生物技術(shù)論文

1、轉(zhuǎn)基因基本方法介紹摘要：轉(zhuǎn)基因技術(shù)的理論基礎(chǔ)來源于進化論衍生來的分子生物學(xué)?；蚱蔚膩碓纯梢允翘崛√囟ㄉ矬w基因組中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的DNA片段。遺傳轉(zhuǎn)化的方法按其是否需要通過組織培養(yǎng)、再生植株通常可分成兩大類，第一類需要通過組織培養(yǎng)再生植株，常用的方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、基因槍法；另一類方法不需要通過組織培養(yǎng)，比較成熟的主要有花粉管通道法，花粉管通道法是中國科學(xué)家提出的。一、基因槍法：1、 綜述： 基因槍法又稱為高速微彈法、微粒搶法、微粒轟擊法，是由康奈爾大學(xué)的Sanford等于1987年首次研制出的火藥引爆基因槍，并與該校工程技術(shù)專家Wolf及Kallen合作研

2、究出的一種基因轉(zhuǎn)移的新方法。1990年美國杜邦公司推出商品基因槍PDS-1000系統(tǒng)。在此期間，高壓放電、壓縮氣體驅(qū)動等各種基因槍相繼出現(xiàn)，并都在重復(fù)的實踐中得到改進和發(fā)展。其改進的核心是粒子加速系統(tǒng)，以提高射彈的可控度，即粒子速度和射入的濃度等。2、基本原理：其基本原理是將外源DNA包被在微小的金粒或鎢粒表面，然后在高壓的作用下微粒被高速射入受體細胞或組織。微粒上的外源DNA進入細胞后，整合到植物染色體上，得到表達，從而實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)化。根據(jù)基因槍的動力系統(tǒng)，可將它們分為三種類型：一類是以火藥爆炸力為加速動力，其顯著特征是塑料子彈和阻擋板。塑料子彈前端載放已沉淀有DNA的鎢金粉。當(dāng)火藥爆炸時，

3、塑料子彈帶著鎢金粉向下高速運動，至阻擋板時，塑料子彈被阻遏，而其前端的鎢金粉粒子繼續(xù)以高速向下運動，擊中樣品室的靶細胞。其粒子的速度主要是通過火藥的數(shù)量及速度調(diào)節(jié)器控制，不能做到無級調(diào)整，可控度較低。第二類是以高壓氣體作為動力，如以氦氣、氫氣、氮氣等。其工作原理是把載有DNA的鎢金粉噴灑在一張微粒載片上，電極間懸滴眾著微水滴。在壓縮空氣的沖擊下，微水滴霧狀噴射，驅(qū)動載片。當(dāng)載片受阻于金屬篩網(wǎng)時，載有DNA的鎢金粒繼續(xù)向下沖擊射入細胞。 第三類是以高壓放電為驅(qū)動力。其最大優(yōu)點是可以無級調(diào)速，通過變化工作電壓，粒子速度及射入濃度可準確控制，使載有DNA的鎢金粉粒子能到達具有再生能力的細胞層。3、步

4、驟：（1）微粒體的洗滌。取60-100mg鎢或金粉，溶于1ml無水乙醇中，用超聲波振蕩洗滌。微粒體處理后可在密閉條件下室溫貯存一周。離心除去乙醇，密閉貯存于室溫中，備用，保存時間不要超過一周。（2）DNA微粒載體的制備。（3）靶外植體材料準備。 在無菌條件下截取靶外植體，放于樣品皿中，外植體大小按基因槍要求選擇；在無菌條件下把靶外植體放入基因槍的樣品室，并對準子彈發(fā)射中心。（4）DNA微彈轟擊，按照不同的基因槍說明書操作。（5）轟擊后外植體的培養(yǎng)。DNA微彈轟擊后立刻轉(zhuǎn)入相應(yīng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以免材料脫水加重細胞受傷害的程度，獲得再生植株。4、影響因素：（1）基因槍轟擊參數(shù)，如基因槍類型、氦氣壓

5、力、基因槍真空度、包裹金屬粒子類型、金屬粒子大小、載體膜位置、靶材料位置轟擊次數(shù)、微粒加速裝置參數(shù)等都會影響轉(zhuǎn)化效率的高低。其中金屬粒子以金粒效果最好、94.92kPa左右的氦氣真空度為佳。（2）轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的參數(shù)，如轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的純度要高、且濃度不宜過大。加入一定量的氯化鈣與亞精胺對質(zhì)粒的包被有促進作用。（3）轉(zhuǎn)化材料的類型。對于不同物種，它都有其適應(yīng)的轉(zhuǎn)化材料，如水稻胚性愈傷組織和配型懸浮系細胞的基因槍轉(zhuǎn)化效率要高于幼胚的轉(zhuǎn)化效率。（4）啟動子、選擇培養(yǎng)基類型等， 其中啟動子是調(diào)節(jié)外源基因在轉(zhuǎn)化細胞中表達的重要因素，不同啟動子調(diào)控的基因在受體材料中的表達水平差別很大。5、優(yōu)缺點：優(yōu)點：（1）無宿主

