現(xiàn)代基因檢測(cè)技術(shù)

1、馬明星馬明星 分子生物學(xué)博士分子生物學(xué)博士昆明醫(yī)學(xué)會(huì)委員昆明醫(yī)學(xué)會(huì)委員云南省海外留學(xué)人員學(xué)會(huì)理事云南省海外留學(xué)人員學(xué)會(huì)理事現(xiàn)代基因檢測(cè)技術(shù)婦幼臨床診斷領(lǐng)域應(yīng)用A.A.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)表觀表觀- -望聞問(wèn)切望聞問(wèn)切深度觀察深度觀察-CT-CT、磁共振、磁共振、B B超超常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)- -化學(xué)、生物（培養(yǎng)等）化學(xué)、生物（培養(yǎng)等）分子生物學(xué)檢驗(yàn)分子生物學(xué)檢驗(yàn)- -免疫學(xué)、核酸（基因免疫學(xué)、核酸（基因/DNA/RNA/DNA/RNA）一個(gè)充滿著機(jī)遇，即將蓬勃發(fā)展的領(lǐng)域一個(gè)充滿著機(jī)遇，即將蓬勃發(fā)展的領(lǐng)域分子生物學(xué)診斷技術(shù)分子生物學(xué)診斷技術(shù) 以核酸、

2、蛋白質(zhì)、多糖等生物分子作為檢測(cè)靶標(biāo)；以核酸、蛋白質(zhì)、多糖等生物分子作為檢測(cè)靶標(biāo)； 特點(diǎn)特點(diǎn)： 檢檢測(cè)生物的基本特征和屬性，避免其它干擾物的影響；測(cè)生物的基本特征和屬性，避免其它干擾物的影響； 檢測(cè)技術(shù)發(fā)展快，配套設(shè)施設(shè)備自動(dòng)化程度高；檢測(cè)技術(shù)發(fā)展快，配套設(shè)施設(shè)備自動(dòng)化程度高； 方法穩(wěn)定可靠，靈敏度和特異性高方法穩(wěn)定可靠，靈敏度和特異性高。 代表方法：代表方法：ElisaElisa、PCRPCR、Q-PCRQ-PCR、免疫熒光、免疫熒光 分子生物學(xué)檢測(cè)手段將會(huì)逐步取代部分原有醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)分子生物學(xué)檢測(cè)手段將會(huì)逐步取代部分原有醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)免疫學(xué)診斷技術(shù)免疫學(xué)診斷技術(shù) 原理：抗原與抗體的相互識(shí)別 領(lǐng)

3、域： 感染性疾病、遺傳性疾病檢測(cè)；細(xì)胞因子、腫瘤蛋白等； 優(yōu)勢(shì)： 速度快（1-3h），操作簡(jiǎn)單（試紙），價(jià)格低廉； 缺陷： 通量低（1項(xiàng)/次） 假陽(yáng)性（特異性差，背景高）， 假陰性（靈敏度差），無(wú)內(nèi)對(duì)照（過(guò)程控制）。免疫學(xué)診斷技術(shù)免疫學(xué)診斷技術(shù)基因檢測(cè)技術(shù)基因檢測(cè)技術(shù) 原理：基于核酸擴(kuò)增技術(shù)或序列分析技術(shù) 核酸=基因=DNA或RNA 領(lǐng)域： 感染性疾病、遺傳性疾病檢測(cè)；親緣關(guān)系鑒定等；腫瘤等； 優(yōu)勢(shì)： 極高的靈敏度（50拷貝），極高的特異性（95%）， 速度快（3-5h）； 缺陷： 通量低（1-2項(xiàng)/次） 假陽(yáng)性（污染），無(wú)內(nèi)對(duì)照（過(guò)程控制）基因檢測(cè)技術(shù)基因檢測(cè)技術(shù)基因檢測(cè)技術(shù)基因檢測(cè)技術(shù)PC

