生物學(xué)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

1、1 生物學(xué)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)定義聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)簡(jiǎn)稱pcr (英文全稱：polymerase chain reaction),-i jii. h 廊聚介酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)具體內(nèi)容點(diǎn)擊：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),簡(jiǎn)稱pcro聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其英文polymease chain reaction(pcr)是體外酶促合成特異dna片段的一種方法,由高溫變性、低溫退火及適溫延伸 等兒步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行,使目的dna得以迅速擴(kuò)增，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操 作簡(jiǎn)便、省時(shí)等特點(diǎn)。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究,還可用于疾病 病的診斷或任何有dna,rna的地方.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase

2、 chain reaction,簡(jiǎn)稱 pcr) 乂稱無(wú)細(xì)胞分子克隆或特異性dna序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。由美國(guó)科學(xué)家p e (perkin elmer珀金埃爾默)公司遺傳部的dr. mullis發(fā)明，由于pcrpcr技術(shù)在理論和 應(yīng)用上的跨時(shí)代意義,因此mullis獲得了 1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。技術(shù)原理dna的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈dna在多種酶的作用下可以變性 解鏈成單鏈，在dna聚合酶與啟動(dòng)子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子 挎貝。在i tsss-*1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)小發(fā)現(xiàn)，dna在高溫時(shí)也可以發(fā)牛變性解鏈，當(dāng)溫度降低后乂可以復(fù)性成為雙鏈。因此

3、， 通過(guò)溫度變化控制dna的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子，加入dna聚合酶、dntp就可 以完成特定基因的體外復(fù)制。但是，dna聚合酶在高溫時(shí)會(huì)火活，因此，每次循環(huán)都得加入新的dna聚合酶，不僅操 作煩瑣，而且價(jià)格昂貴，制約了 pcr技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱dna聚合同酶taq酶對(duì) 于pcr的應(yīng)用冇里程碑的意義，該酶可以耐受90°c以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使pcr技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷、同時(shí)也人人降低了成木，pcr技術(shù)得以人量應(yīng)用，并逐步應(yīng) 用于臨床。工作原理類似于dna的犬然復(fù)制過(guò)程，具特界性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核訐酸引物。pcr 由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)

4、步驟構(gòu)成：模板dna的變性：模板dna經(jīng)加熱至93°c左 右一定時(shí)聚合酚鏈?zhǔn)椒磻?yīng)間后，使模板dna雙鏈或經(jīng)pcr擴(kuò)增形成的雙鏈dna解離，使z成為單鏈，以便它與引物 結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板dna與引物的退火(復(fù)性)：模板dna經(jīng)加熱變性成單鏈后， 溫度降至55°c左右，引物與模板dna單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：dna模板- 引物結(jié)合物在taqdna聚合酶的作用下，以dntp為反應(yīng)原料，肥序列為模板，按堿基配對(duì)與 半保簾復(fù)制原理，合成一條新的與模板dna鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火“延伸 三過(guò)程，就對(duì)獲得更多的“半保簾復(fù)制鏈”，而門這種新鏈又可成為下

5、次循環(huán)的模板。每完成一 個(gè)循環(huán)需24分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放人幾百萬(wàn)倍。反應(yīng)體系與反應(yīng)條件標(biāo)準(zhǔn)的pcr反應(yīng)體系：10x擴(kuò)增緩沖液10ul4種dntp混合物各200umol/l引物各10100pmol模板dna0.12ugtaqdna 聚合k 2.5umg2+1.5mmol/l加雙或三蒸水至100ulpcr反應(yīng)五要素：參加pcr反m的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dntp、模板和緩沖液(其中需要mg2+)工作步驟標(biāo)準(zhǔn)的pcr過(guò)程分為三步：1. dna變性(90°c96°c):雙鏈dna模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈dna2. 退火(25°c65