6、限制，對雙子葉和單子葉植物以及動物和微生物都同樣適用。（2）靶受體類型廣泛?；驑尲夹g(shù)可以選用易于再生的受體，繞過原生質(zhì)體再生的困難。它不僅以原生質(zhì)體、葉圓片為靶受體，而且懸浮培養(yǎng)細胞，莖或根切段以及種子胚、分生組織、幼穗、愈傷組織、花粉細胞等幾乎所有具有潛在分生能力的組織或細胞都可用基因槍進行轉(zhuǎn)化。（3）可控度高。近代的高壓放電或高壓氣體可調(diào)控微彈的速度和射入的濃度，可以較高的命中率把DNA微粒載體射入特定層次的細胞。（4）操作十分簡便快速。 缺點：（1）轉(zhuǎn)化效率低，多在0.1%-1%之間，這就增加了選擇難度；（2）儀器設(shè)備昂貴，轉(zhuǎn)化費用高；（3）不易獲得再生植株。 6、應(yīng)用前景：（1）植物

7、基因轉(zhuǎn)化： 目前已有十幾種植物采用了此技術(shù)獲得了轉(zhuǎn)基因植株，如小麥、玉米、水稻等，顯示了其廣闊的前景。近年來，多基因轉(zhuǎn)化是一個新亮點，由于基因槍法轉(zhuǎn)化容量大，一次能導(dǎo)入12-14個不同質(zhì)粒，因而被認為是實現(xiàn)多基因轉(zhuǎn)化的較理想的方法。（2）將外源基因?qū)胫参锛毎募毎?在植物細胞中有三套遺傳系統(tǒng)，即在細胞核、線粒體、葉綠體中都有自己的遺傳物質(zhì)。它們相互調(diào)節(jié)，共同調(diào)控者細胞的生命活動。細胞器的遺傳系統(tǒng)同樣具有重要作用，因此通過細胞器的基因轉(zhuǎn)化改造生物同樣是一條可行的途徑。現(xiàn)已證明基因槍法可將外源基因?qū)爰毎?，并能得到穩(wěn)定表達，因此，基因槍為細胞器的基因轉(zhuǎn)化開拓了一片新領(lǐng)域。（3）植物基因表達調(diào)

8、控研究： 利用基因槍技術(shù)為外源基因?qū)胩囟ńM織提供了可能，因此可以用于研究植物的發(fā)育及調(diào)控。如果把外源的特定基因?qū)氩煌募毎虿煌l(fā)育時期，則可以研究其基因表達的特點。二、脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化法：1、 綜述： 脂質(zhì)體法是用脂類化學(xué)物質(zhì)包裹DNA成球體，通過植物原生質(zhì)體的吞噬或融合作用把內(nèi)含物轉(zhuǎn)入受體細胞。Deshayes等用脂質(zhì)體包裹帶有卡那霉素抗性嵌合基因的大腸桿菌質(zhì)粒，用PEG誘導(dǎo)脂質(zhì)體與煙草原生質(zhì)體融合。實驗成功地從轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體獲得再生植株。這一成功例子，為基因轉(zhuǎn)化建立了新的方法。2、基本原理：脂質(zhì)體是根據(jù)生物膜的結(jié)構(gòu)功能特性合成人工膜，然后把DNA包裹在人工膜內(nèi)。 反相蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體

9、的原理，是在溶于有機溶劑的磷脂中加入核算水溶液。磷脂即以其親水基朝向水相，疏水的尾鏈伸向有機相而整齊地排列在兩相界面上，經(jīng)超聲波處理后，在有機相中形成包有DNA水溶液的囊泡，通過減壓蒸餾有機溶劑，并加入水溶液后即可形成包含有DNA的脂質(zhì)體。將脂質(zhì)體與原生質(zhì)體在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中混合，通過原生質(zhì)體的吞噬或融合可將外源DNA導(dǎo)入受體細胞。為了避免在包裹DNA時超聲波和有機溶劑對DNA的損傷，通常使用去垢劑透析法制備脂質(zhì)體，也有人使用反相蒸發(fā)法。3、步驟：（1）用反相蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體，常用的脂類是牛腦磷脂酰絲氨酸和膽固醇。（2）RNA和DNA核算制備。（3）脂質(zhì)體純化。（4）脂質(zhì)體-原生質(zhì)體保溫培養(yǎng)轉(zhuǎn)化