4、R：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)FQ-PCR：熒光定量PCRSanger測(cè)序：800bp以內(nèi)的基因測(cè)序分析優(yōu)勢(shì)： 極高的靈敏度（50拷貝），極高的特異性（95%）， 速度快（3-5h）；缺陷： 通量低（1-2項(xiàng)/次） 假陽(yáng)性（污染），無(wú)內(nèi)對(duì)照（過(guò)程控制）核型分析：基于染色體形態(tài)的分析方法RFLP：限制性內(nèi)切酶多態(tài)性分析FISH:染色體熒光原位雜交基因檢測(cè)技術(shù)基因檢測(cè)技術(shù)PCR的原理基因檢測(cè)技術(shù)基因檢測(cè)技術(shù)PCR的原理基因檢測(cè)技術(shù)基因檢測(cè)技術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR基因檢測(cè)技術(shù)基因檢測(cè)技術(shù)Sanger測(cè)序原理B.B.現(xiàn)代基因檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)代基因檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)代基因檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)代基因檢測(cè)技術(shù) 高通量：一次能完成多個(gè)指標(biāo)的測(cè)定；

5、 高可靠性：對(duì)照/質(zhì)控體系完善，平行實(shí)驗(yàn)； 高準(zhǔn)確性：高度的靈敏度和特異性； 自動(dòng)化：盡量由儀器設(shè)備完成； 高效率：縮短檢測(cè)時(shí)間，為治療爭(zhēng)取更大的機(jī)會(huì) 采樣便捷：檢測(cè)什么 采集什么 基因芯片技術(shù)：固態(tài)芯片 液態(tài)芯片(流式熒光) NGS：下一代測(cè)序基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)固態(tài)芯片固態(tài)芯片液態(tài)芯片液態(tài)芯片基因芯片技術(shù)原理基因芯片技術(shù)原理 準(zhǔn)確性：基于核酸的檢測(cè)準(zhǔn)確性：基于核酸的檢測(cè) 靈敏度：基因擴(kuò)增（靈敏度：基因擴(kuò)增（PCR）、熒光標(biāo)記）、熒光標(biāo)記 特異性：基因擴(kuò)增（特異性：基因擴(kuò)增（PCR）、分子雜交）、分子雜交 可靠性：內(nèi)對(duì)照體系、自動(dòng)化檢測(cè)可靠性：內(nèi)對(duì)照體系、自動(dòng)化檢測(cè)現(xiàn)代基因檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)代基

6、因檢測(cè)技術(shù)基因芯片基因芯片=DNA=DNA微陣列（微陣列（DNA Micro-ArrayDNA Micro-Array）基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù) 高通量一次檢測(cè)中即可對(duì)完成通常技術(shù)多次試驗(yàn)才能得到的結(jié)果； 自動(dòng)化大量操作和數(shù)據(jù)分析由計(jì)算機(jī)完成，降低使用者工作量，減少人為因素對(duì)結(jié)果的影響； 可靠性高通過(guò)芯片探針的合理設(shè)計(jì)，能夠在芯片上設(shè)置多種對(duì)照探針和多次重復(fù)試驗(yàn)，對(duì)整個(gè)操作過(guò)程起到監(jiān)控作用，檢測(cè)結(jié)果來(lái)自多個(gè)平行重復(fù)，結(jié)果更加可靠。 高效率短時(shí)間內(nèi)可以完成大量生物信息的檢測(cè)；下一代測(cè)序下一代測(cè)序NGS 高通量：一次對(duì)多個(gè)DNA簇進(jìn)行測(cè)序； 高效率：短時(shí)間完成GB級(jí)或TB級(jí)的測(cè)序總讀長(zhǎng)； 更靈敏：

