蛋白質組學研究揭示的植物細胞壁逆境應答蛋白質

1、    蛋白質組學研究揭示的植物細胞壁逆境應答蛋白質    馬曉琳趙琪戴紹軍摘要 細胞壁是植物細胞最外層的屏障，參與細胞支撐、物質運輸與抵御逆境等過程。近年來，定量蛋白質組學技術被應用于植物細胞壁逆境應答調控機制的研究，已經報道了小麥、玉米、大豆和番茄等植物根、下胚軸和莖等器官細胞壁應答生物脅迫（如青枯病菌感染）與非生物脅迫（如水淹和缺水）過程的蛋白質變化，為揭示細胞壁逆境應答機制提供了新線索。關鍵詞 植物；細胞壁；逆境脅迫；蛋白質組學中圖分類號 s757.2+1 文獻標識碼 a 文章編號 1007-5739（2016）08-0151-03abstrac

2、t cell wall acts as the barrier for plant cells and plays important roles in cell structure，material transport，and response to environmental stresses.in recent years，quantitative proteomics technologies have been applied to investigate the regulatory mechanism underlying plant cell wall stress respo

3、nses.the expression patterns of 308 differentially abundant proteins in cell wall were studied in roots，hypocotyls and stems of wheat （triticum aestivum），maize （zea mays），soybean （glycine max） and tomato （solanum lycopersicum and solanum pimpinellifolium） in response to biotic stresses （e.g.，ralston

4、ia solanacearum infection） and abiotic stresses （e.g.，flooding and water deficit）.this paper gave an integrative analysis of these results and provided new clues for understanding the environmental stress-responsive network in plant cell wall.key words plant；cell wall；stress；proteomics.細胞壁是植物細胞最外層的屏

5、障，最先感知脅迫信號1，并將脅迫信號轉導至細胞內，調節(jié)細胞生命活動2。細胞壁是由多聚糖、酶和結構蛋白構成的網狀結構3。細胞壁成分的變化影響其延展性、機械支撐與物理防御功能。在應對脅迫時，細胞壁蛋白質在細胞壁結構、代謝、信號轉導方面起重要作用4。近年來，細胞壁蛋白質分離技術的完善，以及蛋白質組學研究平臺的建立，為高通量、大規(guī)模地研究細胞壁蛋白質組成與功能奠定了基礎。已經報道了小麥（triticum aestivum）2、玉米（zea mays）1、大豆（glycine max）5和番茄（solanum lycopersicum和solanum pimpinellifolium）6等植物根、下胚軸

6、和莖等器官的細胞壁在應答生物脅迫如青枯病菌（ralstonia solanacearum）感染與非生物脅迫（如水淹和缺水脅迫）過程中的308種豐度差異蛋白質。本文整合分析了這些蛋白質表達模式的變化特征，為全面理解細胞壁逆境應答分子機制提供了新線索。1 細胞壁重塑相關蛋白質聚糖是植物細胞壁的主要組成成分，參與細胞壁糖類物質調節(jié)的蛋白質的豐度變化在應對外界脅迫過程中至關重要。蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)，在缺水脅迫下，玉米根細胞壁中的葡聚糖酶（glucanase）、-l-阿拉伯呋喃糖酶/-d-木糖苷酶同工酶（-l-arabinofuranosidase/-d- xylosidase isoenzyme，ar

7、a）、-d木糖酶（-d-xylosidase）、半乳糖苷酶（-gala-ctosidase）和半乳糖苷酶（-galactosidase）的豐度均下降，葡糖苷酶（-glucosidase）豐度也改變1，而在水淹脅迫的小麥根細胞壁內豐度下降2。該類蛋白質主要是通過參與調解細胞壁內糖類物質的代謝過程來抑制細胞壁松弛，從而應對外界脅迫。葡糖苷酶還可通過對脫落酸葡萄糖酯的水解作用調節(jié)aba在根部的積累，進而調節(jié)根延伸生長，從而應對缺水脅迫。果膠是細胞壁的重要組成成分。果膠酯酶（pectinesterase）可以水解聚半乳糖醛酸并形成果膠酸酯凝膠，此過程有利于細胞壁的固化3。蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)，青枯病菌感

