首都醫(yī)科研究生免疫學考試答案

1、2013-2014上半學年免疫進展課考試說明1. 課程結束后兩周將作業(yè)交上（見附件1考題），作為本次課程的考試成績。交作業(yè)的具體時間為：2013年12月27日下午1:20-4:00；交作業(yè)的地點為：第二教學樓二層第七階梯教室（若當天階梯教室有課，我會在門口等大家）。2. 作業(yè)格式：首頁打印考試題（寫明專業(yè)、學號和姓名），答案附在后面，采用A4紙單面書寫（答案必需手寫，答案打印者本門課程考試成績記為0分）。3. 給分說明：（1）PAMP/DAMP概念5分；引起的吞噬、炎癥作用和佐劑中的應用各5分，共計20分；（2）每種方法的檢測原理各2分，ELISA的優(yōu)缺點4分，胞內染色優(yōu)缺點5分，CBA的優(yōu)缺

2、點5分，共計20分；（3）本題為開放性題目，答案要點主要包括假說合理（4分）、實驗設計合理（實驗方法多樣，對照合理）（12分）、結論合理（4分）即可給分；共計20分；（4）細胞-細胞間的直接接觸調節(jié)免疫應答10分；通過細胞因子發(fā)揮調節(jié)作用10分；共計20分；（5）EOS與氣道炎癥反應10分；EOS與氣道重塑10分；共計20分；（6）pre-BCR的構成6分，作用每條3.5分；共計20分。4. 作業(yè)其他要求：（1）嚴禁出現(xiàn)雷同，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本門課程考試成績記為0分；（2）作業(yè)必需按時上交，交作業(yè)當天需簽到（可以代交，但必須留下本人聯(lián)系方式）（3）收作業(yè)當天不合格者需重修本門課程。1.病原微生物表面

3、存在一些人體宿主所沒有的，但可為許多相關微生物所共享，結構恒定且進化保守的分子結構，稱為病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMP）,固有免疫識別的PAMP，往往是病原體賴以生存，因而變化較少的主要部分，如病毒的雙鏈RNA和細菌的脂多糖，對此，病原體很難產(chǎn)生突變而逃脫固有免疫的作用。PAMP主要包括兩類：以糖類和脂類為主的細菌胞壁成分。如脂多糖、肽聚糖、脂磷壁酸、甘露糖、類脂、脂阿拉伯甘露聚糖、脂蛋白和鞭毛素等。其中最為常見且具有代表性的是：革蘭陰性菌產(chǎn)生的脂多糖(1iposachride，LPS)；革蘭陽性菌產(chǎn)生的肽聚糖(pr

4、oteoglycan)；分枝桿菌產(chǎn)生的糖脂(glicolipid)和酵母菌產(chǎn)生的甘露糖。病毒產(chǎn)物及細菌胞核成分，如非甲基化寡核苷酸CpGDNA、單鏈RNA、雙鏈RNA。需要指出的是，上述PAMP可以表達在病原體表面或游離于免疫細胞之外，也可以出現(xiàn)在免疫細胞的胞質溶膠，以及溶膠中各種攜帶病原體的胞內區(qū)室(intracellularcompartment)，如內體和吞噬溶酶體。從宿主細胞釋放的內源性危險信號是杜撰的東西作為損傷相關分子模式（D-AMPS）Endogenous danger signals are things coined as damage associated molecula

5、r patterns (DAMPs) released from host cells組織損傷釋放的內源性配體，即DAMP組織細胞起始破壞及炎癥信號途徑激活,可能與局部缺血組織或細胞間基質損傷所釋放(內源性)損傷/危險相關分子模式信號(damage/danger associated molecular pattern,DAMP)有關。 天然免疫細胞表面Toll樣受體(Toll like receptor, TLR)是脊柱動物識別病原體感染最原始的一種方式,其通過識別、結合特異性分子模式而啟動胞內信號轉導途徑,進而激活核轉錄因子NF-B,誘導炎性細胞因子表達和多種生物學效應。TLR在天然免疫和