7、可以測(cè)定痕量的DNA標(biāo)本(無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查)； 高精度：精確度可達(dá)99.9%以上； 成本低：極低的單堿基測(cè)序成本（相對(duì)于焦磷酸測(cè)序）； illumina Roche ABI 華大？下一代測(cè)序下一代測(cè)序NGSC.C.現(xiàn)代基因檢測(cè)技術(shù)與婦幼臨床診斷現(xiàn)代基因檢測(cè)技術(shù)與婦幼臨床診斷現(xiàn)代基因檢測(cè)技術(shù)能為臨床做什么現(xiàn)代基因檢測(cè)技術(shù)能為臨床做什么復(fù)雜感染的快速系統(tǒng)化診斷（有沒(méi)有，是什么）復(fù)雜感染的快速系統(tǒng)化診斷（有沒(méi)有，是什么）遺傳性疾病診斷（人基因組遺傳性疾病診斷（人基因組SNPSNP）病原體耐藥檢測(cè)（病原體病原體耐藥檢測(cè)（病原體SNPSNP）個(gè)體化用藥指導(dǎo)（人基因組個(gè)體化用藥指導(dǎo)（人基因組SNPSNP）現(xiàn)代

8、基因檢測(cè)技術(shù)能為臨床做什么現(xiàn)代基因檢測(cè)技術(shù)能為臨床做什么SNP：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性基因檢測(cè)與感染基因檢測(cè)與感染I . 感染性疾病檢測(cè)HPV高通量分型檢測(cè)TORCH優(yōu)生5項(xiàng)檢測(cè)泌尿生殖系統(tǒng)感染檢測(cè)呼吸系統(tǒng)感染檢測(cè)消化系統(tǒng)感染檢測(cè)外界病原體（細(xì)菌、真菌、病毒、支原體、衣原體）侵入人體組織器官引起的疾病Infections感染性疾病往往癥狀相似，為臨床判斷帶來(lái)不便針對(duì)單種病原體的檢測(cè)容易產(chǎn)生漏檢或誤檢多病原體多重感染在臨床中十分常見(jiàn)HPV=HPV=人人 乳頭瘤乳頭瘤 病毒病毒宮頸癌是唯一病因明確、可以預(yù)防、可以早期治療的癌癥宮頸癌是唯一病因明確、可以預(yù)防、可以早期治療的癌癥能夠感染人體生殖道的能夠感染人

9、體生殖道的HPVHPV大約有大約有4040種種高危性高危性HPVHPV長(zhǎng)期反復(fù)感染（長(zhǎng)期反復(fù)感染（5-105-10年）導(dǎo)致宮頸癌年）導(dǎo)致宮頸癌 無(wú)癥狀感染無(wú)癥狀感染低危型低危型HPVHPV感染導(dǎo)致感染導(dǎo)致“尖銳濕疣尖銳濕疣”分型較少的產(chǎn)品對(duì)于未涉及的分型較少的產(chǎn)品對(duì)于未涉及的HPVHPV亞型檢測(cè)結(jié)果為陰性亞型檢測(cè)結(jié)果為陰性正常條件下每年做一次正常條件下每年做一次HPVHPV核酸檢測(cè)即可保證不患宮頸癌核酸檢測(cè)即可保證不患宮頸癌HPVHPV分型核酸檢測(cè)比分型核酸檢測(cè)比HC2/TCTHC2/TCT檢測(cè)具有跟高的敏感性和客觀性檢測(cè)具有跟高的敏感性和客觀性男性同樣應(yīng)該檢測(cè)男性同樣應(yīng)該檢測(cè)HPV HPV

10、不宜自愈不宜自愈 男性生殖系統(tǒng)腫瘤男性生殖系統(tǒng)腫瘤“高發(fā)高發(fā)”和和“低發(fā)低發(fā)”現(xiàn)狀已經(jīng)改變現(xiàn)狀已經(jīng)改變基因檢測(cè)與感染基因檢測(cè)與感染-HPVCT UU NG HHVI/II MG MH TPCT UU NG HHVI/II MG MH TP常見(jiàn)的常見(jiàn)的“性病類性病類”感染病原體感染病原體 臨床有癥狀感染臨床有癥狀感染90%90%以上以上病原體多病原體多 多重感染常見(jiàn)多重感染常見(jiàn) 驗(yàn)證式檢測(cè)無(wú)法完成驗(yàn)證式檢測(cè)無(wú)法完成免疫法靈明度低免疫法靈明度低 培養(yǎng)法周期長(zhǎng)易污染（培養(yǎng)法周期長(zhǎng)易污染（UUUU） 藥敏有點(diǎn)藥敏有點(diǎn)基因檢測(cè)與感染基因檢測(cè)與感染-性傳播疾病性傳播疾病弓形蟲(chóng)弓形蟲(chóng) 風(fēng)疹病毒風(fēng)疹病毒 巨細(xì)

