COS7細(xì)胞凍存和復(fù)蘇傳代培養(yǎng)推薦課件

1、2021/8/221指導(dǎo)老師指導(dǎo)老師 陸家海陸家海 歐陽麗萍?xì)W陽麗萍2021/8/222l建立CoS-7細(xì)胞培養(yǎng)的方法l觀察COS7細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)l了解COS7細(xì)胞的用途2021/8/223建立建立CoS-7細(xì)胞培養(yǎng)的方法細(xì)胞培養(yǎng)的方法主要闡述CoS-7細(xì)胞培養(yǎng)的體系2021/8/224觀察觀察COS7細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)是貼壁細(xì)胞還是懸浮細(xì)胞？細(xì)胞培養(yǎng)過程中形態(tài)的變化，分裂生長的形式等2021/8/225了解了解COS7細(xì)胞的用途細(xì)胞的用途COS-7細(xì)胞的來源、特性及生命醫(yī)學(xué)用途：2021/8/2262021/8/2272021/8/228l（一）實(shí)驗(yàn)材料l1 細(xì)胞株 cos7細(xì)胞株

2、l2 試劑l RPMI-1640培養(yǎng)基小牛血清（NBS）N-(2-羥乙基)-哌嗪-Ng-2（丙磺順?biāo)幔℉epes，Sigma公司產(chǎn)品）胰蛋白酶碳酸氫鈉以及鏈霉素和青霉素l3 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備2021/8/2292021/8/22102021/8/22112021/8/22122021/8/2213l1復(fù)蘇細(xì)胞：第1d,鏡下觀察復(fù)蘇細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中,折光性強(qiáng),胞體呈圓形。第2d,復(fù)蘇細(xì)胞鏡下觀察細(xì)胞大部分貼壁。第3d,復(fù)蘇細(xì)胞鏡下觀察細(xì)胞增殖速度較快，折光性好。5d后可按比例傳代。2021/8/2214l2 傳代細(xì)胞：第1d,鏡下觀察傳代細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中,折光性強(qiáng),胞體呈圓形。第2d,中,傳代細(xì)胞

3、鏡下觀察細(xì)胞已貼壁,折光性好,少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)偽足。第3d,傳代細(xì)胞培養(yǎng)液鏡下觀察大部分細(xì)胞已伸出偽足,細(xì)胞輪廓清楚,折光性強(qiáng),細(xì)胞數(shù)量明顯增多。2021/8/2215l3 傳代細(xì)胞傳至第68代仍保持增殖狀態(tài)，細(xì)胞生長速度未見減慢,能長滿瓶底。2021/8/2216l1 養(yǎng)細(xì)胞維持傳代以供實(shí)驗(yàn)用常遇到某些困難。首先，細(xì)胞株在傳代中其性質(zhì)發(fā)生變化。其次，在傳代中有微生物污染的危險(xiǎn)。解決這些困難的辦法就是將細(xì)胞凍存。細(xì)胞凍存在液氮中，貯存時(shí)間幾乎是無限的（因?yàn)樵?130以下，所有的生化反應(yīng)已停止，而液氮的溫度在-150-160之間）2021/8/2217l2 培養(yǎng)細(xì)胞在瓶壁匯合后，需進(jìn)行分離再培養(yǎng)，否

4、則正常細(xì)胞因生存空間不足或細(xì)胞密度過大，導(dǎo)致營養(yǎng)不良而引起細(xì)胞衰老停止生長甚至死亡。為了維持細(xì)胞的存活和生長，必須進(jìn)行稀釋再培養(yǎng)，即將培養(yǎng)瓶內(nèi)的細(xì)胞分離稀釋接種到新培養(yǎng)瓶內(nèi)繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。首次傳代的細(xì)胞接種數(shù)量要多些，使細(xì)胞盡快適應(yīng)新環(huán)境，以利于細(xì)胞的生存和增殖，通常原代細(xì)胞按1：2分種傳代，細(xì)胞株按1：4分種傳代2021/8/2218l3 實(shí)驗(yàn)需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)則，以減少操作引起的污染。一切操作，都要在火焰周圍進(jìn)行，瓶口、吸管等要經(jīng)過火焰消毒。但用于吸取細(xì)胞培養(yǎng)液、小牛血清、酶液的吸管使用后不能在火焰上消毒，因?yàn)闅埩粼谖苤械呐囵B(yǎng)液燒焦炭化，再使用時(shí)會把有害炭化物帶入培養(yǎng)液中毒害細(xì)胞。202