6、6;c):系統(tǒng)溫度降低，引物與dna模板結(jié)合，形成局部雙鏈。3. 延伸(70°c-75°c):在taq酶(在72°c左右最佳的活性)的作用下，以dntp為原料, 從引物的5,端一3,端延伸，合成與模板互補(bǔ)的dna鏈。每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸，dna含罐既增加一倍。如圖所示：現(xiàn)在有些pcr因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很矩，即使taq酶活性不是最佳也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成, 因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60°c-65°c間進(jìn)行，以減少一次升降溫過(guò)程，提高 了反應(yīng)速度。反應(yīng)特點(diǎn)特界性強(qiáng)pcr反應(yīng)的特異性決定因索為： 引物與模板dna特異正確的結(jié)合； 堿

7、基配對(duì)原則； taq dna聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性； 靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原 則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及taq dna聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù) 性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性人大增加，被擴(kuò)増的靶基因片段也就能保持很高的 正確度。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。靈敏度高pcr產(chǎn)物的牛成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到 微克(pg=-6)水平。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞屮檢岀一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)小，pcr的靈敏度可 達(dá)3個(gè)

8、rfu(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)屮最小檢岀率為3個(gè)細(xì)菌。簡(jiǎn)便、快速pcr反應(yīng)用耐高溫的taq dna聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在dna擴(kuò)增液和 水浴鍋上進(jìn)行變性退火延伸反應(yīng)，一般在24小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分 析，不一定要用同位索，無(wú)放射性污染、易推廣。對(duì)標(biāo)本的純度要求低不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，dna粗制品及rna均町作為擴(kuò)增模板。可直接用臨 床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等dna擴(kuò)增檢測(cè)。循環(huán)參數(shù)1 s 預(yù)變性(initial denaturation).模板dna完全變性對(duì)pcr能否成功至關(guān)重要，一般95°c加熱3-5分鐘。2、引物

9、退火(primer annealing)退火溫度一般需要憑實(shí)驗(yàn)(經(jīng)驗(yàn))決定。退火溫度對(duì)pcr的特異性冇較大影響。3、引物延伸引物延伸一般在72°c進(jìn)行(taq酶最適溫度)。延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定。4、循環(huán)屮的變性步驟循環(huán)屮一般95°c, 30秒足以使各種靶dna序列完全變性：變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)損害酶活性，過(guò)短靶序列變性不徹底，易造成擴(kuò)增失敗。5、循環(huán)數(shù)人多數(shù)pcr a 25-35循環(huán)，過(guò)多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。6、最后延伸在最后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72°c維持5-15分鐘.使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成 雙鏈。pcr-pcr常見(jiàn)問(wèn)題電泳檢測(cè)時(shí)間一般為48h以內(nèi)，有些最

10、好于當(dāng)h電泳檢測(cè)，人于48h后帶型不規(guī)則其至消失。假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶pcr反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量及， pcr循壞條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述壞節(jié)進(jìn)行分析研究。模板：模板中含有雜蛋白質(zhì)，模板中含冇taq酶抑制劑，模板中蛋白質(zhì)沒(méi)冇消 化 除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時(shí)丟火過(guò)多，或吸入酚。模 板核酸變 性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不岀現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提 取過(guò)程岀了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，具程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。酶失活：需更換新酶，或新ih兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo) 致

11、假陰性。需注意的是有時(shí)忘加taq酶或漠乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是pcr失敗或擴(kuò)增條帶不 理 想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度 高，一條濃 度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：選定一個(gè)好的引物合成單 位。引物的濃度不 僅要看od值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶 的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做pcr有可能失敗，應(yīng)和引 物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。引物 應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致

12、引物變質(zhì)降解失效。引 物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。mg2+濃度：mg2+離子濃度對(duì)pcr擴(kuò)增效率影響很人，濃度過(guò)高可降低pcr擴(kuò)增的特 異性，濃度過(guò)低則影響pcr擴(kuò)增產(chǎn)量其至使pcr擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。反應(yīng)體積的改變:通常進(jìn)行pcr擴(kuò)增采用的體積為20uk 30ul、50ul或100ul,應(yīng)用多 人休積進(jìn)行pcr擴(kuò)増，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再 做人體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因變性對(duì)pcr擴(kuò)増來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能岀現(xiàn)假陰性;退火 溫度過(guò)低，可致非特界性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)

13、高影響引物與模板的結(jié)合而降 低pcr擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火 和延伸溫度，這也是pcr失敗的原因z-o靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，彩響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段 缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其pcr擴(kuò)增是不會(huì)成功的。假陽(yáng)性出現(xiàn)的pcr擴(kuò)增條帶與 目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非 目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行pcr擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的pcr產(chǎn)物為非目的性的序列。靶 序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因