11、胞病毒巨細(xì)胞病毒 單純皰疹病毒單純皰疹病毒I/III/II型型優(yōu)生優(yōu)生5 5項(xiàng)項(xiàng) 致畸性病原體檢測(cè)的意義重大致畸性病原體檢測(cè)的意義重大常規(guī)常規(guī)TORCHTORCH檢測(cè)一般在懷孕后進(jìn)行檢測(cè)一般在懷孕后進(jìn)行常規(guī)免疫學(xué)方法窗口期長(zhǎng)常規(guī)免疫學(xué)方法窗口期長(zhǎng) 靈敏度較低靈敏度較低核酸檢測(cè)能夠在感染早期檢測(cè)核酸檢測(cè)能夠在感染早期檢測(cè) 結(jié)果可靠結(jié)果可靠TORCH-Plus & HPVTORCH-Plus & HPV分型分型 & & 泌尿生殖系統(tǒng)感染聯(lián)檢泌尿生殖系統(tǒng)感染聯(lián)檢基因檢測(cè)與感染基因檢測(cè)與感染-優(yōu)生優(yōu)生肺炎支肺炎支原體原體/ /衣原體衣原體 軍團(tuán)菌軍團(tuán)菌 腦膜炎球菌腦膜炎

12、球菌 肺炎鏈球菌肺炎鏈球菌 流感流感嗜血嗜血桿桿菌菌 腺病毒腺病毒 鮑曼不鮑曼不動(dòng)動(dòng)桿菌桿菌 非典病毒非典病毒 甲流甲流/ /乙型乙型 合胞體病毒合胞體病毒 副副流流感感病毒病毒 鼻病毒鼻病毒 偏偏肺病肺病毒毒 EBEB病毒病毒病原體多病原體多 感染情況復(fù)雜感染情況復(fù)雜 臨床無(wú)有效篩查手段臨床無(wú)有效篩查手段少部分熒光少部分熒光PCRPCR可檢可檢 極少可培養(yǎng)但周期長(zhǎng)易污染極少可培養(yǎng)但周期長(zhǎng)易污染有效指導(dǎo)抗生素使用有效指導(dǎo)抗生素使用 避免濫用帶來(lái)的危害避免濫用帶來(lái)的危害( (耐藥、二次、費(fèi)用耐藥、二次、費(fèi)用) )針對(duì)特殊人群快捷高效針對(duì)特殊人群快捷高效 為治療爭(zhēng)取時(shí)間為治療爭(zhēng)取時(shí)間( (老人小孩

13、老人小孩) )基因檢測(cè)與感染基因檢測(cè)與感染-呼吸系統(tǒng)呼吸系統(tǒng)大腸桿菌大腸桿菌EO157/EPEC EO157/EPEC 傷寒傷寒/ /副傷寒副傷寒 空腸空腸彎曲彎曲菌菌 李斯李斯特特菌菌 弗弗氏志氏志賀賀菌菌 小腸小腸結(jié)腸炎耶爾森結(jié)腸炎耶爾森菌菌 柯柯薩奇薩奇病毒病毒1616 腸道病毒腸道病毒71 71 輪輪狀病毒狀病毒RV RV 幽門(mén)螺桿菌幽門(mén)螺桿菌.病原體多病原體多 感染情況復(fù)雜感染情況復(fù)雜 臨床無(wú)有效篩查手段臨床無(wú)有效篩查手段幼兒腹瀉幼兒腹瀉 手足口病檢測(cè)手足口病檢測(cè)病原性食物中毒檢測(cè)病原性食物中毒檢測(cè)少部分熒光少部分熒光PCRPCR可檢可檢 極少可培養(yǎng)但周期長(zhǎng)易污染極少可培養(yǎng)但周期長(zhǎng)易