5、1/8/2219l4 實(shí)驗(yàn)完畢，關(guān)閉超凈臺鼓風(fēng)機(jī)和電源，未使用器材放入飯盒內(nèi)，用過的玻璃器材投入清水中浸泡，用酒精棉球擦拭工作臺面?？蓽p少培養(yǎng)液被微生物污染。2021/8/2220l5 細(xì)胞凍存復(fù)蘇的基本原則是慢凍速融,可最大限度的保存細(xì)胞活力。細(xì)胞直接凍存時(shí),細(xì)胞內(nèi)外的水分會很快形成冰晶,引起一系列不良反應(yīng)。因而在凍存時(shí)盡可能地減少細(xì)胞內(nèi)水分及冰晶形成,是保護(hù)細(xì)胞減少損傷的關(guān)鍵。目前多采用甘油和二甲基亞砜（DMSO）作保護(hù)劑,它們對細(xì)胞無明顯毒性,分子量小,溶解度大,易穿透細(xì)胞,可以使冰點(diǎn)下降。通過緩慢冷凍,使細(xì)胞內(nèi)水分盡可能多的滲出細(xì)胞外,減少細(xì)胞內(nèi)冰晶形成。而復(fù)蘇細(xì)胞時(shí),采用快速融化,可

6、保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短時(shí)間內(nèi)融化,避免緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成細(xì)胞內(nèi)再結(jié)晶。在本實(shí)驗(yàn)中,我們用二甲基亞砜作保護(hù)劑,經(jīng)過兩個(gè)低溫梯度、過夜后移入液氮;融化復(fù)蘇時(shí)在37、2分鐘內(nèi)完成,對細(xì)胞未造成明顯損傷,復(fù)蘇后細(xì)胞存活率可達(dá)90%,細(xì)胞形態(tài)、生長速率與未凍存細(xì)胞相比,未見明顯差異2021/8/2221l6 cos7細(xì)胞生長分為3期：延緩期、增殖期和停滯期.首次傳代一般在Cos7細(xì)胞增殖早期,此時(shí)細(xì)胞剛剛度過延緩期,脆弱易損,首次傳代對于Cos7細(xì)胞是否能長期存活尤為重要.而在Cos7細(xì)胞增殖后期,細(xì)胞貼壁緊密,消化時(shí)間不足,細(xì)胞不易從瓶壁脫落,不僅傳代細(xì)胞數(shù)量少,影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性,而且由于局部

7、代謝物的積累,細(xì)胞即進(jìn)入停滯期,若消化時(shí)間過長,待細(xì)胞完全從瓶壁脫落,則細(xì)胞膜已受損,死細(xì)胞增多.胰蛋白酶是常用的消化液,可使細(xì)胞脫離附著物表面和相互離散成單個(gè)細(xì)胞,但胰蛋白酶對細(xì)胞也有損傷可影響細(xì)胞活性5.本文建議采用0.25%胰蛋白酶在37,消化2min的參數(shù)。這是因?yàn)樵?7下胰蛋白酶活性最大,所需消化時(shí)間最短,可避免胰蛋白酶長時(shí)間作用于細(xì)胞造成細(xì)胞的損失。2021/8/2222l7 本室探討了37、CO2條件為培養(yǎng)Cos7細(xì)胞的適宜環(huán)境。因?yàn)閯倧?fù)蘇細(xì)胞增殖緩慢,自身調(diào)節(jié)pH的能力差的緣故，顯示復(fù)蘇細(xì)胞要在37、5CO2條件下培養(yǎng)才能順利傳代并保持較好的生長狀態(tài)2021/8/2223l 參考文獻(xiàn)l1GluzmanY.SV40-transformedsimiancellssupportthereplicationofearlySV40mutants.Cell,1981,23:175182.l2SambrookJ,FristchEF,ManiatisT.MolecularCloning,ALaboratoryManual.2nded.ColdSpringHarborLaboratoryPress.ColdSpringHarbor,NY,1989l3中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)研究中心.常用細(xì)胞生物學(xué)試驗(yàn)技術(shù)原理