發(fā)酵工程單元操作

1、第六章第六章 發(fā)酵工程基本操作發(fā)酵工程基本操作 主講人：劉萍第一節(jié) 嚴(yán)格消毒滅菌 控制有害微生物主要有以下幾種措施 （一）滅菌（sterilization） 采用強(qiáng)烈的理化因素使任何物體內(nèi)外部的一切微生物永遠(yuǎn)喪失其生長繁殖能力的措施，稱為滅菌，例如各種高溫滅菌措施等。 滅菌實(shí)質(zhì)上可分殺菌和溶菌兩種，前者指菌體雖死，但形體尚存，后者則指菌體殺死后，其細(xì)胞發(fā)生溶化、消失的現(xiàn)象 。（二）消毒（disinfection） 從字義上來看，消毒就是消除毒害，這里的“毒害”就是指傳染源或致病菌的意思，英文中的“dis-infection”也是“消除傳染”的意思。 所以，消毒是一種采用較溫和的理化因素，僅殺死

2、物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的病原菌，而對被消毒的物體基本無害的措施。（三）防腐（antisepsis） 防腐就是利用某種理化因素完全抑制霉腐微生物的生長繁殖，從而達(dá)到防止食品等發(fā)生霉腐的措施。（1）低溫（2）缺氧（3）干燥 （4）高滲 （5）高酸度 （6）防腐劑（四）化療（chemotherapy） 化療即化學(xué)治療。它是利用具有高度選擇毒力（即對病原菌具有高度毒力而對宿主無顯著毒性）的化學(xué)物質(zhì)來抑制宿主體內(nèi)病原微生物的生長繁殖，借以達(dá)到治療該傳染病的一種措施。 用于化療目的的化學(xué)物質(zhì)稱化學(xué)治療劑。最重要的化學(xué)治療劑如各種抗生素、磺胺類藥物和中草藥中的有效成分等。 除菌的方法 培養(yǎng)基的加熱滅

3、菌（包括常壓或蒸汽高壓加熱法） 空氣的過濾除菌 紫外線或電離輻射 化學(xué)藥物滅菌 （一）高溫殺菌作用的種類 高溫致死原理：由于它使微生物的蛋白質(zhì)和核酸等重要生物高分子發(fā)生變性、破壞，例如它可使核酸發(fā)生脫氨、脫嘌呤或降解，以及破壞細(xì)胞膜上的類脂質(zhì)成分等。 濕熱滅菌要比干熱滅菌更有效，這一方面是由于濕熱易于傳遞熱量，另一方面是由于濕熱更易破壞保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的氫鍵等結(jié)構(gòu)，從而加速其變性。1干熱滅菌法， 將金屬制品或清潔玻璃器皿放入電熱烘箱內(nèi)，在150170下維持12小時后，即可達(dá)到徹底滅菌的目的。在這種條件下，可使細(xì)胞膜破壞、蛋白質(zhì)變性、原生質(zhì)干燥，以及各種細(xì)胞成分發(fā)生氧化。灼燒，是一種最徹底的干熱

4、滅菌方法，但它只能用于接種環(huán)、接種針等少數(shù)對象的滅菌。 2濕熱滅菌法 濕熱滅菌法比干熱滅菌法更有效。 多數(shù)細(xì)菌和真菌的營養(yǎng)細(xì)胞在60左右處理510min后即可殺死； 酵母菌和真菌的孢子稍耐熱些，要用80以上的溫度處理才能殺死； 而細(xì)菌的芽孢最耐熱，一般要在120下處理15min才能殺死。（1）常壓法 巴氏消毒法（pasteurization） 用于牛奶、啤酒、果酒和醬油等不能進(jìn)行高溫滅菌的液體的一種消毒方法，其主要目的是殺死其中無芽孢的病原菌（如牛奶中的結(jié)核桿菌或沙門氏菌），而又不影響它們的風(fēng)味。 巴氏消毒法是一種低溫消毒法 低溫維持法：在63下保持30分鐘可進(jìn)行牛奶消毒； 高溫瞬時法：用于牛

5、奶消毒時只要在72下保持15秒鐘即可。 間歇滅菌法，又稱丁達(dá)爾滅菌法或分段滅菌法。適用于不耐熱培養(yǎng)基的滅菌。 方法是：將待滅菌的培養(yǎng)基在80100下蒸煮1560分鐘，以殺死其中所有微生物的營養(yǎng)細(xì)胞，然后置室溫或37下保溫過夜，誘導(dǎo)殘留的芽孢發(fā)芽，第二天再以同法蒸煮和保溫過夜，如此連續(xù)重復(fù)3天，即可在較低溫度下達(dá)到徹底滅菌的效果。（2）加壓法 常規(guī)加壓滅菌法 盛有適量水的加壓蒸汽滅菌鍋加熱煮沸，徹底驅(qū)盡后將鍋密閉，再繼續(xù)加熱至121（壓力為1kgcm2或15磅英寸2），時間維持1520分鐘，也可采用在較低的溫度（115，即0.7kgcm2或10磅英寸2）下維持35分鐘的方法。 此法適合于一切微生