8、染的番茄莖細胞壁內6，果膠酯酶可通過增強細胞壁去甲酯化作用固化細胞壁，從而應對外界脅迫。參與細胞壁代謝相關酶的抑制蛋白雖然不能直接作用于細胞壁組分，但它們間接地影響細胞壁組分的降解或合成。多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（polygalacturonase inhib-itor protein，pgip）能夠抑制由真菌或細菌病原體產生的多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，pg）活性。pg可以降解植物細胞壁中的多聚半乳糖醛酸多糖成分，導致細胞壁降解。蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)，缺水脅迫導致玉米根細胞壁中pgip的豐度變化1，這可能是通過調節(jié)pg參與的植物細胞壁重塑過程應對脅迫7。內源-淀粉酶/

9、枯草桿菌蛋白酶抑制蛋白（-amylase/subtilisin inhibitor）可以抑制-淀粉酶水解。此外，水淹脅迫導致小麥根細胞壁內的-淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制蛋白豐度下降，這有助于降低對-淀粉酶的抑制作用，從而增強細胞壁的延展性來，應對水淹造成的滲透脅迫2。內木葡聚糖轉移酶（endoxyloglucan transferase，ext）可催化木葡聚糖分子內和分子間的拼接，進而調節(jié)植物細胞壁內木葡聚糖間的分子交聯(lián)8。細胞壁的膨脹過程是通過葡聚糖和纖維素微纖絲等物質的嵌入來維持細胞壁的機械厚度及特性來實現(xiàn)的，這一過程依賴ext的催化作用8。木葡聚糖內切轉糖基酶（xyloglucan en

10、do-transglycosylase，xet）也與細胞壁松弛相關，具有催化木葡聚糖切割和重組的功能8-9。蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)，ext和xet在缺水脅迫的玉米根細胞壁中豐度均下降，這表明植物可以通過抑制細胞壁的膨脹應對缺水脅迫1，9。此外，甲硫氨酸合酶（methionine synt-hase，mets）催化甲硫氨酸的合成，早期人們認為mets是一種胞質蛋白質10。隨著研究的深入，komatsu等5發(fā)現(xiàn)mets是一種不具有分泌肽信號的細胞壁蛋白。在干旱脅迫條件下，鷹嘴豆細胞壁中mets豐度上升能促進甲硫氨酸合成，增加s-腺苷-甲硫氨酸積累，為木質素前體的甲基化提供甲基基團10，這有助于植物通過

11、調節(jié)細胞壁木質化程度來應對干旱脅迫。在水淹脅迫下，大豆下胚軸5與小麥根2細胞壁內mets的豐度下降會抑制木質素合成，這有利于植物通過維持細胞壁的延展性來應對水淹脅迫。2 細胞壁抗氧化、滲透和病原體侵染脅迫相關蛋白質在脅迫條件下植物細胞會產生大量的活性氧自由基（reactive oxygen species，ros）11。ros會與蛋白質、dna和脂質等相互作用，進而抑制光合作用、增強電解質滲透率、加快細胞衰老和細胞凋亡12。細胞壁內ros清除機制的研究起始于對胡蘿卜（daucus carota）細胞非原生質體氧化爆發(fā)的研究，該研究表明，非原生質體內的氧化爆發(fā)是整個細胞氧化爆發(fā)的必要條件13。在

12、應對氧化脅迫時，植物通過調節(jié)體內抗氧化酶或非酶系統(tǒng)來維持ros的平衡。蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)，過量ros引發(fā)的氧化脅迫導致抗氧化酶豐度改變1，5，包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，sod）、過氧化氫酶（catalase，cat）、過氧化物酶（peroxidase，pod）、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，apx）和乙二醛酶（glyoxalase，glo）等。蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)，在缺水脅迫條件下的玉米根細胞壁內，sod、pod和apx豐度均上升1，而受水淹脅迫的大豆細胞壁內sod豐度下降5。番茄莖細胞壁的cat在響應青枯病菌脅迫時豐度下降6。

13、以上結果表明，通過調節(jié)細胞壁內h2o2的積累可調節(jié)酚類物質氧化成苯氧基的過程，從而影響木質素的聚合反應，進而通過控制細胞壁的機械厚度來應對水分脅迫1或病原菌入侵6。此外，蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)，在玉米根1、番茄莖6及小麥根2的細胞壁內的glo和谷氨酰轉肽酶（-glutamyl transpepti-dase，ggt）在應對外界脅迫時豐度也發(fā)生變化。glo和ggt可參與調節(jié)還原型谷胱甘肽（gsh）的代謝。還原性的gsh可清除過量的ros，高濃度的gsh還可以誘導植物抗毒素和木質素合成相關基因的表達14。這表明，glo和ggt通過調節(jié)gsh在細胞壁內的積累影響細胞壁內ros清除及木質素合成來應對脅迫。