14、污染有效指導(dǎo)抗生素使用有效指導(dǎo)抗生素使用 避免濫用帶來(lái)的危害避免濫用帶來(lái)的危害( (耐藥、二次、費(fèi)用耐藥、二次、費(fèi)用) )針對(duì)特殊人群快捷高效針對(duì)特殊人群快捷高效 為治療爭(zhēng)取時(shí)間為治療爭(zhēng)取時(shí)間( (嬰幼兒嬰幼兒) )基因檢測(cè)與感染基因檢測(cè)與感染-消化系統(tǒng)消化系統(tǒng)甲乙丙丁戊庚感染甲乙丙丁戊庚感染 艾滋病病毒艾滋病病毒 梅毒螺旋體梅毒螺旋體嚴(yán)重血液感染嚴(yán)重血液感染 傳染危害較大傳染危害較大艾滋病與肝炎等容易并發(fā)感染艾滋病與肝炎等容易并發(fā)感染極大縮短窗口期，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性極大縮短窗口期，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性“血源篩查血源篩查”基因檢測(cè)與感染基因檢測(cè)與感染-血液感染血液感染解脲支原體解脲支原體UU 、人形支

15、原體、人形支原體MH、HPV11，31，56 混合感染混合感染呼吸系統(tǒng)感染呼吸系統(tǒng)感染基因檢測(cè)與感染基因檢測(cè)與感染基因檢測(cè)與感染基因檢測(cè)與感染基因檢測(cè)與病原體耐藥基因檢測(cè)與病原體耐藥病原體（細(xì)菌、真菌、病毒、支原體、衣原體）對(duì)藥物敏感或抵抗/耐受Resistant避免耐藥毒株的產(chǎn)生指導(dǎo)臨床用藥降低治療成本和難度R. 病原體耐藥結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)及耐藥分析HBV檢測(cè)及耐藥分析HCV檢測(cè)及耐藥分析病原體為什么會(huì)耐藥？病原體為什么會(huì)耐藥？藥物藥物“壓力壓力”對(duì)基因突變的選擇（適者生存）對(duì)基因突變的選擇（適者生存）病原體為什么很容易出現(xiàn)耐藥？病原體為什么很容易出現(xiàn)耐藥？群體龐大，傳代周期短群體龐大，傳代

16、周期短如何降低耐藥性病原體的產(chǎn)生？如何降低耐藥性病原體的產(chǎn)生？用藥前就弄清楚它對(duì)什么藥敏感用藥前就弄清楚它對(duì)什么藥敏感基因檢測(cè)與病原體耐藥基因檢測(cè)與病原體耐藥根據(jù)自身基因特點(diǎn)（SNP）合理用藥或生活Genomic個(gè)體化用藥個(gè)體化生活G. 基因多態(tài)性檢測(cè)心腦血管疾病用藥指導(dǎo)高血壓用藥指導(dǎo)EGFR、K-ras、B-raf基因多態(tài)性檢測(cè)PIK3c、PDGFR-、ERCC1、XRCC1基因多態(tài)性檢測(cè)EML4-ALK基因融合檢測(cè)華法林用藥指導(dǎo)基因檢測(cè)與個(gè)體化用藥基因檢測(cè)與個(gè)體化用藥ALDH2 CYP2C19 ALDH2 CYP2C19 MTHFRMTHFR酒精代謝能力評(píng)估（能否飲酒）酒精代謝能力評(píng)估（能

17、否飲酒） 速效救心丸效果評(píng)估（是否有效）速效救心丸效果評(píng)估（是否有效）評(píng)估多種藥物的代謝能力評(píng)估多種藥物的代謝能力 減少因藥物過(guò)度體內(nèi)停留帶來(lái)的危害減少因藥物過(guò)度體內(nèi)停留帶來(lái)的危害孕期婦女葉酸補(bǔ)充劑量測(cè)算孕期婦女葉酸補(bǔ)充劑量測(cè)算 降低畸形和唇腭裂發(fā)生率降低畸形和唇腭裂發(fā)生率降低降低“腦卒中腦卒中”發(fā)生率發(fā)生率標(biāo)本：標(biāo)本：DNADNA，口腔上皮脫落細(xì)胞，口腔上皮脫落細(xì)胞基因檢測(cè)與個(gè)體化用藥基因檢測(cè)與個(gè)體化用藥-葉酸葉酸利尿劑利尿劑 鈣離子拮抗劑鈣離子拮抗劑 血管緊張素等血管緊張素等指導(dǎo)高血壓患者根據(jù)自己基因特點(diǎn)服藥指導(dǎo)高血壓患者根據(jù)自己基因特點(diǎn)服藥提高藥物有效性提高藥物有效性 降低毒副作用降低毒

