第六免疫比濁分析

1、人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 第六章第六章免疫比濁分析免疫比濁分析李士軍李士軍 教授教授大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 目錄目錄 免疫比濁技術原理免疫比濁技術原理 1自動化免疫比濁分析自動化免疫比濁分析 2返回總目錄返回總目錄小結小結 3人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 第一節(jié)第一節(jié) 免疫比濁技術原理免疫比濁技術原理免疫比濁技術分類：免疫比濁技術分類：透射免疫比濁法透射免疫比濁法（turbidimetric immunoassa

2、y）散射免疫比濁法散射免疫比濁法（nephelometry immunoassay）速率散射比濁法速率散射比濁法終點散射比濁法終點散射比濁法人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 4一、透射免疫比濁法一、透射免疫比濁法 當一定波長的光通過抗原抗體反應形成當一定波長的光通過抗原抗體反應形成的免疫復合物時會因為反射和吸收而減弱，的免疫復合物時會因為反射和吸收而減弱，一定范圍內(nèi)，透射光被吸收的量與復合物的一定范圍內(nèi)，透射光被吸收的量與復合物的量呈量呈正相關正相關關系，而復合物的量與抗原抗體關系，而復合物的量與抗原抗體量為一定的函數(shù)關系。量為一定的函數(shù)關系。（一）基本原理（

3、一）基本原理人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 在抗原或抗體量一定的條件下，可以利用比在抗原或抗體量一定的條件下，可以利用比濁儀在光源的光路方向上測定透射光強度與濁儀在光源的光路方向上測定透射光強度與入射光強度的比值或吸光度，來判斷待測抗入射光強度的比值或吸光度，來判斷待測抗原的量，這種方法稱為原的量，這種方法稱為透射比濁法透射比濁法 。人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 透射免疫比濁法光路圖透射免疫比濁法光路圖人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 待測的抗原抗體復合物分子量足夠大。待測的抗原抗體復合

4、物分子量足夠大。 抗原抗體復合物數(shù)量足夠多?？乖贵w復合物數(shù)量足夠多。 具有充分的反應時間。具有充分的反應時間。 高親和力的抗體，并保證抗體過量。高親和力的抗體，并保證抗體過量。（二）技術要求（二）技術要求人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 透射免疫比濁法的靈敏度是單向瓊脂擴散透射免疫比濁法的靈敏度是單向瓊脂擴散方法的方法的5 51010倍，但其與標記免疫分析技術倍，但其與標記免疫分析技術相比還不夠高。因此，透射比濁類的自動分相比還不夠高。因此，透射比濁類的自動分析儀用于免疫測定已趨減少，該測定原理析儀用于免疫測定已趨減少，該測定原理主主要用于生化分析儀。要用于

5、生化分析儀。（三）方法學評價（三）方法學評價人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 抗原抗體反應曲線抗原抗體反應曲線人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 10二、二、散射免疫比濁法散射免疫比濁法散射比濁法散射比濁法是指一定波長的光沿水平軸照射，是指一定波長的光沿水平軸照射，通過溶液時遇到其中的抗原抗體復合物，光通過溶液時遇到其中的抗原抗體復合物，光線被粒子顆粒折射而發(fā)生偏轉，產(chǎn)線被粒子顆粒折射而發(fā)生偏轉，產(chǎn) 生散射生散射光。光。（一）基本原理（一）基本原理人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 其中光線偏轉的

6、角度與發(fā)射光的波長和抗其中光線偏轉的角度與發(fā)射光的波長和抗原抗體復合物的大小和多少密切相關。散射光原抗體復合物的大小和多少密切相關。散射光的強度與復合物的含量成的強度與復合物的含量成正比正比，即待測的抗原，即待測的抗原越多，形成的復合物越多，散射光就越強。越多，形成的復合物越多，散射光就越強。人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 透射濁度法和散射濁度法的光路透射濁度法和散射濁度法的光路人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 應選擇應選擇適當適當?shù)墓庠磸姸取⒎磻獣r間、測量的光源強度、反應時間、測量角度及光源的波長。另外，要注意保證抗角度及

7、光源的波長。另外，要注意保證抗原濃度合適。此外，還要選擇適宜的離子原濃度合適。此外，還要選擇適宜的離子強度、強度、pHpH值等。值等。（二）技術要求（二）技術要求人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 散射免疫比濁法散射免疫比濁法是當今免疫化學分析中比較是當今免疫化學分析中比較有優(yōu)勢的方法?？梢詫崿F(xiàn)自動化管理，但用于免有優(yōu)勢的方法?？梢詫崿F(xiàn)自動化管理，但用于免疫沉淀反應有很多缺陷，如因為是一次性測定光疫沉淀反應有很多缺陷，如因為是一次性測定光吸收值，沒有考慮單個待測樣本的散射效果，可吸收值，沒有考慮單個待測樣本的散射效果，可能使測定結果不準確。能使測定結果不準確。（

