（-NH2）、腈基（-CN）、醚基（-O-）等鍵合在硅膠表面制成的 非極性固定相：反相色譜（適合于分析非極性化合物）反相色譜法最常用的固定相是C18、C8和苯基鍵合相的填料，在分離極性很大的化合物時，也可以采用氨基、氰基等極性基團(tuán)鍵合固定相。第3頁/共64頁2

3、021-11-17 第4頁/共64頁2021-11-17正相色譜法 反相色譜法 1.極性固定相 聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相 2.相對非極性流動相 正已烷、環(huán)已烷 3.極性調(diào)節(jié)劑 乙醇、四氫呋喃、三氯甲烷 4.分離中等極性和極性較強(qiáng)化合物.酚類、胺類、羰基類及氨基酸類 5.組分流出順序 極性小先洗出 1.非極性固定相 C18（簡稱ODS） 、C8 2.極性流動相 水或緩沖液 3.極性調(diào)節(jié)劑 甲醇、乙腈、四氫呋喃4.分離非極性和極性較弱化合物 占整個HPLC應(yīng)用的80%左右 5.組分流出順序 極性大先洗出 液液分配色譜第5頁/共64頁2021-11-172. . 吸附色譜（液吸附色譜（液- -固吸

4、附色譜）固吸附色譜） p 液固吸附色譜法固定相：吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5-10m流動相：有機(jī)溶劑適用于分離分子量200-1000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物的分離，常用于分離同分異構(gòu)體。p各組分的出峰順序 極性較小組分，吸附力較弱，容易解吸，先流出。 極性較大組分滯留作用大，后流出。 飽和烴 烯 芳烴 醚 醛酮 酸第6頁/共64頁2021-11-17吸附脫附再吸附再脫附 分離過程是一個吸附脫附的平衡過程。p 液固吸附色譜法分離機(jī)理第7頁/共64頁2021-11-17p離子交換色譜法固定相:離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基 陽離子交換

5、樹脂在表面未端芳環(huán)上接上季胺基 陰離子交換樹脂流動相：電解質(zhì)溶液、有機(jī)弱酸或有機(jī)弱酸鹽溶液2. 離子交換色譜法第8頁/共64頁2021-11-17p離子交換色譜法分離原理 樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的 離子進(jìn)行可逆交換而分離。應(yīng)用 離子交換色譜法主要用于分析陰，陽離子，凡是在溶劑中能夠電離 的物質(zhì)通常都可以用離子交換色譜法來進(jìn)行分離。分析物質(zhì) 有機(jī)酸、氨基酸、多肽及核酸。 離子交換色譜法分離機(jī)理第9頁/共64頁2021-11-174. 4. 凝膠色譜凝膠色譜（空間排阻色譜）以凝膠為固定相。凝膠是一種經(jīng)過交聯(lián)的、具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和不同孔徑的多聚體的通稱。如葡聚糖凝膠、

6、瓊脂糖等軟質(zhì)凝膠；多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等硬質(zhì)凝膠。第10頁/共64頁2021-11-17p正確地選擇色譜類型盡可能多的了解樣品性質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)極性和穩(wěn)定程度水中和有機(jī)溶劑中溶解度相對分子質(zhì)量的大小熟悉各種色譜類型主要特點(diǎn)應(yīng)用范圍色譜類型選擇第11頁/共64頁2021-11-17色譜類型選擇第12頁/共64頁2021-11-17問題討論p按固定相與流動相相對極性的不同，液液分配色譜可分為哪兩類方法？現(xiàn)在有A、B兩物質(zhì)，極性AB，問在兩種液液分配色譜上的出峰順序如何？p宜用何種HPLC方法分離下列物質(zhì)？(1) 乙醇和丁醇； (2) Ba2+和Sr2+； (3) 高摩爾質(zhì)量的葡糖苷第13頁/共64頁2

7、021-11-17三、高效液相色譜儀1.1.流程流程第14頁/共64頁2021-11-17液相色譜法分析流程第15頁/共64頁2021-11-172.主要部件主要部件(1) 高壓輸液泵高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150350105Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（甲酰胺乙腈甲醇乙醇丙醇丙酮二氧六環(huán)四氫呋喃甲乙酮正丁醇乙酸乙酯乙醚異丙醚二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳環(huán)己烷己烷煤油(最小)第38頁/共64頁2021-11-17采用“HPLC”級溶劑避免使用會引起柱效損失或保留特性變化的溶劑對試樣有適宜的溶解度溶劑粘度要小與檢測器相匹配第39頁/共64頁2021-11-17溶劑等級

