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文檔簡介
1、BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀簡易操作步驟一、開機(jī)1) 先打開凈化交流穩(wěn)壓電源,其次打開 110V 穩(wěn)壓輸出電源,再次打開流式細(xì)胞儀,最后打開計(jì)算機(jī)。2) 向前拉開儲液箱抽屜,檢查鞘液筒、廢液筒水量,如需充填鞘液,先將減壓閥(紅色箭頭所示)方向調(diào)在VENT 位置(箭頭方向),再加入超純水,保持水位在鞘液桶的3/4 左右,加好后擰緊桶蓋并將減壓閥方向調(diào)在RUN 位置。二、開啟CellQuest軟件、編輯實(shí)驗(yàn)文件1)在屏幕下方點(diǎn)擊CELLQuest (第四個(gè)圖標(biāo))啟動軟件。桌面會出現(xiàn)一Untitled實(shí)驗(yàn)文件,可點(diǎn)擊實(shí)驗(yàn)文件的左上角的放大鈕(綠色),將實(shí)驗(yàn)文件窗口放大。2)從工具板中點(diǎn)擊散點(diǎn)
2、圖圖示。在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊,拖曳對角線至適當(dāng)大小,然后放開鼠標(biāo)。出現(xiàn)散點(diǎn)圖對話方框(當(dāng)所要編輯的圖窗口被選中時(shí),會在其四角出現(xiàn)四個(gè)小黑塊)。3)在出現(xiàn)的散點(diǎn)圖對話方框中點(diǎn)擊PlotSource ,選擇 AcquisitionandAnalysis(收取、分析 ),確認(rèn) X 和 Y 軸參數(shù)預(yù)設(shè)為FSC-H1024 、 SSC-H1024 。4)從屏幕上方Plots 菜單中選擇DotPlot 功能,可復(fù)制一個(gè)同樣大小的散點(diǎn)圖,在出現(xiàn)的對話方框內(nèi)選擇X 軸: FL1-H1024 ;如果是雙標(biāo),Y 軸選擇: FL2-H1024( 根據(jù)實(shí)驗(yàn)檢測樣品確定所選通道,本步驟選FL1/FL2 來說明 ),如
3、果是單標(biāo),Y 軸選擇: SSC-H 。點(diǎn)擊 OK , FL1/FL2 的散點(diǎn)圖出現(xiàn)。完成后可將重制圖移至原圖右方。說明: 散點(diǎn)圖( Dotplot ),又稱二維散點(diǎn)圖是流式分析最常用圖譜,它可以顯示兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)的相互關(guān)系。在圖中,橫坐標(biāo)X 軸和縱坐標(biāo)Y 軸參數(shù)分別設(shè)為FSC-H1024、SSC-H1024 ;雙熒光標(biāo)記時(shí),第二圖X 和 Y 軸參數(shù)分別設(shè)為FL1-H1024 、FL2-H1024 , X 軸為為熒光 1 強(qiáng)度的相對值,單位是道數(shù),Y 軸則通常表示熒光2 或光散射強(qiáng)度的相對值。儀器使用者可因?qū)嶒?yàn)需求來修改所有圖譜中顯示之參數(shù)。修改動作為輕擊圖譜上X和Y軸參數(shù),并依需要選擇之(FSC
4、 :細(xì)胞大小,SSC :細(xì)胞折射率,F(xiàn)L1 :FITC 綠色熒光,F(xiàn)L2 : PE 橙色熒光, FL3 : PerCP5)在工具板中選擇四象限工具,在紅色熒光)。FL1/FL2 散點(diǎn)圖上拖動Quadrant的中心將它設(shè)定在(x, y)( 10 1,10 1)處,這些象限將指定陰性/陽性區(qū)域。6)從工具板中點(diǎn)擊直方圖圖示,在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊,拖曳對角線至適當(dāng)大小,然后放開鼠標(biāo)。單色熒光只需一個(gè)直方圖,和第二個(gè)散點(diǎn)圖一樣,橫坐標(biāo)選擇FL-1 ,縱坐標(biāo)默認(rèn)為Counts ;若是雙色熒光,需畫2 個(gè)直方圖,一個(gè)橫坐標(biāo)選擇FL-1-1024 ,另一個(gè)橫坐標(biāo)選擇 FL-2-1024 ;7)在上面直方圖
5、中畫出M1 和 M2 ,其中 M1 代表隱性數(shù)目(一般標(biāo)示是101), M2 代表陽性數(shù)目(除 M1 以外所有的部分)。8 )從 Stats 菜單中選擇QuadrantStats (象限統(tǒng)計(jì)) ,5 )步驟中的點(diǎn)圖將分為四個(gè)象限。三、建立儀器和計(jì)算機(jī)之間通訊從 Acquire 菜單中選擇 ConnecttoCytometer( 快捷鍵 Win+b) ,此時(shí)會出現(xiàn)AcquisitionControl對話方框。四、儀器設(shè)置文件注意: 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量,取決于最適化儀器設(shè)定文件。儀器設(shè)定文件不能在數(shù)據(jù)收取后再更改,研究人員必須在第一次就使用正確的儀器設(shè)定文件。儀器設(shè)定文件( Instrumentsett