8、三）方法學評價（三）方法學評價人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 測定的時間依然較長，且隨時間延長，抗測定的時間依然較長，且隨時間延長，抗原抗體復合物有重新結合的趨勢，可影響散射原抗體復合物有重新結合的趨勢，可影響散射值的變化及存在反應本底，在微量測定時，值的變化及存在反應本底，在微量測定時，本本底的干擾底的干擾是影響測定準確性的重要因素。是影響測定準確性的重要因素。人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 16三、三、速率免疫比濁法速率免疫比濁法該法是抗原抗體結合反應的一種該法是抗原抗體結合反應的一種動態(tài)測定動態(tài)測定方法。方法。將抗原

9、抗體的沉淀反應與散射比濁分析相結合，將抗原抗體的沉淀反應與散射比濁分析相結合，對單位時間內(nèi)抗原和抗體結合形成復合物的速對單位時間內(nèi)抗原和抗體結合形成復合物的速度進行動力學測定即為度進行動力學測定即為速率免疫比濁法速率免疫比濁法。（一）基本原理（一）基本原理人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 當抗體的濃度固定于一定范圍時，速度峰當抗體的濃度固定于一定范圍時，速度峰值的高低與抗原的含量成值的高低與抗原的含量成正比正比，隨著時間的延，隨著時間的延長，免疫復合物的量逐漸增多，抗原抗體結合長，免疫復合物的量逐漸增多，抗原抗體結合速度的峰值在一定的時間出現(xiàn)。通過微機處理速度

10、的峰值在一定的時間出現(xiàn)。通過微機處理即可得到待測蛋白成份的含量。即可得到待測蛋白成份的含量。人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 累計時間復合物產(chǎn)生總量產(chǎn)生速率510152025303540455055608132560150230300360415450480500512359080706055453020 抗原抗體復合物形成時間與速率的關系抗原抗體復合物形成時間與速率的關系人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 速率散射比濁法速率散射比濁法峰值出現(xiàn)的時間峰值出現(xiàn)的時間與抗體濃與抗體濃度及純度直接相關，需選用抗體純度及親和力度及純度直

11、接相關，需選用抗體純度及親和力交高的試劑。此外，要保證待測樣本血清的性交高的試劑。此外，要保證待測樣本血清的性狀符合要求，如嚴重脂血等即為不合格樣本。狀符合要求，如嚴重脂血等即為不合格樣本。（二）技術要求（二）技術要求人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 該法具有快速、敏感度及精密度高的特該法具有快速、敏感度及精密度高的特點，其最大優(yōu)點在于點，其最大優(yōu)點在于快速快速，檢測不必等到，檢測不必等到抗原抗體達到平衡，大大節(jié)省反應時間，抗原抗體達到平衡，大大節(jié)省反應時間，每小時可檢測標本數(shù)十份；敏感度高，最每小時可檢測標本數(shù)十份；敏感度高，最小檢出量達微克小檢出量達微克/

12、 /升水平。升水平。（三）方法學評價（三）方法學評價人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 21四、免疫膠乳比濁法四、免疫膠乳比濁法將抗體吸附在大小適中、均勻一致的膠乳顆粒將抗體吸附在大小適中、均勻一致的膠乳顆粒上，制成致敏的膠乳顆粒，當遇到相應抗原時，上，制成致敏的膠乳顆粒，當遇到相應抗原時，發(fā)生交聯(lián)反應，形成抗原抗體復合物，膠乳顆發(fā)生交聯(lián)反應，形成抗原抗體復合物，膠乳顆粒發(fā)生凝集。粒發(fā)生凝集。（一）基本原理（一）基本原理人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 單個膠乳顆粒在入射光波長之內(nèi)并不阻單個膠乳顆粒在入射光波長之內(nèi)并不阻礙光線透

13、過，兩個及其兩個以上膠乳顆粒凝礙光線透過，兩個及其兩個以上膠乳顆粒凝聚時則使透過的光減少，其減少的程度與膠聚時則使透過的光減少，其減少的程度與膠乳顆粒凝聚的程度呈正比，即與待測抗原量乳顆粒凝聚的程度呈正比，即與待測抗原量呈正比，由此可檢測樣本中的特定抗原含量。呈正比，由此可檢測樣本中的特定抗原含量。人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 膠乳顆粒的膠乳顆粒的均一性均一性將直接影響光散射作用，將直接影響光散射作用，影響檢測結果，因此需要選擇均勻一致的影響檢測結果，因此需要選擇均勻一致的膠乳顆粒。此外，試劑需要加保護劑以提膠乳顆粒。此外，試劑需要加保護劑以提高其穩(wěn)定性，