6、適應性免疫應答間發(fā)揮重要的橋梁作用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn),TLR識別的分子模式不僅包括病原微生物(及其產(chǎn)物)所共有的某些非特異性、高度保守的病原相關分子模式(Pathogen associated molecular pattern,PAMP),如脂多糖(LPS)、磷壁酸(LTA)、肽聚糖、細菌DNA、雙鏈RNA等,還包括組織細胞損傷破壞時所釋放的一系列內源性“危險信號”,如熱休克蛋白(HSP)、氧自由基、核甘酸、神經(jīng)介質、白介素等。 TLR1，TLR2，TLR4，TLR5，TLR6與位于細胞表面。TLR2形成與TLR1或TLR6形成異二聚體。TLR3，TLR7，TLR9和從內質網(wǎng)轉運下列細胞刺激到內溶酶

7、體區(qū)室。在CLR中是細胞表面受體，而最接近現(xiàn)代種和RLRS駐留在細胞質中。與其同源配體導致的信號級聯(lián)，導致炎癥反應的起始一個PRR的相互作用。細菌抗原（紅色）和的PAMP（藍色）存在于相同的吞噬體。TLR介導的識別細菌的PAMP的促進細菌抗原的MHC II類最佳演示文稿的選擇。TLR信號也導致共刺激分子和必需的活化和T細胞分化的細胞因子的誘導。樹突狀細胞（DCs）直接感染了病毒通過RIG-I識別的PAMP（藍色）細胞質內樣受體（RLRS）。胞質病毒蛋白（紅色）進行處理，并提出了關于MHC I類（通過傳統(tǒng)的內質網(wǎng)途徑）或MHC II類（通過自噬）。RLR信號導致共刺激分子和必需的活化和T細胞在M

8、HC I類途徑的情況下分化的細胞因子的誘導，這可能依賴于病毒抗原的豐度;為MHC II類，它可以依賴于靶向病毒抗原（紅色三角形）的自噬機械。病毒感染的non-APC通過RLRS識別的PAMP（藍線表示病毒核酸）的細胞質內，導致I型干擾素（干擾素）和激活DC等因素的分泌。感染的死細胞均是由非感染DCs，以及病毒的PAMP（藍色）是通過胞內Toll樣受體識別。病毒抗原（紅色三角形）進行處理，并提出了關于MHC II類（通過傳統(tǒng)的內體途徑）或MHC I類（通過交叉呈遞）。TLR信號導致共刺激分子和必需的活化和T細胞分化的細胞因子的誘導。在感染過程中所面臨的細菌的特異性免疫反應是由他們占據(jù)了亞細胞區(qū)室

9、決定的部分。胞菌受到吞噬專業(yè)吞噬細胞和補體介導的裂解。血管內和胞漿內的細菌受到由吞噬細胞自噬并通過溶酶體融合與膜結合隔間查殺。由細胞外或細胞內受體檢測細菌的PAMP激活的信號級聯(lián)反應，導致促炎轉錄反應。檢測在細胞質中的細菌的PAMP的也觸發(fā)激活inflammasomes，其中激活的炎性細胞因子。在這些途徑已知細菌被抑制的步驟都標有一個紅色的X。藍色橢圓形和圓形，桿狀和球菌的細菌，分別橙色六邊形，補，綠鉆石，溶酶體內降解酶;黃星，炎性;粉紅細胞表面“杯”，Toll樣受體（細胞外的PRRs）;白色箭頭，促炎細胞因子的轉錄響應。微生物相關分子模式（MAMPs）或損傷相關的分子模式（D-AMPS）接合

10、表面或細胞內的模式識別受體（模式識別受體），因此激活自噬機械，其靶向細胞內的病原體為溶酶體降解。AGER，高級糖基化終產(chǎn)物特異性受體，ALR，AIM2樣受體;BECN1，1的Beclin;NLR，NOD樣受體;RLR，RIG-I樣受體;和TLR，Toll樣受體。病毒劫持宿主機制來合成核酸（DNA或RNA）和所需要的新的病毒顆粒的裝配其它部件。這樣新綜合來的病毒成分可以通過各種多種SLRs的識別并定向到溶酶體降解。TLR配體可以被隔離在自噬體，這方便的同源胞內Toll樣受體的結合。這個過程可以刺激類型的分泌I型干擾素（IFN），從而增強抗原呈遞?？s寫如下：IRF7，IFN-調節(jié)因子7;MYD88