14、此外，水淹脅迫的小麥根細胞壁中苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，pal）豐度下降2。pal催化l-苯基丙氨酸去氨基化生成氨及反式肉桂酸，肉桂酸再經過甲基化等一系列反應形成木質素單體，最終木質素單體聚合形成木質素15。因此，pal豐度的下降可能是通過減少細胞壁中木質素的合成降低細胞壁的木質化程度，從而增強其延展性應對水淹脅迫。缺水脅迫會促進植株體內滲透保護物質的合成。甜菜堿是一種重要的滲透調節(jié)保護物質。腺苷濃度與腺苷激酶（aden-osine kinase，adk）的活性可能影響著植物體內甜菜堿的合成。 蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)，在缺水脅迫條件下玉米根細胞壁內ad

15、k豐度變化1，可能影響依賴s腺苷-甲硫氨酸的甲基化作用進而影響甜菜堿的合成來應對缺水脅迫。幾丁質酶（chitinase）可以催化-1，4鍵連接的聚糖（如幾丁質）水解16。幾丁質是真菌細胞壁的組成成分，雖然在植物體內尚未發(fā)現(xiàn)幾丁質，但幾丁質酶在動植物體響應病原體入侵時發(fā)揮重要作用16。蛋白質組學研究為此提供了證據，在青枯病菌感染的番茄莖細胞壁中幾丁質酶豐度上升，這有助于水解青枯病菌的幾丁質6。蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)幾丁質酶的豐度在水淹脅迫的小麥根細胞壁內上升2，而在缺水脅迫的玉米根細胞壁內下降1。這表明，細胞壁內的幾丁質酶在植物應對水淹與干旱等非生物脅迫中也發(fā)揮了重要作用2。r40c1蛋白含有一個富

16、含組氨酸殘基的金屬結合域，其通過形成螺旋結構與膜蛋白結合，從而響應多種脅迫17。缺水脅迫導致玉米根細胞壁中r40c1豐度上升1，在干旱脅迫的玉米幼苗中r40c1發(fā)生去磷酸化11。這表明，r40c1可能通過磷酸化/去磷酸化過程應答干旱脅迫。此外，小麥萌發(fā)素類蛋白（germin like protein，glp）是小麥胚發(fā)芽時在細胞壁內合成的同源五聚體糖蛋白。在小麥萌發(fā)和成熟過程中，細胞壁選擇性地與不同亞型的glp結合18。萌發(fā)素（germin）是一類定位于胞外基質，并與glp序列高度同源的蛋白質18，具有草酸鹽氧化酶、sod和glp活性，以及結構蛋白的功能。蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)，水淹脅迫的小麥根2

17、及大豆下胚軸5細胞壁內的萌發(fā)素與glp豐度均下降，而在缺水脅迫的玉米根細胞壁中豐度上升1。這表明，萌發(fā)素與glp能通過調節(jié)細胞壁交聯(lián)水平等多種途徑來應對不同脅迫。3 細胞壁修飾相關蛋白質-1，4-葡聚糖蛋白合成酶催化udp-葡聚糖和蛋白質相互作用生成-d-葡糖基化蛋白和udp無導肽蛋白（leaderless secretory protein，lsp），大部分lsp與脅迫或病原體入侵相關19。蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)，水淹脅迫的小麥根細胞壁及干旱處理的玉米根細胞壁內，-1，4-葡糖化蛋白合成酶的豐度發(fā)生變化1-2。這表明，-1，4-葡糖化蛋白合成酶通過調節(jié)蛋白質與細胞壁聚糖的作用影響細胞壁疏松程度，

18、應對水分脅迫。亞麻酶是另一種參與蛋白質加工的蛋白，可水解絲氨酸殘基，且僅在細胞壁內具有活性20，并可參與響應機械損傷21。蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)，青枯病菌侵染的番茄莖細胞壁內的亞麻酶豐度上升6。此外，nacl脅迫的水稻根細胞壁亞麻酶豐度下降，可能是通過減弱對細胞壁內蛋白質的水解作用，進而維持細胞壁機械厚度來應對鹽脅迫9，20。此外，缺水脅迫下玉米根細胞壁中亮氨酸氨基肽酶（leucine aminopeptidase，lap）豐度上升1。lap參與貯藏蛋白的水解過程進而釋放氨基酸22。同時，蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)水淹條件下大豆下胚軸細胞壁中的莖28 kda糖蛋白（stem 28 kda glycopro