14、所用器皿要潔凈，避免雜質(zhì)高其穩(wěn)定性，所用器皿要潔凈，避免雜質(zhì)微粒的干擾。微粒的干擾。（二）技術要求（二）技術要求人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 該法敏感度高，試劑穩(wěn)定，個體免疫復該法敏感度高，試劑穩(wěn)定，個體免疫復合物對結果影響也小，因此結果穩(wěn)定、可合物對結果影響也小，因此結果穩(wěn)定、可靠，特異性好，精確度高，且不需要特殊靠，特異性好，精確度高，且不需要特殊的儀器設備，一般分光光度計、自動化生的儀器設備，一般分光光度計、自動化生化分析儀或散射比濁儀均可使用。化分析儀或散射比濁儀均可使用。返回章目錄返回章目錄（三）方法學評價（三）方法學評價人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出

15、版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 （一）（一）BNBN特種蛋白分析測定系統(tǒng)特種蛋白分析測定系統(tǒng)該系統(tǒng)的測定方法是透射免疫比濁法的一種該系統(tǒng)的測定方法是透射免疫比濁法的一種改良。以發(fā)光二極管作為光源，檢測前向角改良。以發(fā)光二極管作為光源，檢測前向角13132424度的散射光，然后利用硅化光電二極度的散射光，然后利用硅化光電二極管接收散射光信號，經(jīng)過微電腦處理，與標管接收散射光信號，經(jīng)過微電腦處理，與標準曲線進行比較，最后轉換成待檢物質(zhì)的濃準曲線進行比較，最后轉換成待檢物質(zhì)的濃度。度。第二節(jié)第二節(jié) 自動化免疫比濁分析自動化免疫比濁分析一、主流免疫比濁設備概況一、主流免疫比濁設備概況1.測

16、定原理測定原理人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 系統(tǒng)由分析儀、計算機、條碼讀取器、打系統(tǒng)由分析儀、計算機、條碼讀取器、打印機四部分組成，其中印機四部分組成，其中分析儀分析儀是主要組成部分，是主要組成部分，包括散射測濁儀、自動加樣系統(tǒng)、運輸裝置和包括散射測濁儀、自動加樣系統(tǒng)、運輸裝置和比色杯裝置。比色杯裝置。 2.儀器基本組成儀器基本組成人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 BN100BN100、BNBN特種蛋白分析分析系統(tǒng)特種蛋白分析分析系統(tǒng)人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 本系統(tǒng)屬于速率散射比濁

17、分析法，在抗體過量的本系統(tǒng)屬于速率散射比濁分析法，在抗體過量的前提下，光束通過抗原抗體復合物時所產(chǎn)生的散前提下，光束通過抗原抗體復合物時所產(chǎn)生的散射光速率變化大小與抗原濃度成正比。速率的峰射光速率變化大小與抗原濃度成正比。速率的峰值通過電腦處理系統(tǒng)轉換成待測抗原的濃度。值通過電腦處理系統(tǒng)轉換成待測抗原的濃度。1.測定原理測定原理（二）（二）ARRAYARRAY分析系統(tǒng)分析系統(tǒng)人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 ARRAY ARRAY系統(tǒng)由分析儀、電腦處理系統(tǒng)、打印系統(tǒng)由分析儀、電腦處理系統(tǒng)、打印機構成，其主要構成部分為分析儀，由加液機構成，其主要構成部分為分析儀

18、，由加液系統(tǒng)、散射測濁儀、系統(tǒng)、散射測濁儀、4040孔樣本轉盤、孔樣本轉盤、2020孔試孔試劑轉盤、軟盤驅動器等組成。劑轉盤、軟盤驅動器等組成。2.儀器基本組成儀器基本組成人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 Array360Array360、IMMAGEIMMAGE特種蛋白分析分析系統(tǒng)特種蛋白分析分析系統(tǒng)人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 二、免疫比濁分析的主要影響因素二、免疫比濁分析的主要影響因素1 1抗原抗體比例抗原抗體比例 抗原抗體比例要適當?？乖贵w比例要適當。2 2抗體的純度與效價抗體的純度與效價 診斷試劑應盡可能診斷試劑應盡可能選擇高純度與高效價的抗體。選擇高純度與高效價的抗體。3 3免疫復合物的大小及穩(wěn)定性免疫復合物的大小及穩(wěn)定性 溶液中免溶液中免疫復合物顆粒的分散度盡可能相同，顆粒應疫復合物顆粒的分散度盡可能相同，顆粒應該不容