6、ings ),含信號器高壓( Detector/Amps ),閾值( Threshold ),熒光補(bǔ)償( Compensation)等儀器條件的組合。一般而言,儀器設(shè)定的順序?yàn)镈etector/Amps-Threshold-Compensation。1)檢查現(xiàn)有儀器條件,從 Cytometer 菜單中選擇 Detectors/Amps 。出現(xiàn) Detectors/Amps 窗口。在 Detectors/Amps 窗口確認(rèn) FSC 與 SSC (根據(jù)實(shí)驗(yàn)樣品確定,一般細(xì)胞選擇 LIN ,細(xì)菌選擇 LOG ),其它 FL1-3 為LOG (對數(shù)放大),將其拖至空白區(qū)。2)從 Cytometer菜單
7、中選擇Threshold ,出現(xiàn) Threshold窗口在 Threshold窗口:確認(rèn)FSC 為設(shè)閾參數(shù),初步確認(rèn)預(yù)設(shè)閾值52。將其拖至空白區(qū)。3)從 Cytometer 菜單中選擇 Compensation ,確認(rèn)所有預(yù)設(shè)數(shù)值皆為零。將其拖至空白區(qū)。五、上樣品、設(shè)置儀器使儀器處于HighRUN ,樣品管支撐架左移,上陰性對照管樣品,支撐架回位。確認(rèn)AcquisitionControl窗口中Setup 前需打叉或打勾(即不儲存數(shù)據(jù),用于儀器設(shè)置) ,點(diǎn)擊 Acquire 。1 、調(diào)節(jié) FSC/SSC探測器(電壓)觀察 FSC/SSC 圖的變化。 FSC 電壓 (Voltage) 預(yù)設(shè)為 E0
8、0 ,可調(diào)節(jié)AmpGain從 1.00 9.99FSC使主要細(xì)胞群得以清楚顯示(如細(xì)胞較大,將FSC 電壓設(shè)置于E-1 ;較小細(xì)胞,將電壓設(shè)置于E01 )。調(diào)節(jié)SSC 電壓使主要細(xì)胞群得以清楚呈現(xiàn)。調(diào)節(jié)FSC/SSC圖的原則,在于能得到一獨(dú)立離散的細(xì)胞族群,該細(xì)胞群不與其它族群、細(xì)胞碎片有重迭現(xiàn)象。調(diào)整定位后,點(diǎn)擊 AcquisitionControl 窗口中的 Pause 。2 、 Gating圈選細(xì)胞檢品中,常含有大小不同、性質(zhì)相異的細(xì)胞群體。我們常用前方散射(FSC )與側(cè)方散射( SSC )的二維位圖,即散射光圖譜(ScatterPlot ),來圈選出不同細(xì)胞群的范圍,選擇性顯示出有意
9、義的細(xì)胞群體,如下圖圈選白血球之淋巴細(xì)胞族群。1)在工具板中選擇多邊形的Region ,在 FSC/SSC散點(diǎn)圖上劃定淋巴細(xì)胞R1 區(qū)域(如下圖)。分析樣品時(shí),區(qū)域內(nèi)細(xì)胞應(yīng)會呈現(xiàn)成紅色,可移動或改變形狀來圈選有意義的細(xì)胞。如果要刪除R1 區(qū)域,您可以在工具列中點(diǎn)選Gates Regionlist,以鼠標(biāo)點(diǎn)選R1 ,再按Delete鍵刪除R1區(qū)域。刪除R1 區(qū)域后,可用繪圖工具板,重畫R1 。2) 選取希望 Gate 話方框內(nèi),將的 FL1/FL2NoGate 改選散點(diǎn)圖,從Plots 菜單中選擇G1=R1 。點(diǎn)擊 OK 。Formatdotplot。在出現(xiàn)的對3 、調(diào)節(jié) FL1 、 FL2 的
10、探測器(電壓)1 )點(diǎn)擊 AcquisitionControl窗口中的Restart 。在 Detector/Amps窗口中調(diào)節(jié)FL1 、 FL2的電壓,使NegativeControl細(xì)胞群著落在所選直方圖或散點(diǎn)圖之100 -10 1 處。2)在 Threshold 窗口,適當(dāng)?shù)靥岣?FSC 閾值 >52 ,以去除碎片或低階噪音。唯需注意不要切掉主要細(xì)胞族群。3)點(diǎn)擊 AcquisitionControl窗口中的 Pause 、 Abort 。移去陰性對照管,我們已設(shè)定好有意義細(xì)胞群之自體熒光,不要再改動Detector/Amps、 Threshold等數(shù)值。4 、調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償說明:最