19、tein）和莖31 kda糖蛋白（stem 31 kda glycoprotein）豐度下降5。這些糖蛋白參與早期細胞壁的生長過程，同時也作為催化劑或結構蛋白行使功能。此外，水淹脅迫的玉米根細胞壁中半胱氨酸蛋白酶抑制劑（cysteine proteinase inhibitor）豐度下降。半胱氨酸蛋白酶可由內質網轉運至細胞壁23，通過水解儲藏蛋白參與貯藏蛋白的動員過程23。半胱氨酸蛋白酶抑制劑可能通過抑制半胱氨酸蛋白酶的活性使細胞壁變得松弛，從而響應水淹脅迫。4 細胞壁內其他代謝機制在植物體內蔗糖可能通過質外體轉運和韌皮部裝載過程從葉片中轉移至植物的其他組織消耗利用。蔗糖進入細胞壁后被水解為果

20、糖和葡萄糖，這些游離的己糖需要被磷酸化，才能防止被薄壁組織或葉肉組織再吸收利用而不能裝載到韌皮部中。果糖激酶（fructokinase）催化三磷酸腺苷的磷酸基團轉移至果糖，形成二磷酸腺苷和1-磷酸果糖。蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)，在病原體侵染的番茄莖細胞壁中果糖激酶豐度上升6，這表明植物可能通過增強細胞壁內果糖的磷酸化，從而實現(xiàn)糖類轉運來應對脅迫。植物可以通過調節(jié)細胞壁內脂質代謝相關酶的活性來應對脅迫1。蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)，缺水脅迫2 d的玉米根細胞壁中脂酶（lipase）豐度變化1。脂酶可以水解三酰甘油生成脂肪酸和甘油。其n端具有一個典型的分泌肽信號（secretory signal peptide

21、），因此可被分泌到細胞壁，脂酶在植物應對真菌脅迫過程中起重要作用。此外，脂氧合酶（lipoxygenases，lox）可催化脂肪酸的氧化，生成脂肪酸過氧化物，如茉莉酸（jasmonic acid，ja）。ja及其具有揮發(fā)性的衍生物茉莉酸甲酯可以作為信號分子在防御脅迫中發(fā)揮重要作用20。蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)，水淹脅迫的小麥根細胞壁中l(wèi)ox豐度下降2，表明水淹脅迫影響小麥根部的信號轉導過程1。蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)，蘋果酸脫氫酶（malate dehydrog-enase，mdh）可調節(jié)蘋果酸的合成和氧化，是蘋果酸代謝機制中的一種關鍵酶。sukalovic等21發(fā)現(xiàn)mdh以共價鍵或離子鍵與細胞壁結合。細

22、胞壁mdh主要通過蘋果酸草酰乙酸的穿梭機制為細胞壁中的pod提供nadh。蘋果酸草酰乙酸的穿梭機制是通過分別定位于細胞壁與細胞膜上的mdh催化，利用蘋果酸與草酰乙酸的相互轉換來實現(xiàn)nad+與nadh之間的轉換，細胞內生成的nadh通過這一轉運機制穿過細胞膜到達細胞壁，為細胞壁pod提供還原力清除h2o2。缺水處理的玉米根細胞壁中mdh與pod豐度上升，這有助于玉米應對干旱脅迫引發(fā)的氧化脅迫1。然而，水淹脅迫2 d的小麥根細胞壁中的mdh豐度下降，表明植物應對不同脅迫時選擇性地啟動基于mdh的pod途徑2。蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)缺水處理的玉米根細胞壁中磷酸丙糖異構酶（triose-phosphate

23、 isomerase，tpi）豐度下降，且其可能定位于細胞壁1。tpi催化半乳糖異構反應生成d-葡萄糖-6-磷酸，后者參與糖酵解過程。tpi含有一個半乳糖變旋酶類蛋白的功能結構域。在半乳糖轉化成葡萄糖的過程中，半乳糖變旋酶催化-d-半乳糖異構化成-d-半乳糖24。-d-半乳糖可由細胞壁向細胞內運輸，在其運輸過程中有效地實現(xiàn)了脅迫信號從細胞壁向細胞質的傳遞以及半乳糖向葡萄糖的轉化。5 結論細胞壁作為植物細胞最外層的屏障，能將脅迫信號傳遞到細胞內，從而影響細胞內的代謝活動。蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)，在應答逆境脅迫過程中，植物細胞壁蛋白質通過調節(jié)細胞壁重塑、脅迫防御、糖與能量代謝以及其他代謝過程來維持細胞