11、，髓樣分化初級反應88;和pDC，漿細胞樹突狀細胞。MHC II類。,被APCs捕獲的細胞外的抗原被傳遞到自噬體，它利用水解酶從核內體（如組織蛋白酶），以產(chǎn)生免疫原性肽和它們加載到MHC II類分子呈現(xiàn)給CD4 + T細胞,，不變鏈;MIIC，MHC II類裝載艙。 免疫突觸,一個IS的APCs和T淋巴細胞之間的形成導致的絲氨酸蘇氨酸激酶11（STK11）和AMP-活化蛋白激酶（AMPK），它抑制哺乳動物雷帕霉素靶的活化，從而促進自體吞噬,在此設置中，自噬是面向IS和降低突觸部件，最終動搖它和抑制T細胞的活化,縮寫如下：ICAM1，細胞間粘附分子1;ITGB2，整合素，B2，和TCR，T細胞受

12、體, Amphisomes,在吞噬細胞內自噬體抗原可依次通過amphisomes（與內涵體后形成自噬體的融合）和蛋白酶消化。蛋白酶體的降解產(chǎn)物可輸送回amphisomes通過與抗原加工（TAP）的相關轉運，因而裝上循環(huán)MHC I類分子對抗原呈遞至CD8 + T細胞,另外，溶酶體水解酶可以獨立的蛋白酶消化細胞內的抗原。這些肽被裝載到回收的獨立絲錐MHC I類分子（并且因此向CD8 + T細胞）,PRR可以組裝成高分子量的，被稱為“炎癥”caspase-1-激活平臺，控制成熟和白細胞介素如IL-1和IL-18，其強效促炎性活動直接宿主反應來感染和損傷.炎癥小體是一組蛋白復合物，識別誘導炎癥的刺激，

13、包括來自的PAMP和DAMPS和控制生產(chǎn)的重要的促炎細胞因子如白細胞介素-1（IL-1）和IL-18的一組不同的刺激一個正常的急性炎癥反應，是由。來自的PAMP所檢測到的模式識別受體感染的典型特征,消滅病原體消除了刺激，再加上造成了一些可逆的旁系的組織損傷，并設置的分辨率/修復階段的平臺，從而恢復正常組織穩(wěn)態(tài)的刺激,引起的非免疫病理生理過程，在這種或那種方式觸發(fā)一個初始的無菌炎性反應，常常無痛和容易通過生產(chǎn)損傷相關分子模式（D-AMPS）的慢性炎癥性疾病的典型特征。這種最初的反應就變成了由細胞因子和趨化因子放大。因為這個回應并沒有消除最初的刺激，持續(xù)無緩解地出現(xiàn)炎癥，最終導致組織損傷。炎癥反應

14、本身可以積極地影響了生產(chǎn)D-AMPS，它提供了一個額外的正反饋回路中。例如，在動脈粥樣硬化的情況下，活性氧中間體（ROI）和活性氮中間體（RNI）可以修改內皮下脂蛋白中，以一定的方式放大了它們促進炎癥的能力佐劑 宿主（老鼠或人類）與疫苗或疫苗佐劑配方PTC（的PAMP治療復雜）激活先天免疫途徑的免疫（TLRs的，的CLR，RLRS，最接近現(xiàn)代種和DNA傳感器），誘導炎性細胞因子和I型干擾素的分泌。這些細胞因子進一步通過B和T淋巴細胞激活適應性免疫組件。適應性免疫記憶細胞可保護宿主免受感染。自從巴斯德的時代，疫苗已用經(jīng)驗的方法殺死或減毒活微生物，病原體（亞單位疫苗），部分純化的組分，脫毒的毒素或