6、物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)療保健機(jī)構(gòu)或發(fā)酵工廠中對培養(yǎng)基及多種器材、物料的滅菌。 連續(xù)加壓滅菌法 在發(fā)酵行業(yè)里也稱“連消法”。此法只在大規(guī)模的發(fā)酵工廠中作培養(yǎng)基滅菌用。 主要操作：將培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外連續(xù)不斷地進(jìn)行加熱、維持和冷卻，然后才進(jìn)入發(fā)酵罐。培養(yǎng)基一般在135140下處理515秒鐘。 連續(xù)加壓滅菌法優(yōu)點(diǎn) 因采用高溫瞬時滅菌，故既可殺滅微生物，又可最大限度減少營養(yǎng)成分的破壞，從而提高了原料的利用率，比“實(shí)罐滅菌”（120，30分鐘）提高產(chǎn)量510；由于總的滅菌時間較分批滅菌注明顯減少，所以縮短了發(fā)酵罐的占用周期，從而提高了它的利用率；由于蒸汽負(fù)荷均勻，故提高了鍋爐的利用率；適宜于自動化操作；降低了操作

7、人員的勞動強(qiáng)度。 （二）影響加壓蒸汽滅菌效果的因素 （1）滅菌物體含菌量的影響。 天然原料尤其是麩皮等植物性原料配成的培養(yǎng)基，一般含菌量較高，而用純粹化學(xué)試劑配制成的組合培養(yǎng)基，含菌量低。 （2）滅菌鍋內(nèi)空氣排除程度的影響 檢驗(yàn)滅菌鍋內(nèi)空氣排除度，可采用多種方法。最好的辦法是滅菌鍋上同時裝有壓力表和溫度計，其次是將待測氣體通過橡膠管引入深層冷水中，如只聽到“撲撲”聲而未見有氣泡冒出，也可證明鍋內(nèi)已是純蒸汽了。 （3）滅菌對象pH的影響 （4）滅菌對象的體積。要防止用常規(guī)的壓力和時間在加壓滅菌鍋內(nèi)進(jìn)行大容量培養(yǎng)基的滅菌。 （5）加熱與散熱速度。這兩段時間也對滅菌效果和培養(yǎng)基成分發(fā)生影響。為了使科

8、學(xué)研究的結(jié)果有良好的重演性，在滅菌操作中對這些技術(shù)細(xì)節(jié)都應(yīng)加以注意。 （三）高溫對培養(yǎng)基成分的有害影響及其防止 消除高溫有害影響的措施 （1）采用特殊加熱滅菌法 （2）對易破壞的含糖培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌時，應(yīng)先將糖液與其他成分分別滅菌后再合并； （3）對含Ca2+或Fe3+的培養(yǎng)基與磷酸鹽先作分別滅菌，然后再混合，就不易形成磷酸鹽沉淀；（4）對含有在高溫下易破壞成分的培養(yǎng)基（如含糖組合培養(yǎng)基）可進(jìn)行低壓滅菌（在112即0.57kgcm2或8磅英寸2下滅菌15分鐘）或間歇滅菌；（5）在大規(guī)模發(fā)酵工業(yè)中，可采用連續(xù)加壓滅菌法進(jìn)行培養(yǎng)基的滅菌(二二)滅菌設(shè)備滅菌設(shè)備 l、高壓蒸汽滅菌、高壓蒸汽滅菌 生產(chǎn)中

9、使用高壓蒸汽滅菌鍋生產(chǎn)中使用高壓蒸汽滅菌鍋的型號很多的型號很多手提式滅菌鍋，容量小，多用于母種培養(yǎng)基滅菌。手提式滅菌鍋，容量小，多用于母種培養(yǎng)基滅菌。立式或臥式滅菌鍋較大，多用于原種或少量栽培立式或臥式滅菌鍋較大，多用于原種或少量栽培種培養(yǎng)基的滅菌，一般能裝幾十瓶或幾百瓶。種培養(yǎng)基的滅菌，一般能裝幾十瓶或幾百瓶。滅菌柜要和蒸汽鍋爐配套，用于大量的原種和栽滅菌柜要和蒸汽鍋爐配套，用于大量的原種和栽培種培養(yǎng)基的滅菌，一次能裝幾百至幾千瓶培種培養(yǎng)基的滅菌，一次能裝幾百至幾千瓶(袋袋)。但投資太大，適合大型菌種場使用。但投資太大，適合大型菌種場使用。 2常壓蒸汽滅菌鍋 常壓蒸汽滅菌鍋是用鐵鍋、磚、水泥

10、砌成的，造價低，適于一般生產(chǎn)單位和專業(yè)戶使用。大小可根據(jù)需要而定，但最大的鍋每次裝料也最好不超過500公斤。 3烘箱 烘箱主要是用于玻璃器皿的干燥和滅菌，也可用于其它物品烘干。 第四節(jié)第四節(jié) 培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基的滅菌 、濕熱滅菌的基本原理： 濕熱滅菌是直接用蒸汽滅菌。蒸汽冷凝時釋放大量潛熱，并具有強(qiáng)有強(qiáng)大的穿透力，在高溫和水存在時，微生物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)極易發(fā)生不可逆的凝固性變性，致使微生物在短時間內(nèi)死亡。 由于濕熱滅菌有經(jīng)濟(jì)和快速等特點(diǎn)，因此被廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)。 用蒸汽加熱的方法對培養(yǎng)基滅菌的要求是: 既要達(dá)到一定的滅菌程度， 又要盡量減少營養(yǎng)成分的破壞。（一）理論滅菌時間（一）理論滅菌時間