10、。（5）轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體選擇培養(yǎng)。4、影響因素：（1）脂質(zhì)體的制備類型、方法均有明顯差異；（2）PEG的濃度、加入時間、pH值及Ca離子濃度均起到重要作用； (3)保溫培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化時的條件。5、優(yōu)缺點：優(yōu)點：方法簡便、重復(fù)性好、對多種類型的細胞有效，而且包裝容量大、安全性高。缺點：有時大部分DNA會被溶酶體降解，所以效率不高。 6、應(yīng)用前景：近年來，美國BRL公司推出一種新型脂質(zhì)體即轉(zhuǎn)化脂，只要把轉(zhuǎn)化脂與DNA簡單的混合，即可形成轉(zhuǎn)化脂與DNA的復(fù)合體，把DNA包裹在脂質(zhì)體內(nèi)，并可有效地轉(zhuǎn)化動植物細胞。此方法不僅可明顯提高轉(zhuǎn)化率，而且由于有商品出售，減少耗時，簡便快捷，因此，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體法

11、是值得廣泛試用的一種轉(zhuǎn)化方法。脂質(zhì)體在介導(dǎo)植物病毒RNA的轉(zhuǎn)化方面應(yīng)用更多，并取得重要進展。脂質(zhì)體在包裹植物病毒裸露的RNA后，與原生質(zhì)體在特定的融合條件下保溫，可獲得較高的感染率。此外，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染可以大大降低核算的用量，TMV-RNA的用量可以從50ug降到5ug，使體外轉(zhuǎn)錄體的應(yīng)用變?yōu)榭赡?，具有很高的實用價值。三、花粉管通道法：1、綜述：在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導(dǎo)入受精卵細胞，并進一步地被整合到受體細胞的基因組中，隨著受精卵的發(fā)育而成為帶轉(zhuǎn)基因的新個體。該方法于80年代初期由我國學(xué)者周光宇提出，我國目前推廣面積最大

12、的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用花粉管通道法培育出來的。該法的最大優(yōu)點是不依賴組織培養(yǎng)人工再生植株，技術(shù)簡單，不需要裝備精良的實驗室，常規(guī)育種工作者易于掌握。2、基本原理： 花粉管通道法的主要原理是授粉后使外源DNA能沿著花粉管滲入，經(jīng)過珠心通道進入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具備正常細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞。這一技術(shù)原理可以應(yīng)用于任何開花植物。3、步驟：（1）外源DNA制備：a、從植物提取DNA：取供體植物的幼葉、幼穗等為試材，提取總DNA，然后進行純化和酶切，之后制備DNA導(dǎo)入液；b、從細菌中提取質(zhì)粒DNA：已構(gòu)建的中介載體一般克隆在大腸桿菌中，因此可以直接從大腸桿菌中提取質(zhì)粒DNA，并酶切后制備DNA導(dǎo)入液

13、；c、從農(nóng)桿菌中提取已重組構(gòu)建的Ti質(zhì)粒，并酶切后制備DNA導(dǎo)入液；（2）分析受體植物受精過程及時間，確定導(dǎo)入外源DNA的時間及方法。（3）外源DNA導(dǎo)入受體植物： 方法一：柱頭涂抹法 未授粉前，先用DNA導(dǎo)入液涂抹柱頭，然后人工授粉，迅速套袋。方法二：花粉粒吸入法 提前去雄套袋隔離，花粉粒首先用DNA導(dǎo)入液處理，使外源DNA吸入花粉粒，然后對受體植物進行人工授粉套袋。（4）后代材料處理：經(jīng)外源DNA處理獲得的種子與供體、受體植物的子代點播在同一試驗田，進行田間試驗。4、影響因素：（1）受體植物的受精過程及時間規(guī)律是花粉管導(dǎo)入的關(guān)鍵因素，要精確掌握，才能達到外源DNA導(dǎo)入的目的。（2）DNA導(dǎo)

14、入液的濃度、pH值等均影響轉(zhuǎn)化率。（3）DNA的分子結(jié)構(gòu)及其片段大小對轉(zhuǎn)化率也有重要影響。環(huán)狀分子難以轉(zhuǎn)化，大片段DNA轉(zhuǎn)化率低，片段太小不能保證完整基因存在，因此要使用適宜的DNA片段。5、優(yōu)缺點：優(yōu)點：（1）利用整體植株的卵細胞、受精卵或早期胚細胞轉(zhuǎn)化DNA，無需細胞、原生質(zhì)體等組織培養(yǎng)和誘導(dǎo)再生植株等一整套人工培養(yǎng)過程。（2）方法簡便，可以大田、盆栽或溫室中進行。（3）單胚珠和多胚珠的單雙子葉植物均可應(yīng)用。（4）縮短了育種時間。（5）可以任意選擇品種進行外源DNA的導(dǎo)入，達到目的性狀基因的轉(zhuǎn)移?？梢员Ａ羰荏w的優(yōu)良性狀，無需顧慮體細胞變異的問題。缺點：（1）篩選到的子代可能帶入少量目的性狀