11、適化的最后一步是調(diào)節(jié)光譜重迭。(如是單色熒光實(shí)驗(yàn)可跳過此步驟)如是樣本,必要時(shí)需調(diào)節(jié)FL2-%FL1 ,F(xiàn)L1-%FL2 (若 3 色樣本,必要時(shí)需調(diào)節(jié)FL2-%FL1FL1-%FL2 、 FL3-%FL2 、 FL2-%FL3的補(bǔ)償)。2 色、1)HighRUN窗口中的 FL1/FL2,換上單染CD3-FITC管。點(diǎn)擊AcquisitionControlAcquire 。調(diào)節(jié) FL2-%FL1使 FITC 陽性細(xì)胞在散點(diǎn)圖的右下象限。補(bǔ)償調(diào)節(jié)可通過點(diǎn)擊來選擇或直接拖動滑標(biāo)上下移動。調(diào)節(jié)完畢,點(diǎn)擊窗口中的 Pause 。AcquisitionControl2)移去單染CD3 ,換上單染CD19
12、-PE管。點(diǎn)擊AcquisitionControl細(xì)胞在 FL1/FL2窗口中的 Restart 。調(diào)節(jié) FL1-%FL2 散點(diǎn)圖的左上象限。調(diào)節(jié)完畢,點(diǎn)擊使PE+AcquisitionControl窗口中的Pause 。3.)最后以CD3-FITC/CD19-PE雙染樣本上機(jī),點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的 Restart ,確定三群細(xì)胞工整垂直。當(dāng)您已完成2 色熒光之光譜重迭時(shí),點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的 Pause 、 Abort 。4)移去樣本管,換上dH2O 管,讓儀器暫且處于Standby狀態(tài)。關(guān)閉Compensation窗口。您已完成2 色
13、熒光之最適化。六、收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)1)決定儲存細(xì)胞總數(shù):預(yù)設(shè)之儲存細(xì)胞總數(shù)為 10000 中選擇 Acquisition&Storage ,并在出現(xiàn)的窗口功,確認(rèn)。如需修改,從AcquireCollectionCriteria從菜單10000ofAll,再點(diǎn)擊OK 。2 ) 找個(gè)檔案匣準(zhǔn)備儲存數(shù)據(jù),本機(jī)所有數(shù)據(jù)都貯存在D 盤 data 盤中,按實(shí)驗(yàn)日期編排 。 從 Acquire 菜單中選擇ParameterDescription,出現(xiàn) ParameterDescription對話方框。點(diǎn)擊Folder ,并在隨后出現(xiàn)之對話方框,選擇YourFolder 或新建活頁夾,點(diǎn)擊此對話方框的Se
14、lect YourFolder(一般用實(shí)驗(yàn)日期來命名Folder )。3)命名即將儲存之文件名:點(diǎn)擊ParameterDescription對話方框的File ,出現(xiàn)文件名編輯窗口,輸入文件名(根據(jù)實(shí)驗(yàn)來決定),點(diǎn)擊此對話方框的OK。4)Optional :如有需要,可選擇或在P1-P5 后的空格中輸入相關(guān)參數(shù)名。如P1 :Size,P2: Granularity,P3:CD3FITC。輸入?yún)?shù)名會存入實(shí)驗(yàn)檔案中,顯示在圖譜上。5 )計(jì)數(shù)器 Counters :從 Acquire 菜單中選擇 Counters. 窗口會顯示樣品分析速率、與總數(shù)進(jìn)度6 )開始收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 LOWRUN (根據(jù)C
15、ounters來調(diào)節(jié)速度,一般保持在700-800/Second ),將第一管樣品放到檢測區(qū),在AcquisitionControl窗口中,將Setup改成Setup ,此時(shí)CellQuest會自動顯示YourFolder文件名為資料文件名。點(diǎn)擊“ Acquire ”便可啟動樣品之分析測定與數(shù)據(jù)儲存。當(dāng)計(jì)算機(jī)成功地收取足夠數(shù)據(jù),會自動儲存數(shù)據(jù)文件文件名.001 ,并會以“嘟”聲告知,CellQuest會自動升冪附加檔名成文件名 .002 。等待下一指示。7)換上超純水,清洗管路,直到Counters 持續(xù)顯示 0/Second30s(約為 10-20s) ,換上下一管樣品,點(diǎn)擊“Acquire ”啟動樣品之分析測定與數(shù)據(jù)儲存。可繼續(xù)分析直到所有檢品都分析完畢。七、退出軟件并關(guān)機(jī)1). 檢品分析完畢后,記得從屏幕上方File指令欄選擇SaveAs,儲存實(shí)驗(yàn)文件,以備日后使用,不需每次重新編輯。2)檢品分析完畢后,用鼠標(biāo)從屏幕上方Acquire 指令欄中,選取以斷絕計(jì)算機(jī)與儀器間之聯(lián)機(jī)。之后如不分析數(shù)據(jù),您可退出軟件“DisconnecttoCytometerFile ”“ Quit ”(遇有選項(xiàng)永遠(yuǎn)選擇“Don tsave”
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