11、某些分子的分解和分子內(nèi)部的重新排列的反應(yīng)屬于單分子反應(yīng)。 雜菌雖然是一個復(fù)雜的高分子體系，但其受熱被殺死，主要原因是高溫能使蛋白質(zhì)變性，這種反應(yīng)屬與單分子反應(yīng)，因此雜菌在一定溫度下受熱死亡也遵循單分子反應(yīng)方程。 =(2.303/k)log(No/Ns) =(2.303/k)log(No/Ns) - - -滅菌時間（秒）滅菌時間（秒） k-k-反應(yīng)速度常數(shù)，與菌的種類和加熱溫度有關(guān)（反應(yīng)速度常數(shù)，與菌的種類和加熱溫度有關(guān)（s s） No-No-滅菌開始時，污染的培養(yǎng)基中雜菌個數(shù)（個滅菌開始時，污染的培養(yǎng)基中雜菌個數(shù)（個mlml） Ns-Ns-經(jīng)過滅菌時間經(jīng)過滅菌時間T T后，殘存活菌個數(shù)（個后，

12、殘存活菌個數(shù)（個mlml） （二）滅菌溫度與菌反應(yīng)速度（二）滅菌溫度與菌反應(yīng)速度常數(shù)的關(guān)系常數(shù)的關(guān)系 滅菌溫度與菌死亡反應(yīng)速度常數(shù)的關(guān)系：滅菌溫度與菌死亡反應(yīng)速度常數(shù)的關(guān)系： k=Ae-E/RT k=Ae-E/RT K K菌死亡的速度常數(shù)（菌死亡的速度常數(shù)（1 1秒），當(dāng)反應(yīng)物的濃度為單位濃度時，秒），當(dāng)反應(yīng)物的濃度為單位濃度時，則反應(yīng)速度常數(shù)在數(shù)值上等于反應(yīng)速度則反應(yīng)速度常數(shù)在數(shù)值上等于反應(yīng)速度 A A阿累尼烏斯常數(shù)（阿累尼烏斯常數(shù)（1 1秒）秒） R R氣體常數(shù)（氣體常數(shù)（1.9871.987* *4.8174.817焦開摩爾）焦開摩爾） T T絕對溫度（開）絕對溫度（開） 二、影響培養(yǎng)基

13、滅菌的因素二、影響培養(yǎng)基滅菌的因素 1、pH值的影響 pH值對微生物的耐熱性影響很大，pH為6.08.0時微生物最不易死亡， pH 6.0時氫離子易滲入微生物的細(xì)胞內(nèi)。 2、培養(yǎng)基成分 培養(yǎng)基的成分中，油脂、糖類、蛋白質(zhì)都是傳熱的不良介質(zhì)，會增加微生物的耐熱性，使滅菌困難。 濃度較高的培養(yǎng)基相對需要較高溫度和較長時間滅菌。 高濃度的鹽類，色素則削弱其耐熱性，故較易滅菌。 3、培養(yǎng)基中的顆粒物質(zhì) 培養(yǎng)基中的顆粒物質(zhì)大，滅菌困難，反之，滅菌容易。一般說來，含有顆粒對培養(yǎng)基滅菌影響不大，但在培養(yǎng)基混有較大顆粒，特別是存在凝結(jié)成團(tuán)的膠體時，會影響滅菌效果，必須過濾除去。 三、滅菌的實(shí)際操作三、滅菌的實(shí)

14、際操作 （一）空罐滅菌（一）空罐滅菌 空罐滅菌也稱空消。無論是種子罐、發(fā)酵罐、還是尿素（或液氨）罐、消泡罐，當(dāng)培養(yǎng)基（或物料）尚未進(jìn)罐前對罐進(jìn)行預(yù)先滅菌，為空罐滅菌。 為了殺死所有微生物特別是耐熱的的芽孢，空罐滅菌要求溫度較高，滅菌時間較長，只有這樣才能殺死設(shè)備中各死角殘存的雜菌或芽孢。 （二）實(shí)罐滅菌（二）實(shí)罐滅菌 將培養(yǎng)基置于發(fā)酵罐中用蒸汽加熱，達(dá)到預(yù)定滅菌溫度后，維持一定時間，再冷卻到發(fā)酵溫度，然后接種發(fā)酵，這叫做實(shí)罐滅菌，又稱分批滅菌。 操作要點(diǎn)： 三路進(jìn)汽：直接蒸汽從通風(fēng)、取樣和出料口進(jìn)入罐內(nèi)直接加熱，直到所規(guī)定的溫度，并維持一定的時間。這就是所謂的“三路進(jìn)氣”。 培養(yǎng)基連消工藝流程

15、圖培養(yǎng)基連消工藝流程圖 （2）過濾除菌法 是將液體或氣體用微孔薄膜過濾，使大于孔徑的細(xì)菌等微生物顆粒阻留，從而達(dá)到除菌目的。在體外培養(yǎng)時，過濾除菌大多用于遇熱容易變性而失效的試劑或培養(yǎng)液。 目前，大多實(shí)驗(yàn)室采用微孔濾膜濾器除菌。關(guān)鍵步驟是安裝濾膜及無菌過濾過程。 濾膜過濾裝置、燒結(jié)玻璃濾板過濾器、石棉板過濾器（Seitz濾器）、素?zé)蛇^濾器以及硅藻土過濾器等。過濾除菌的缺點(diǎn)是無法去除其中的病毒和噬菌體。 （3）其他方法 在配制培養(yǎng)基時，為避免發(fā)生沉淀，一般應(yīng)按配方逐一加入各種成分。 另外，加入0.01EDTA或0.01NTA（氮川三乙酸）等螯合劑到培養(yǎng)基中，可防止金屬離子發(fā)生沉淀。 最后，還可