8、 水的等級 純化水 蒸餾水 去離子水波長(nm)純化水去離子水因?yàn)椴患兾锏拇嬖?，去離子水的吸光率較高純化水中去除了無機(jī)和有機(jī)的污染物純化水中去除了無機(jī)和有機(jī)的污染物第40頁/共64頁2021-11-17甲醇乙睛正己烷分析純級(實(shí)線）和HPLC級溶劑（虛線）的吸光度比較溶劑等級第41頁/共64頁2021-11-17緩沖液的使用緩沖液的使用使用前必須過濾使用后一定要對柱子進(jìn)行清洗，以免造成腐蝕、磨損及阻塞:首先用純水沖洗30-60min（0.1-0.5ml/min），再用甲醇沖洗30min(0.1-0.5ml/min)易受到細(xì)菌和霉菌的影響溶劑等級注意沖洗次序，不能直接用有機(jī)溶劑沖洗第42頁/共6

9、4頁2021-11-17 過濾：0.45um或更小孔徑濾膜 目的：除去溶劑中的微小物理顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是在使用無機(jī)鹽配制的緩沖液的時候必須過濾 脫氣：除去在流動相中溶解或彼此混合而產(chǎn)生的氣泡 氣泡對測定的影響： 1）泵中氣泡使液流波動，改變保留時間和峰面積 2）柱中氣泡使流動相繞流，峰變形 3）檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波動 無在線脫氣應(yīng)注意： 1）每天脫氣 2）如使用氦脫氣，對混合溶劑脫氣時間不能過長溶劑前處理第43頁/共64頁2021-11-17p配制流動相把二次蒸餾水和色譜純級甲醇以一定比例混合取混合均勻的溶液，經(jīng)0.45m的有機(jī)膜過濾，再脫氣15分鐘即可第44頁/共64頁2021

10、-11-17選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題：（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。相等。（3）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。淀并在柱中沉積。（4）流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外）流動相同時還應(yīng)滿

11、足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。第45頁/共64頁2021-11-17六、液相色譜分析方法色譜分析的目的對未知組分進(jìn)行定性分析對已知組分進(jìn)行定量分析根據(jù)色譜圖上某個色譜峰的保留時間和該色譜峰在檢測器上的響應(yīng)強(qiáng)度，對該譜峰初步定性和定量分析。第46頁/共64頁鑒別每個色譜峰 通過比較保留值(通常是保留時間)的方法，找到各色譜峰所對應(yīng)的組份 大多數(shù)情況下用比較保留時間來定性即所謂： 保留時間相同，可能是同樣的組份 保留時間不同，肯定不是同樣的組份第47頁/共64頁1 已知物保留值直接對照法定性未知峰保留值(tR)與某標(biāo)準(zhǔn)物完全相同，可初步確

12、定為同一物質(zhì)改變色譜柱或流動相組成，二者保留值仍完全相同，則可認(rèn)定為同一物質(zhì)優(yōu)點(diǎn)：簡單缺點(diǎn)：適用范圍窄；必須有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)第48頁/共64頁用“標(biāo)樣”的保留值定出被測組份的位置0.000.050.100.150.200.250.300.350.400.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00AUMinutesUracilEthylparabenPropylparaben第49頁/共64頁2 利用文獻(xiàn)保留值數(shù)據(jù)進(jìn)行比對定性文獻(xiàn)報道的保留值數(shù)據(jù)只能作為定性參考，液相色譜柱填柱技術(shù)復(fù)雜，重現(xiàn)性差；條件不允許，難以得到相同色譜條件

13、（儀器色譜柱、試劑等）可根據(jù)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)和對照品選用已知標(biāo)準(zhǔn)物，再用已知標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行定性3 利用已知物增加峰高法定性將已知標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加到待測樣品，若某一峰增高，且改變色譜柱或流動相組成后仍能使該峰增高，則可基本認(rèn)定該峰與已知標(biāo)準(zhǔn)物為同一物質(zhì)。第50頁/共64頁如果標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺乏或難以獲得；或由于結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)相似，很多物質(zhì)具有十分接近，甚至相同的保留值，則保留值定性準(zhǔn)確度存在疑問紅外光譜、紫外光譜、核磁共振波譜和質(zhì)譜對有機(jī)化合物有很強(qiáng)的定性能力，可用于定性HPLC-紫外光譜已作為液相色譜的常規(guī)檢測器使用；HPLC-MS和HPLC-NMR也十分成熟。第51頁/共64頁2021-11-17在定性的基礎(chǔ)上定量