15、多糖的組成主要是發(fā)達國家。這些疫苗已經(jīng)非常成功地消除了許多嚴重的疾病。在過去的30年中，新技術的后續(xù)波所說的，是不可能用經(jīng)驗的方法可能的疫苗。白細胞介素-2(IL-2)*免疫佐劑作用: 與弱抗原的亞單位疫苗聯(lián)合應用, 增強免疫原性 批準上市2.ELISA的原理ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反

16、應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。 將免疫技術發(fā)展為檢測體液中微量物質的固相免疫測定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay，elisa）。elisa已被證明在蛋白與核酸檢測中十分有用的一種技術。絕大多數(shù)elisa使用以下3種策略：1 間接elisa（indirect elisa）：用于篩檢抗體（抗特定抗原

17、成分的特異性抗體）。此法是測定抗體最常用的方法。2 夾心elisa（sandwich elisa）：用于檢測目的抗原的量。其優(yōu)點是避免了對特異性抗體的直接標記，但增加了操作步驟和測定時間。3 競爭elisa（competitive elisa）用于確定抗原特異性或待檢標本中含交叉反應成分時為了提高實驗的特異性而使用的一種方法。根據(jù)標記抗原與同種未標記待測抗原與抗體間發(fā)生競爭性結合的原理，主要用于測定小分子抗原。除了以上3種，直接法用于檢測抗原或抗體（特別是總抗體濃度）方法已經(jīng)不常用。實驗中選用何種形式取決于實驗的目的，特別是待檢測標本的類型。特異性檢測可溶性細胞因子或趨化因子一般采用夾心eli

18、sa技術，細胞因子夾心elisa的實驗方法是用高純度的抗細胞因子的抗體（捕獲抗體）非共價吸附在塑料微孔板上。板子經(jīng)過洗滌后，固定的抗體可特異性捕獲樣本中存在的可溶性細胞因子蛋白。洗滌未結合的物質，通過加生物素聯(lián)接的抗細胞因子抗體（檢測抗體）來檢測被捕獲的細胞因子，然后再加酶標記的親合素或鏈親合素。最后加顯色底物溶液，顯色的程度通過elisa酶標檢測儀測定光密度（od：optical density）記錄。通過細胞因子的標準蛋白做已知濃度系列稀釋，測出od值后繪制出標準曲線，根據(jù)標準曲線可推算出標本中細胞因子的含量，一般使用計算機軟件可以很快得到結果細胞因子胞內染色依賴于預先對細胞進行固定、破膜

19、處理后鑒定細胞因子特異性抗體染色的熒光信號。預先對細胞進行固定可以保持細胞形態(tài)和細胞內的抗原性，而且可以使細胞對隨后的破膜過程產(chǎn)生耐受。破膜過程可以使熒光標記的細胞因子抗體穿過細胞膜和細胞器膜，與細胞因子進行特異性地結合，從而產(chǎn)生熒光信號，可通過流式細胞儀進行檢測"Cytometric Bead Array（CBA），即微量樣本多指標流式蛋白定量技術，是一個基于流式細胞檢測系統(tǒng)的多重蛋白定量檢測方法，它能夠同時對單個樣品中的多個指標進行檢測。CBA系統(tǒng)的工作原理簡單，對應受檢系統(tǒng)中的每一個檢測指標都設有不同的捕獲微球，不同的捕獲微球上包被有特異的捕獲抗體，并具有不同的熒光強度，通過捕

20、獲微球與待測樣品溶液混合后，微球上的特異性抗體就與樣品（血清、血漿或細胞培養(yǎng)液）中的相應抗原或蛋白結合，最后，加入熒光的檢測抗體以形成“三明治”夾心復合物，通過流式細胞樣進行熒光檢測，便可對樣品中的各檢測因子的含量進行分析。由于CBA系統(tǒng)中每一個微球都能夠提供一個和特定蛋白結合的表面，因此，每個微球就相當于一個單獨的、包被好的ELISA板；相對于傳統(tǒng)的ELISA技術，熒光信號顯色的靈敏度比一般化學發(fā)光的靈敏度高，加上利用流式細胞儀對于熒光信號的高敏感性及放大作用，使用這種技術檢測未知樣品中的指標所需要的樣品濃度更低，實驗時間更短；另外，常規(guī)的ELISA操作，每次只能對一個樣本中的一個指標進行檢