16、以用氣體滅菌劑如氧化乙烯等對個別成分進(jìn)行滅菌處理。三、化學(xué)殺菌劑或制菌劑三、化學(xué)殺菌劑或制菌劑 （一）表面消毒劑 常用消毒劑的種類很多，它們的殺菌強(qiáng)度各不相同。但幾乎都有一個共同規(guī)律，即當(dāng)其在極低濃度時，常常會對微生物的生命活動起刺激作用，隨著濃度逐漸增高，就相繼出現(xiàn)制菌和殺菌作用，因而形成一個連續(xù)的作用譜。 表面消毒劑是指對一切活細(xì)胞都有毒性，不能用作活細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)治療用的化學(xué)藥劑。 為比較各種表面消毒劑的相對殺菌強(qiáng)度，常采用在臨床上最早使用的消毒劑石炭酸作為比較的標(biāo)準(zhǔn)，并提出了石炭酸系數(shù)這一指標(biāo)。 所謂石炭酸系數(shù)，指在一定時間內(nèi)被試藥劑能殺死全部供試菌的最高稀釋度與達(dá)到同效的石炭酸的最高稀

17、釋度的比率。一般規(guī)定處理時間為10分鐘，而供試菌定為Salmonellatyphi（傷寒沙門氏菌）。 消消 毒毒 試試 驗(yàn)驗(yàn) 以人工染菌實(shí)物為消毒對象，模擬現(xiàn)場表面污染大腸桿菌液。 消毒前采樣：放置無菌規(guī)格板，取無菌棉拭于含5ml稀釋液試管中沾濕， 在規(guī)格板空心處旋轉(zhuǎn)自左至右涂抹整個區(qū)域 消毒后采樣：在前采樣地點(diǎn)旁用0.05過氧乙酸溶液消毒物體表面，30分鐘后將無菌棉 拭于含5ml采樣液試管中沾濕，作為消毒后樣液。 將 消 毒 前 后 樣 液 充 分 振 蕩 搖 勻 后 稀 釋 培養(yǎng)待凝固后37培養(yǎng)2448小時，作菌落計數(shù)。滅菌效果監(jiān)測滅菌效果監(jiān)測 、高壓蒸氣滅菌效果監(jiān)測 (1) 高壓蒸氣滅菌

18、指示卡：將卡片放入滅菌器不同部位，觀察滅菌后指示卡顏色變化。 (2)芽胞菌片法：將每片染有嗜熱脂肪桿菌芽胞105cfu/ml的菌片包好、放入滅菌器內(nèi)。滅菌后作細(xì)菌計數(shù)測定。 對照是不經(jīng)滅菌的菌片，芽胞完全被殺滅或殺來率達(dá)99.9999為合格。 、紫外線消毒效果監(jiān)測 微型紫外線強(qiáng)度計：使用時打開儀器開關(guān)，裝入電池，打開電源開關(guān) ，接通電源，將測定電壓轉(zhuǎn)換開關(guān)撥至電壓一方，此時指針應(yīng)超過中線。 測定時，將測定電壓轉(zhuǎn)換開關(guān)撥至測定一方，打開紫外線燈照射分鐘后，將紫外線燈強(qiáng)度計置于紫外線燈下垂直的中央進(jìn)行照射， 直至儀表指針穩(wěn)定，所示之值即為該紫外線燈的強(qiáng)度值(uw/cm2) 。 (2)紫外線強(qiáng)度與消

19、毒劑量指示卡： 測定燈管強(qiáng)度時，將卡片置于離紫外燈管的中央處，將圖案一面朝向燈管，照射一分鐘（照射時間要準(zhǔn)確）后，圖案正中涂層由白色變?yōu)樽霞t色。與周圍相應(yīng)色塊相比，可測知所照射的強(qiáng)度。 新燈管以不低于100uw/cm2為合格，舊燈管低于70uw/cm2應(yīng)更換。 第二節(jié)第二節(jié) 空氣的凈化空氣的凈化 一、空氣中微生物的分布一、空氣中微生物的分布 空氣中微生物的含量和種類，隨地區(qū)，季節(jié)和空氣中灰塵粒子多少，以及人們的活動情況而異。 .北方氣候干燥，寒冷，空氣中的含菌量較多，離地面越高，含菌量越少；一般每升高10米，空氣中的含菌量就降低一個數(shù)量級； 城市的空氣中含菌量較多，農(nóng)村的空氣中含菌量較少，一般

20、城市空氣中雜菌數(shù)為30008000個米3 。 空氣中的微生物種類以細(xì)菌和細(xì)菌芽胞較多，也有酵母，霉菌和病毒。 這些微生物大小不一，一般附著在空氣中的灰塵上或霧滴上，空氣中微生物的含量一般為103104個米3。 灰塵粒子的平均大小約0.6m左右，所以空氣除菌主要是去除空氣中的微粒(0.6-1m ）二、空氣除菌二、空氣除菌 工業(yè)發(fā)酵對空氣處理的要求隨發(fā)酵產(chǎn)品和菌種不同而異。 半固體制曲和酵母生產(chǎn)中無菌要求不十分嚴(yán)格，一般無需復(fù)雜的空所凈化處理； 密閉的深層通氣發(fā)酵需嚴(yán)格的純凈培養(yǎng)，進(jìn)入發(fā)酵罐前空氣必須進(jìn)行冷卻、脫水、脫油和過濾除菌等處理。（二）發(fā)酵對空氣無菌程度（二）發(fā)酵對空氣無菌程度的要求的要求