15、基因以外的DNA片段。（2）這一技術(shù)局限于開花時間才能應(yīng)用。（3）如果是不受單基因或單片段DNA控制的多基因性狀，則不能或很難通過這一技術(shù)導(dǎo)入植物。6、應(yīng)用前景： 該技術(shù)的建立開創(chuàng)了整株活體基因轉(zhuǎn)化的新途徑，近年來又有了很大發(fā)展，應(yīng)用前景廣闊。 四、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法：1、綜述：農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根。根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌中細胞中分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段T-DNA，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進入細胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中。因此，農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。人們將目

16、的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實現(xiàn)外源基因向植物細胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過細胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法起初只被用于雙子葉植物中，近年來，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化在一些單子葉植物（尤其是水稻）中也得到了廣泛應(yīng)用。 2、基本原理： 農(nóng)桿菌含有Ti質(zhì)粒，是較好的基因克隆載體。農(nóng)桿菌附著到植物細胞后，留在細胞間隙中。T-DNA首先在細菌中被加工，剪切、復(fù)制，然后轉(zhuǎn)入植物細胞。3、步驟： （1）把含目的基因的外源DNA插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)，構(gòu)成重組的質(zhì)粒分子； （2）將重組型質(zhì)粒轉(zhuǎn)化給大腸桿菌細胞； （3）通過細菌的結(jié)合作用，含外源DNA的重組型質(zhì)粒從大腸桿菌轉(zhuǎn)

17、移到農(nóng)桿菌，并與其固有的Ti質(zhì)粒發(fā)生同源重組，外源DNA轉(zhuǎn)移到固有的Ti質(zhì)粒上； （4）將農(nóng)桿菌直接接種在植物的傷口部位或通過植物原生質(zhì)體共培養(yǎng)方法轉(zhuǎn)化植物細胞； （5）培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細胞或組織再生出轉(zhuǎn)基因植株。4、影響因素： （1）植株基因型、年齡是否合適；（2）質(zhì)粒中virG拷貝數(shù)的多少也會造成影響；（3）農(nóng)桿菌進入植株的方式。5、優(yōu)缺點： 優(yōu)點：（1）該轉(zhuǎn)化系統(tǒng)利用了天然的轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)，成功率高，效果好；（2）在所有的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中，農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是機理研究的最清楚的，方法最成熟，應(yīng)用最廣泛；（3）Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)可以容納相當(dāng)大的DNA片段插入；（4）整合進植物基因中的T-DNA及

18、插入其間的外源基因不僅能在植物細胞中表達，而且可根據(jù)人們的需要連接不同的啟動子，使外源基因能夠在再生植株的各個組織器官中特異性表達；（5）農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的外源基因以單拷貝為多，遺傳穩(wěn)定性好，轉(zhuǎn)基因植株能較好地為育種提供中間選育材料。缺點： 該技術(shù)主要應(yīng)用于雙子葉植物，應(yīng)用范圍較窄。6、應(yīng)用前景：目前利用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)已獲得許多轉(zhuǎn)基因植物。1983-1994年由農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化成功地植物達116種，在植物抗病、抗蟲、抗除草劑和改良植物果實品質(zhì)等方面都已獲得不少轉(zhuǎn)基因植物，有的已應(yīng)用于生產(chǎn)，為提高作物產(chǎn)量、抗逆能力、優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)良種選育提供了一條誘人的全新途徑，顯示了潛在的美好前景?？偨Y(jié)

19、：綜上所述可知，植物轉(zhuǎn)基因的方法有很多種。植物轉(zhuǎn)基因的過程，不僅僅是外源DNA轉(zhuǎn)移到植物細胞中去的過程，而是項綜合性的工作，包括外源基因的分離和克隆，外源基因?qū)胫参锛毎驮谥参锛毎型庠椿虻谋磉_及穩(wěn)定遺傳。每種轉(zhuǎn)基因方法各有各的利弊，運用不同的方法，適用于不同的情況下，且轉(zhuǎn)化效率、應(yīng)用范圍、應(yīng)用前景均不同，選擇轉(zhuǎn)基因方法時必須仔細考慮。目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)普遍應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、動物、工業(yè)等各個領(lǐng)域。就農(nóng)業(yè)方面來說，目前社會上關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物的爭論非常激烈，有人贊同，有人反對。國際上對轉(zhuǎn)基因食品的安全性問題尚無定論、看法不一。需要非常長的時間來考察才能得出結(jié)論。參考文獻：1DraperJ,PareyMR,FreemanJP,etal.Tiplasmidhomoligoussequencespre2sentintissuesfr