24、壁穩(wěn)態(tài)，應對外界脅迫。在此基礎上，今后需要進一步研究細胞壁蛋白質的翻譯后修飾與相互作用關系，為解釋植物細胞壁逆境應答機制提供更多有價值的信息。6 參考文獻1 zhu j，alvarezl s，marsh e-l，et al.cell wall proteome in the maize primary root elongation zone.ii.region-specific changes in water soluble and lightly ionically bound proteins under water deficitj.plant physiol-ogy，2007，14

25、5（4）：1533-1548.2 kong fj，oyanagu a，komatsu s.cell wall proteome of wheat roots under flooding stress using gel-based and lc ms/ms-based proteomics approachesj.biochimica et biophysica acta （bba）-proteins and pro-teomics，2010，1804（1）：124-136.3 micheli f.pectin methylesterases：cell wall enzymes with i

26、mportant roles in plant physiologyj.trends in plant science，2001，6（9）：414-419.4 zhu j，chen s，alvarez s，et al.cell wall proteome in the maize pri-mary root elongation zone.i.extraction and identification of water-soluble and lightly ionically bound proteinsj.plant physiology，2006，140（1）：311-325.5 kom

27、atsu s，kobayashi y，nishizawa k，et al.comparative prote-omics analysis of differentially expressed proteins in soybean cell wall during flooding stressj.amino acids，2010，39（5）：1435-1449.6 dahal d，pich a，braun hp，et al.analysis of cell wall proteins reg-ulated in stem of susceptible and resistant toma

28、to species after inocul-ation with ralstonia solanacearum：a proteomic approachj.plant molec-ular biology，2010，73（6）：643-658.7 li r，rimmer r，yu m，et al.two brassica napus polygalacturonase inhibitory protein genes are expressed at different levels in response to biotic and abiotic stressesj.planta，20

29、03，217（2）：299-308.8 nishitani k.endo-xyloglucan transferase，a new class of transferase involved in cell wall constructionj.journal of plant research，1995，108（1）：137-148.9 song y，zhang c，ge w，et al.identification of nacl stress-responsive apoplastic proteins in rice shoot stems by 2d-digej.journal of

30、 proteo-mics，2011，74（7）：1045-1067.10 ravanel s，gakiere b，job d，et al.the specific features of methi-onine biosynthesis and metabolism in plantsj.proceedings of the nati-onal academy of sciences，1998，95（13）：7805-7812.11 miller g，suzuki n，ciftciyilmaz s，et al.reactive oxygen sp-ecies homeostasis and s

31、ignalling during drought and salinity stressesj.plant，cell & environment，2010，33（4）：453-467.12 sharma yk，davis kr.the effects of ozone on antioxidant responses in plantsj.free radical biology and medicine，1997，23（3）：480-488.13 bach m，schnitzler j-p，seitz hu.elicitor-induced changes in ca2+ influ

32、x，k+ efflux，and 4-hydroxybenzoic acid synthesis in protoplasts of daucus carota l.j.plant physiology，1993，103（2）：407-412.14 karpinski s，escobar c，karpinska b，et al.photosynthetic ele-ctron transport regulates the expression of cytosolic ascorbate peroxidase genes in arabidopsis during excess light s

33、tressj.the plant cell，1997，9（4）：627-640.15 sewalt v j，ni w，blount j w，et al.reduced lignin content and altered lignin composition in transgenic tobacco downregulated in exp-ression of lphenylalanine ammonialyase or cinnamate 4-hydroxylasej.plant physiology，1997，115（1）：41-50.16 maich f，staehelin l a.

34、functional implications of the subcellular localization of ethylene-induced chitinase and beta-1，3-glucanase in bean leavesj.the plant cell，1989，1（4）：447-457.17 kumar a，bimolata w，kannan m，et al.comparative proteomics reveals differential induction of both biotic and abiotic stress response associated proteins in rice during xanthomonas oryzae pv.oryzae infectionj.functional & integrative genomics，2015，15（4）：425-437.18 lane b g.oxalate，germin，and the extracellular matrix of higher plantsj.the faseb journal，1994，8（3）：294-301.19 nickel w，seedorf m.unconventional mechanisms of prot