14、,需有純物質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)物液相色譜定量是相對定量的方法:即由已知量的純標(biāo)樣推算混合物中被測物的量液相色譜法定量的依據(jù)是: 被測組分的量與響應(yīng)值(峰高或峰面積)成正比由已知量的標(biāo)樣可求得定量校正因子定量校正因子:是定量計算公式中的比例常數(shù),其物理意義是單位響應(yīng)值(峰面積)所代表的被測組分的量測定未知組分的響應(yīng)值,通過定量校正因子即可求得其含量第52頁/共64頁常用定量分析方法歸一化法標(biāo)準(zhǔn)曲線法內(nèi)標(biāo)法按測量參數(shù)分為峰面積法和峰高法第53頁/共64頁2021-11-17項目內(nèi)容定量方法歸一化法要求1、樣品中各組分均出峰，完全分離，且均有響應(yīng)；2、進(jìn)樣量無須準(zhǔn)確。計算公式方法特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：簡便、精確，進(jìn)樣量的

15、多少與測定結(jié)果無關(guān)，操作條件（如流速，柱溫）的變化對定量結(jié)果的影響較小。但由于液相色譜所用檢測器為選擇性檢測器，對很多組分沒有響應(yīng)，因此液相色譜法較少使用歸一化法。%100iiiAAw1. 歸一化法第54頁/共64頁2021-11-17p用高效液相色譜法測定吲哚二羧酸中主成分的含量，已知在分析條件下所有組分都出峰，且分離完全，根據(jù)測定數(shù)據(jù)計算吲哚羧酸中主成分（出峰時間在5.7min左右）的含量。序號12345保留時間/min3.543.964.825.727.15峰面積/mVmin762011694460553251064372%47.99437253251064605116947620532

16、5106AAwi4解：第55頁/共64頁2021-11-172. 外標(biāo)法p工作曲線法p外標(biāo)一點(diǎn)法第56頁/共64頁配制一系列已知濃度的標(biāo)樣第57頁/共64頁 實(shí)際色譜圖05010015020025001,0002,0003,0004,0005,000樣品濃度響應(yīng)值峰面積()0 .0 00 .0 50 .1 00 .1 50 .2 00 .2 50 .3 00 .0 00 .5 01 .0 01 .5 02 .0 02 .5 03 .0 03 .5 04 .0 04 .5 05 .0 05 .5 06 .0 06 .5 07 .0 0M in u te s0 .0 00 .0 50 .1 00

17、.1 50 .2 00 .2 50 .3 00 .0 00 .5 01 .0 01 .5 02 .0 02 .5 03 .0 03 .5 04 .0 04 .5 05 .0 05 .5 06 .0 06 .5 07 .0 0M in u te s0 .0 00 .0 50 .1 00 .1 50 .2 00 .2 50 .3 00 .0 00 .5 01 .0 01 .5 02 .0 02 .5 03 .0 03 .5 04 .0 04 .5 05 .0 05 .5 06 .0 06 .5 07 .0 0M in u te s標(biāo)準(zhǔn)曲線第58頁/共64頁 計算公式 特點(diǎn) 無需各組份都被檢出、洗脫 需要標(biāo)樣 標(biāo)樣及樣品測定的條件要一致 進(jìn)樣體積要準(zhǔn)確iXiiiXARFCXRXCRFii樣品響應(yīng)值未知組分的濃度標(biāo)樣響應(yīng)值標(biāo)樣濃度校正因子)()()()(第59頁/共64頁內(nèi)標(biāo)法定量內(nèi)標(biāo)法定量 配制一系列濃度的標(biāo)樣，其中加有內(nèi)標(biāo)樣第60頁/共64頁 實(shí)際色譜圖0.000.200.400.600.801.001.201.401.601.802.002.503.003.504.004.505.005.506.00voltsMinutesM ethylParabenEthylParabenPropylParabenButylParaben050100150200250010203040