14、組或人片段的交叉污 染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣 槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心 管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)木前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞 存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？?互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增ill pcr產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式pcr方法來(lái) 減輕或消除。出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶pcr擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的人小不一致，或人或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與 非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因

15、：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚 合形成二聚體。二是mg2+離了濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及pcr循環(huán)次數(shù) 過(guò)多有關(guān)。其次 是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易岀現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過(guò)多有 時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。 降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93°c變 性，65°c左右退火與延伸）。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶pcr擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量 差, dntp濃度過(guò)高，mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)

16、過(guò)多引起。其對(duì)策有：減少酶量， 或調(diào)換另一來(lái)源的酶。減少dntp的濃度。適當(dāng)降低mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。克隆pcr產(chǎn)物1）克隆pcr產(chǎn)物的最優(yōu)條件是什么？最佳插入片段：載體比需實(shí)驗(yàn)確定。1： 1 （插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數(shù)比仁 8或8： 1也行。應(yīng)測(cè)定比值范圍。連接mj 5ul 2x連接液，50ng質(zhì)粒dna,1weiss單位的t4 連接酶，插入片段共10ul室溫保溫1小時(shí)，或4°c過(guò)夜。在這2種溫度下，缺凸出端的載 體會(huì)自連，產(chǎn)生藍(lán)斑。室溫保溫1小時(shí)能滿足大多數(shù)克隆要求，為提高連接效率，需4°c過(guò)夜。2）pcr產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？如凝膠分

17、析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶，不需耍川凝膠純化。如可見(jiàn)其他雜帶，可能是積累了大 量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會(huì)產(chǎn)牛高比例的帶有引物二聚體的克 隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。3）如果沒(méi)有冋收到目的片段，還需要作什么對(duì)照實(shí)驗(yàn)？a）涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。如有菌落，表明氨節(jié)失效，或污染上帶有氨節(jié)抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨茉抗型的菌落。b）轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計(jì)算菌落生長(zhǎng)數(shù)，測(cè)定轉(zhuǎn)化效率。例如，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用soc稀解到1000ul 后，用100ul鋪板。培養(yǎng)過(guò)夜，產(chǎn)生1000個(gè)菌落。轉(zhuǎn)化率為：產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板dna的

18、總量。鋪板dna的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ng dna,用soc稀釋到1000u后含10 ng dna,用1/10鋪板，共用1 ng dna。轉(zhuǎn)化率為：1000 克隆 x10 （3 次方）ng /鋪板 1 ng dna ug=10 （6 次方）cfu/ ug轉(zhuǎn)化pgem-t應(yīng)用10 （8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞如沒(méi)有菌落或少有菌落，感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率太低。c）如用pgem-t正對(duì)照，或pcr產(chǎn)物，產(chǎn)生20-40藍(lán)斑（用指定步驟10 （8次方）cf u/ ug感受態(tài)細(xì)胞）,表明載體失去t?？赡苁沁B接酶污染了核酸酶。t4 dna連接酶（m180 1, m1804

19、, m1794）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好無(wú)核酸酶污染，不應(yīng)用其它來(lái)源的t4 dna連接酶替換。d）用pgem-t或pgemt easy載體，連接pgem-t ie對(duì)照，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì)胞（1 0 （8次方）cfu/ug），按照指定的實(shí)驗(yàn)步驟，可得100個(gè)菌落，其屮60%應(yīng)為白斑，如產(chǎn)生2 040藍(lán)斑，沒(méi)有菌落或少有菌落，連接有問(wèn)題。4）對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果好，卻沒(méi)有回收到目的片段，實(shí)驗(yàn)出了什么問(wèn)題？a）連接用室溫保溫1小時(shí)，能滿足人多數(shù)克隆，為提高效率，需4°c過(guò)夜。b）插入片段帶有污染，使3't缺失，或抑制連接，抑制轉(zhuǎn)化。為此，將插入片段和pge mt正對(duì)照混合，再連接。如降低了對(duì)照的菌落數(shù)，