21、 好氣性發(fā)酵過程中需要大量的無菌空氣，空氣要作到 絕對無菌在目前是不可能的，也是不經(jīng)濟(jì)的。 發(fā)酵對無菌空氣的要求是 ：無菌，無灰塵，無雜質(zhì)，無水，無油，正壓等幾項指標(biāo)； 發(fā)酵對無菌空氣的無菌程度要求是：只要在發(fā)酵過程中不因無菌空氣染菌，而造成損失即可。 在工程設(shè)計中一般要求1000次使用周期中只允許有一個菌通過，即經(jīng)過濾后空氣的無菌程度為N=10-3 二、空氣除菌的方法二、空氣除菌的方法 （一）（一） 輻射殺菌輻射殺菌 （二）（二） 熱殺菌熱殺菌 （三）（三） 靜電除菌靜電除菌 （四）（四） 過濾除菌過濾除菌 3 3輻射滅菌法輻射滅菌法 最常用的是用紫外光線進(jìn)行無菌室滅菌。2537波長的紫外線

22、具有極強(qiáng)烈的殺菌效力，它的主要作用是使微生物的DNA分子產(chǎn)生的胸腺嘧啶的二聚體，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 無菌室常用的紫外燈功率為30W，安裝在操作臺上方一米左右高處，每次照射15-30min既可。 紫外線有很強(qiáng)的殺菌力，但穿透力很弱，一張薄紙即可完全擋住紫外線，因此待滅菌物品必須置于紫外光直接照射下，而且在一定范圍內(nèi)作用強(qiáng)度與距離平方成反比。 此外，紫外線對人體組織有一定刺激作用，眼睛、皮膚受照射后會產(chǎn)生某些癥狀，所以工作人員在無菌室操作時應(yīng)關(guān)閉紫外燈熱滅菌熱滅菌 原理：基于加熱后微生物體內(nèi)的蛋白（酶）熱變性而得以實(shí)現(xiàn)。 熱空氣進(jìn)入培養(yǎng)系統(tǒng)之前，一般均需用壓縮機(jī)壓縮，提高壓力。 空氣壓縮后溫度能達(dá)到2

23、00度以上，保持一定時間后，便可實(shí)行干熱殺菌。 利用空氣壓縮時所產(chǎn)生的熱量進(jìn)行滅菌的原理對制備大量無菌空氣有特別意義。 實(shí)際應(yīng)用中需考慮培養(yǎng)裝置與空氣壓縮機(jī)的相對位置，連接壓縮機(jī)與培養(yǎng)裝置的管道的滅菌以及管道長度等。靜電除菌靜電除菌 靜電除塵器可除去空氣中的水霧、油霧、塵埃，同時也除去微生物。 原理：利用靜電引力來吸附帶電粒子而達(dá)到除塵滅菌目的。 對于一些直徑小的微粒，所帶電荷小，不能被吸附而沉降。介質(zhì)過濾除菌介質(zhì)過濾除菌 介質(zhì)過濾除菌是使空氣通過經(jīng)高溫滅菌的介質(zhì)過濾層，將空氣中的微生物等顆粒阻截在介質(zhì)層中，而達(dá)到除菌的目的。 從可靠性，經(jīng)濟(jì)適用與便于控制等方面考慮，目前仍以介質(zhì)過濾法較好，也

24、是大多數(shù)發(fā)酵廠廣泛采用的方法。發(fā)酵生產(chǎn)中制備無菌空氣的大發(fā)酵生產(chǎn)中制備無菌空氣的大致過程致過程 要制備較高無菌程度，具有一定壓力的無菌空氣，它的流程設(shè)備有空氣壓縮機(jī)。 附屬設(shè)備要求盡量采用新技術(shù)，提高效率，減少設(shè)備，精簡設(shè)備投資、運(yùn)轉(zhuǎn)費(fèi)用和動力消耗，簡便操作。 流程的制訂就根據(jù)所在的地理、氣候環(huán)境和設(shè)備條件而考慮。 在環(huán)境污染比較嚴(yán)重的地方，要考慮改變吸風(fēng)的條件，以降低過濾器的負(fù)荷，提高空氣的無菌程度； 在溫暖潮濕的南方，要加強(qiáng)除水設(shè)施，以確保和發(fā)揮過濾器的最大除菌效率； 在壓縮機(jī)耗油嚴(yán)重的設(shè)備流程中則要加強(qiáng)消除油霧的污染等等。 要保持過濾器有比較高的過濾效率，應(yīng)維持一定的氣流速度和不受油、水

25、的干擾。 氣流速度可由操作來控制； 要保持不受油、水干擾則要有一系列冷卻、分離、加熱的設(shè)備來保證空氣的相對濕度在50%60%的條件下過濾。 高空取氣管是遠(yuǎn)離地面幾十米的管子。一般而言，地面附近空氣中所含的 微生物和灰塵等均比高空空氣中含的多，據(jù)資料介紹，每升高10米，空氣中雜菌可降低一個數(shù)量級，因此從高空取氣要比從低空取氣有利得多。 油水分離器油水分離器 其內(nèi)部同時采用直接攔截，慣性碰撞，布朗擴(kuò)散及凝聚等機(jī)理，能有效地去除空氣中的水、油霧、塵埃，內(nèi)部不銹鋼絲網(wǎng)可清洗，使用壽命長。兩級分離、冷卻、加熱的空氣除菌流程 粗過濾器粗過濾器壓縮機(jī)壓縮機(jī) 貯罐貯罐冷卻器冷卻器 絲網(wǎng)分離器絲網(wǎng)分離器 過濾器