21、測，各檢測指標間的操作需分開進行，往往造成珍貴樣本的耗費，如病患者血液中向免疫調節(jié)細胞因子包括IFN-、TNF-、IL-2等，通過CBA系統(tǒng)，可同時對一個對樣品中的多個指標進行檢測，這為一些ELISA技術無法滿足的實驗提供了新的檢測手段。日常實驗中，常需對溶液體系中的可溶性蛋白進行定量檢測，如細胞培養(yǎng)上清或血清中的細胞因子含量的定量分析，由于這些因子的含量較少，低于一般常規(guī)方法的檢測下限，使用常用的蛋白檢測方法western Blot等很難檢測。 利用流式細胞儀可對熒光信號進行級數(shù)放大的特性，只需使受檢的可溶性因子附著于一些具有近似細胞直徑的微粒上，即可對受檢樣品中的各種可溶性因子進行檢測。該

22、技術能夠實現(xiàn)從一份標本中同時檢測多種指標，大大提高了科研人員的工作效率。其中代表技術是Luminex和BD CBA（cytometric bead array system,CBA），但是由于Luminex技術必須用Luminex儀器進行檢測和分析，而且該儀器價格昂貴，而CBA技術的檢測也局限于BD公司流式細胞儀及相關軟件，影響了該技術的推廣和應用。 自2004年，eBioscience公司旗下Bendder Medsystem公司開發(fā)了一系列在流式細胞儀平臺上進行多參數(shù)細胞因子或其它可溶性分子檢測的技術FlowCytomix技術，該技術克服了上述缺點，有利于多指標檢測技術的應用和推廣。4.常

23、將 CD4+CD25+T細胞稱為調節(jié)性 T 細胞 ( regulatory T cel,l Treg)。5. CAJ過敏性支氣管哮喘氣道炎癥與嗜酸性粒細胞產(chǎn)生的關系2 氣道炎癥及其與重塑的關系2.1 炎性細胞的浸潤氣道的慢性炎癥被認為是哮喘最重要的發(fā)病機制。其中炎性細胞的激活、浸潤在此過程中起著非常重要的作用，肥大細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞及血小板等等，在趨化因子和黏附因子的介導下，由外周血中向炎癥部位聚集、浸潤，這些細胞相互作用可以分泌50多種炎癥介質和20種以上的細胞因子，哮喘的炎性反應也就是這些炎性細胞、炎性介質、細胞因子相互作用的結果。在

24、眾多的炎性細胞中，嗜酸性粒細胞和嗜中性粒細胞的作用格外引人注意，在哮喘氣道中，嗜酸性粒細胞的活性與哮喘的嚴重程度和氣道高反應性密切相關。雖然整個氣道均有嗜酸性粒細胞的浸潤，但是在小氣道和大氣道氣管壁中浸潤的嗜酸性粒細胞的分布有所不同。在小氣道，嗜酸性粒細胞分布主要在氣道壁的外周平滑肌和肺泡粘附間，而在大氣道，嗜酸性粒細胞主要分布在氣道壁的內周平滑肌和基底膜間。在重癥哮喘中存在明顯的中性粒細胞炎癥。在急性發(fā)作期哮喘、嚴重的激素依賴性哮喘或死于哮喘的患者中，氣道中的中性粒細胞數(shù)明顯增加8。2.2 細胞因子的表達細胞因子是由細胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白的總稱。通常，許多免疫細胞間的相互作用是由細胞因子所介導的，炎性細胞在氣道的聚集和活化也受多種細胞因子的調節(jié)。在哮喘，T輔助2(Th2)T淋巴細胞和嗜酸性粒細胞在氣道炎癥中發(fā)揮主要作用，調節(jié)其功能的眾多細胞因子在哮喘患者的氣道中過度表達。這些細胞因子可分成以下幾種：淋巴因子（如：IL4、IL5、IL9和