20、插入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生人 量的藍(lán)斑，插入片段污染有核酸酶，使pgem-t或pgem-t easy載體3't缺失。c）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受uv過(guò)度照射，時(shí)有發(fā)生。uv過(guò) 度照射會(huì)產(chǎn)生唏喘二聚體，不利于連接，dna必需重新純化。d）帶有修復(fù)功能的耐熱dna聚合酣的擴(kuò)增產(chǎn)物末端無(wú)a,后者是pgem-t或pgemt easy載體克隆所需。加taq dna聚合酶和核廿酸可在末端加a。詳情杏pgem-t pgem-t easy載體技術(shù)資料（tm042）。e）高度重復(fù)序列可能會(huì)不穩(wěn)定，在擴(kuò)增屮產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn) 生缺失和重排，需用重組缺陷人

21、腸桿菌菌株，如sure細(xì)胞。反應(yīng)五要素參加pcr反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dntp、模板和mg2+引物：引物是pcr特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，pcr產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板dna互補(bǔ) 的程度。理論上，只要知道任何一段模板dna序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核背酸鏈做引物， 利用pcr就可將模板dna在體外大量擴(kuò)増。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則： 引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右。 引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。 引物堿基：g+c含量以40-60%為宜，g+c太少擴(kuò)增效果不佳，g+c過(guò)多易出現(xiàn)非特 異條帶。atgc最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嚓吟

22、或卩密噪核廿酸的成串排列。 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引 物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。 引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基 不配對(duì)而導(dǎo)致pcr失敗。 引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶 切分析或分了克隆很有好處。 引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。引物量：每條引 物的濃度0.11umol或10100pmol,以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高 會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。酶及其濃度目前有兩種t

23、aq dna聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水牛桿菌中提純的天然酶，另一種為大 腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的pcr反應(yīng)約需酶量2.5u（指總反應(yīng)體積為100ul時(shí)）， 濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。dntp的質(zhì)量與濃度dntp的質(zhì)量與濃度和pcr擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dntp粉呈顆粒 狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dntp溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1m naoh或triso hcl的緩沖液將其ph調(diào)節(jié)到7.07.5,小量分裝，20°c冰凍保存。多 次凍融會(huì)使dntp降解。在pcr反應(yīng)中，dntp應(yīng)為50200umol/l,尤具是注意4種dntp 的

24、濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于具它兒種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)引起 錯(cuò)配。濃度過(guò)低乂會(huì)降低pcr產(chǎn)物的產(chǎn)量。dntp能與mg2+結(jié)合，使游離的mg2+濃度降低。模板（靶基因）核酸 模板核酸的量與純化程度，是pcr成敗與否的關(guān)鍵壞節(jié)之一，傳統(tǒng)的 dna純化方法通常采用sds和蛋白酶k來(lái)消化處理標(biāo)本。sds的主要功能是：溶解細(xì)胞膜 上的脂類與蛋口質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞屮的核蛋口，sds還能與蛋 白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋口酶k能水解消化蛋口質(zhì)，特別是與dna結(jié)合的組蛋白，再川有機(jī)溶劑 酚與氯仿抽提掉蛋口質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或界丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板

25、用于pcr反應(yīng)。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除 去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于pcr擴(kuò)增。rna模板提取一般采用異硫亂酸呱或 蛋口酶k法，要防止rnase降解rnacmg2+濃度 mg2+對(duì)pcr擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的pcr反應(yīng)屮，各 種dntp濃度為200umol兒時(shí)，mg2+濃度為1.52.0mmol/l為宜。mg2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特 異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低taq dna聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。pcr反應(yīng)條件的選擇pcr反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。溫度與時(shí)間的設(shè)置：基于pcr原理三步驟而設(shè)置變性退火延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反 應(yīng)中釆用三溫度點(diǎn)法，雙鏈dna在9095°c變性，再迅速冷卻至4060°c,引物退火并結(jié) 合到靶序列上，然后快速升溫至7075°c,在taq dna聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板 延伸。對(duì)于較短靶基因（長(zhǎng)度為100300bp時(shí)河采用二溫度點(diǎn)法，除變性溫度外、退火與延 伸溫度可合二為一，一般采用94°c變性，