26、過濾器 高效前置過濾器高效前置過濾器壓縮機(jī)壓縮機(jī)貯罐貯罐冷卻器冷卻器 絲網(wǎng)分離器絲網(wǎng)分離器加熱器加熱器過濾器過濾器 空氣凈化的流程空氣凈化的流程 吸氣口吸入的空氣先經(jīng)過壓縮前的過濾 進(jìn)入空氣壓縮機(jī)（120-150度） 冷卻（20-25度），除去油、水，再加熱至30-35度。 最后通過總過濾器和分過濾器除菌，獲得潔凈度、壓力、溫度和流量都符合要求的無菌空氣。 概述： 目前發(fā)酵工廠采用的空氣過濾設(shè)備大多數(shù)是傳統(tǒng)的深層過濾設(shè)備，濾層厚度一般為12米，所用的過濾介質(zhì)一般是棉花、活性炭，也有采用玻璃纖維、焦炭等。 對不同的材料，材料的不同規(guī)格，材料的填充情況不同，都會得到不同的過濾效果。為了制取適合要求

27、的無菌空氣，就得深入研究深層過濾的各種關(guān)系。 深層過濾所用的過濾介質(zhì)棉花的纖維直徑一般為1620微米。 充填系數(shù)為8%時，棉花纖維所形成網(wǎng)格的孔隙為2050微米，微粒大小為(0.5-2微米)。 微粒隨氣流通過濾層時，濾層纖維所形成的網(wǎng)格阻礙氣流前進(jìn)，使氣流出現(xiàn)無數(shù)次改變運(yùn)動速度和運(yùn)動方向，繞過纖維前進(jìn)； 這些改變引起微粒以對濾層纖維產(chǎn)生慣性沖擊、阻攔、重力沉降、布朗擴(kuò)散、靜電吸引等作用而把微粒滯留在纖維表面上。 纖維介質(zhì)阻留微粒的機(jī)制纖維介質(zhì)阻留微粒的機(jī)制 1阻攔截留：微粒隨空氣氣流向前運(yùn)動，當(dāng)氣流為層流時，隨氣流運(yùn)動的粒子在接近纖維表面的部分由于與過濾介質(zhì)接觸而被纖維吸附捕集，這種作用稱之為

28、阻攔截留。 空氣流速愈小，纖維直徑愈細(xì)，阻攔截留作用愈大。但是在介質(zhì)過濾的除塵除菌中，阻攔截留并不起主要作用。 2慣性碰撞截留：空氣氣流流速大時，氣流中的微粒具有較大的慣性力。當(dāng)微粒隨氣流以一定速度向纖維垂直運(yùn)動因受纖維阻擋而急劇改變運(yùn)動方向時，由于微粒具有的慣性作用使它們?nèi)匀谎卦瓉矸较蚯斑M(jìn)碰撞到纖維表面，產(chǎn)生摩擦粘附而使微粒被截留在纖維表面，這種作用稱慣性碰撞截留。 截留區(qū)域的大小決定于微粒運(yùn)動的慣性力，所以，氣流速度愈大，慣性力大，截留效果也愈好。此外，慣性碰撞截面作用也與纖維直徑有關(guān)，纖維愈細(xì)，捕集效果愈好。慣性碰撞截面在介質(zhì)除塵中起主要作用。 3布朗擴(kuò)散運(yùn)動：直徑小于1的微粒在運(yùn)動中往

29、往產(chǎn)生種不規(guī)則的布朗運(yùn)動，使微粒間相互凝集成較大的粒子，從而發(fā)生重力沉降或被介質(zhì)敲留。但是這種作用只有在氣流速度較低時才較顯著。 重力沉降是一個穩(wěn)定的分離作用，當(dāng)微粒所受的重力大于氣流對它的拖帶力時，微粒就容易沉降。 就單一的重力沉降情況下，大顆粒比小顆粒作用顯著，對于小顆粒只有在氣流速度很慢時才起作用。 一般它是與攔截作用相配合的，即在纖維的邊界滯留區(qū)內(nèi)，微粒的沉降作用提高了攔截滯留的捕集效率。 干空氣對非導(dǎo)體的物質(zhì)相對運(yùn)動磨擦?xí)r，會產(chǎn)生誘導(dǎo)電荷，纖維和樹脂處理過的纖維，尤其是一些合成纖維更為顯著。 懸浮在空氣中的微生物微粒大多帶有不同的電荷，如枯草桿菌孢子20%帶正電荷，20%帶負(fù)電荷，1