18、副作用基因檢測(cè)與個(gè)體化用藥基因檢測(cè)與個(gè)體化用藥-高血壓高血壓EGFR K-EGFR K-rasras B- B-rafraf腫瘤的起因不同腫瘤的起因不同與多種腫瘤發(fā)生相關(guān)與多種腫瘤發(fā)生相關(guān)一個(gè)信號(hào)通路上的三個(gè)原件一個(gè)信號(hào)通路上的三個(gè)原件 聯(lián)合檢測(cè)才有意義聯(lián)合檢測(cè)才有意義靶向治療藥物作用位點(diǎn)靶向治療藥物作用位點(diǎn)基因檢測(cè)與個(gè)體化用藥基因檢測(cè)與個(gè)體化用藥-腫瘤腫瘤由于人體基因組的微小變化（SNP、缺失）引起的可遺傳疾病Heredity一般無(wú)法治愈 部分危害嚴(yán)重可能隱性攜帶 可傳遞給子代核酸檢測(cè)是金標(biāo)準(zhǔn)H. 遺傳性疾病檢測(cè)角膜營(yíng)養(yǎng)不良地中海貧血Y染色體微缺失遺傳性耳聾基因檢測(cè)與遺傳性疾病基因檢測(cè)與遺傳

19、性疾病導(dǎo)致眼睛干澀導(dǎo)致眼睛干澀 視力下降視力下降使用使用“潤(rùn)滑性潤(rùn)滑性”眼藥水進(jìn)行緩解眼藥水進(jìn)行緩解進(jìn)行屈光矯正手術(shù)前須檢測(cè)進(jìn)行屈光矯正手術(shù)前須檢測(cè) 否則可導(dǎo)致失明否則可導(dǎo)致失明基因檢測(cè)與遺傳性疾病基因檢測(cè)與遺傳性疾病-角膜營(yíng)養(yǎng)不良角膜營(yíng)養(yǎng)不良或或兩種類型兩種類型分為輕度、中度、重度分為輕度、中度、重度兩廣地區(qū)高發(fā)兩廣地區(qū)高發(fā) 遺傳規(guī)律明確遺傳規(guī)律明確基因檢測(cè)與遺傳性疾病基因檢測(cè)與遺傳性疾病-地中海貧血地中海貧血遺傳因素的耳聾原因確定遺傳因素的耳聾原因確定避免藥物性耳聾的發(fā)生（糖甙類藥物）避免藥物性耳聾的發(fā)生（糖甙類藥物）嬰幼兒聽(tīng)力篩查（有效檢測(cè)途徑）嬰幼兒聽(tīng)力篩查（有效檢測(cè)途徑）覆蓋位點(diǎn)較全覆蓋位點(diǎn)較全基因檢測(cè)與遺傳性疾病基因檢測(cè)與遺傳性疾病-耳聾耳聾依據(jù)人體基因組上發(fā)生的微小變化（SNP）分析預(yù)測(cè)與該基因功能的相關(guān)健康因素變化Predict相關(guān)性與多種因素共同作用一般不作為醫(yī)學(xué)診斷依據(jù)對(duì)生活起居等起到一定指導(dǎo)作用P. 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估類檢測(cè)遺傳性肥胖基因多態(tài)性檢測(cè)美容相關(guān)基因多態(tài)性檢測(cè)吸煙損傷評(píng)估多態(tài)性檢測(cè)糖尿病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估基因檢測(cè)與健康預(yù)測(cè)基