30、5%中性， 這些帶電的微粒會受帶異性電荷的物體所吸引而沉降。 此外，表面吸附也歸屬于這個范疇，如活性炭的大部分過濾效能應(yīng)是表面吸附的作用?？諝膺^濾除菌空氣過濾除菌介質(zhì)介質(zhì) 、棉花 、玻璃纖維 、活性炭 、超細(xì)玻璃纖維紙 、石棉濾板 、燒結(jié)材料過濾介質(zhì) 、新型過濾介質(zhì) 影響介質(zhì)過濾效率的因素影響介質(zhì)過濾效率的因素 介質(zhì)過濾效率與介質(zhì)纖維直徑關(guān)系很大，在其他條件相同時，介質(zhì)纖維直徑越小，過濾效率越高。 對于相同介質(zhì)，過濾效率與介質(zhì)濾層厚度、介質(zhì)填充密度和空氣流量有關(guān)。提高過濾除菌效率的措施提高過濾除菌效率的措施 鑒于目前所采用的過濾介質(zhì)均需要干燥條件下才能進(jìn)行除菌，因此需要圍繞介質(zhì)來提高除菌效率。

31、 （1）設(shè)計合理的空氣預(yù)處理設(shè)備，選擇合適的空氣凈化流程，以達(dá)到除油、水和雜質(zhì)的目的。 （2）設(shè)計和安裝合理的空氣過濾器，選用除菌效率高的過濾介質(zhì)。 （3）保證進(jìn)口空氣清潔度，如加強(qiáng)生產(chǎn)場地衛(wèi)生管理，正確選擇進(jìn)風(fēng)口，加強(qiáng)空氣壓縮前的預(yù)處理。 （4）降低進(jìn)入空氣過濾器的空氣相對濕度，如使用無油潤滑的空氣壓縮機(jī)，加強(qiáng)空氣冷卻和去油，提高進(jìn)入過濾器的空氣溫度。過濾器失效過濾器失效 壓縮空氣進(jìn)入過濾器后便引起活性炭顆粒之間相互頂撞與摩擦，久而成為粉末(灰化)，活性炭的體積也逐漸變小，于是過濾器內(nèi)的空間逐漸增大，到達(dá)-定程度時，便會發(fā)生棉花成90翻身現(xiàn)象。這樣空氣便會未經(jīng)過濾而進(jìn)入罐內(nèi)，引起染菌。 棉花

32、經(jīng)過多次加熱滅菌后，顏色逐漸變深，靠近過濾器壁的棉花，因經(jīng)受夾層蒸汽的烤干，受熱更為劇烈，更容易變成粉末，而被空氣帶走，造成過濾層有縫隙，使過濾層疏松而漏風(fēng)甚至還因過高的壓力和過長時間的烘烤而引起棉花活性炭著火的事故。（二）（二）過濾器的結(jié)構(gòu)過濾器的結(jié)構(gòu) 、棉花活性炭過濾器 棉花是最常用的過濾介質(zhì)，通常要用纖維不太長的原棉，因?yàn)樗哂幸欢ǖ膹椥?，雖然幾經(jīng)濕熱滅菌，干燥后仍能保持原有的疏松狀態(tài)。棉花的過濾阻力較活性炭大（1012倍）。 活性炭通常被加工成粒狀，其過濾效率比棉花低，但具有阻力小，吸附力強(qiáng)（可吸附空氣中有害物質(zhì)，如油、水）的特點(diǎn)，通常與棉花介質(zhì)一起使用，減少過濾層的阻力。 棉花活性炭

33、過濾器的過濾效率可達(dá)99%. 其過濾介質(zhì)裝填為： 上部和下部裝填棉花，其厚度為總過濾層的2*（1/41/3），中間再裝入1/21/3厚度的活性炭。一般棉花的填充密度為150200公斤/米3，活性炭40450公斤/米3。 孔板 金屬絲網(wǎng) 麻布織品棉花麻布織品活性炭麻布織品棉花麻布織品金屬絲網(wǎng)孔板按入式過濾器按入式過濾器1、便于迅速更換 2、活塞型濾芯與殼體密封，防止未過濾的氣體繞過濾芯 3、防腐蝕濾芯：不銹鋼芯以增強(qiáng)結(jié)構(gòu)性能；氣流阻力低；采用縫焊以提高強(qiáng)度 4、新型矩陣混合纖維介質(zhì)有效表面積大，確保高效率；開放區(qū)大，盡量減少壓降 5、涂膜封閉式泡沫套筒抗油類和酸類物質(zhì)的腐蝕，防止液體重新混入氣流

34、，確保高效率 6、不含石硅樹脂 7、可承受65的高溫 微生物的培養(yǎng)方法微生物的培養(yǎng)方法氧的供需氧的供需 實(shí)驗(yàn)室中，通過搖瓶機(jī)往復(fù)運(yùn)動或偏心旋轉(zhuǎn)運(yùn)動供氧。 中試規(guī)模和生產(chǎn)規(guī)模的培養(yǎng)裝置采用通入無菌壓縮空氣并同時進(jìn)行攪拌的方式。 近年來開發(fā)出無攪拌裝置的節(jié)能培養(yǎng)設(shè)備，如氣升式發(fā)酵罐。 細(xì)胞對鼓泡通氣和機(jī)械攪拌產(chǎn)生的剪切作用敏感。 在常壓下（20）達(dá)到平衡時，氧在水中的溶解度僅為6.2mlL（0.28mmol）。這些氧只能保證氧化8.3mg（即0.046mmol）葡萄糖，僅相當(dāng)培養(yǎng)基中常用葡萄糖濃度的1。 除葡萄糖外，培養(yǎng)基中的無機(jī)或有機(jī)養(yǎng)料一般都可保證微生物使用幾小時至幾天。 對好氧菌來說，生長的

35、限制因子幾乎總是氧的供應(yīng)。 只有將培養(yǎng)液裝成淺層時，氧才不至于成為限制因子。提高溶氧速率的措施提高溶氧速率的措施 在進(jìn)行液體培養(yǎng)時，一般可通過增加液體與氧的接觸面積或提高氧分壓來提高溶氧速率， 具體措施有： 淺層液體培養(yǎng)； 利用往復(fù)式或旋轉(zhuǎn)式搖床（shaker）對三角瓶培養(yǎng)物作振蕩培養(yǎng)； 在深層液體培養(yǎng)器的底部通入加壓空氣，并用氣體分布器使其以小氣泡形式均勻噴出； 對培養(yǎng)液進(jìn)行機(jī)械攪拌，并在培養(yǎng)器的壁上設(shè)置阻擋裝置。 在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行好氧菌培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行好氧菌培養(yǎng)的具體方法的具體方法 （1）試管液體培養(yǎng)裝液量可多可少。此法的通氣效果一般均不夠理想，僅適合培養(yǎng)兼性厭氧菌。 （2）三角瓶淺層培養(yǎng)在靜

36、止?fàn)顟B(tài)下，三角瓶內(nèi)的通氣狀況與其中裝液量和棉塞通氣程度對微生物的生長速度和生長量有很大的關(guān)系。此法一般也僅適宜培養(yǎng)兼性厭氧菌。 （3）搖瓶培養(yǎng) 即將三角瓶內(nèi)培養(yǎng)液用8層紗布包住瓶口，以取代一般的棉花塞，同時降低瓶內(nèi)的裝液量，把它放到往復(fù)式或旋轉(zhuǎn)式搖床上作有節(jié)奏的振蕩，以達(dá)到提高溶氧量的目的。 （4）臺式發(fā)酵罐體積一般為幾升至幾十升，并有多種自動控制和記錄裝置。 （3）搖瓶培養(yǎng) 即將三角瓶內(nèi)培養(yǎng)液用8層紗布包住瓶口，以取代一般的棉花塞，同時降低瓶內(nèi)的裝液量，把它放到往復(fù)式或旋轉(zhuǎn)式搖床上作有節(jié)奏的振蕩，以達(dá)到提高溶氧量的目的。 （4）臺式發(fā)酵罐體積一般為幾升至幾十升，并有多種自動控制和記錄裝置。氧

37、的性質(zhì)及發(fā)酵液中實(shí)際需氧量氧的性質(zhì)及發(fā)酵液中實(shí)際需氧量 難溶氣體，在25度和105 Pa時，氧在純水中的溶解度為0.25mol/m3 。 對于發(fā)酵液中每小時在1 m3 培養(yǎng)液中需要氧是溶解量的750倍。如果中斷供氧，菌體會在幾秒鐘內(nèi)耗盡溶氧。細(xì)胞對氧的需求細(xì)胞對氧的需求 氧作為受氫體 氧直接參與一些生物反應(yīng)微生物的吸氧量微生物的吸氧量 常用呼吸強(qiáng)度和耗氧速率表示。 呼吸強(qiáng)度：單位質(zhì)量的干菌體在單位時間內(nèi)所吸取的氧量，QO2 ，表示微生物的絕對耗氧量。 耗氧速率：單位體積培養(yǎng)液在單位時間內(nèi)的吸氧量，r。 二者關(guān)系：呼吸強(qiáng)度表示微生物的絕對吸氧量，但當(dāng)培養(yǎng)液中有固體成分存在時，測定困難。用耗氧速率

38、表示。 r= QO2 c(X) c(X) 發(fā)酵液中菌體的濃度 在培養(yǎng)過程中不需要使溶解氧濃度達(dá)到或接近飽和值，而只要超過某一臨界氧濃度即可。 當(dāng)不存在其他限制性基質(zhì)時，如果溶氧濃度高于臨界值，細(xì)胞的比耗氧速率保持恒定； 如果溶氧濃度低于臨界值，細(xì)胞的比耗氧速率大大下降，這時細(xì)胞處于半?yún)捬鯛顟B(tài)。臨界溶氧濃度臨界溶氧濃度 滿足微生物呼吸的最低氧濃度。在臨界氧濃度以下，微生物的呼吸速率隨溶解氧濃度降低而顯著下降。 好氧微生物臨界氧濃度大約是飽和濃度的1-25。發(fā)酵對溶解氧的影響發(fā)酵對溶解氧的影響 培養(yǎng)基的成分和濃度顯著影響耗氧。 菌齡 菌體的耗氧量 溶氧高發(fā)酵條件最適條件下發(fā)酵或排除有毒代謝產(chǎn)物培養(yǎng)

39、加有利于菌體的生長和產(chǎn)物合成，但溶氧太大有時反而抑制產(chǎn)物的形成。 需考查每一種發(fā)酵產(chǎn)物的臨界氧濃度和最適氧濃度。 最適溶氧濃度的大小與菌體和產(chǎn)物合成代謝的特性有關(guān)。供氧與微生物呼吸代謝的關(guān)系供氧與微生物呼吸代謝的關(guān)系 好氧微生物所含的氧化酶系：過氧化氫酶，細(xì)胞色素氧化酶，黃素脫氫酶，多酰氧化酶等。 不同好氧微生物所含的氧化酶系的種類和數(shù)量不面，在不同環(huán)境條件下，各種微生物的吸氧量或呼吸強(qiáng)度不同。對微生物供氧的傳遞過程對微生物供氧的傳遞過程 空氣中的氧(氧溶入液體的傳遞速度)液體中的溶氧(氧由液體至微生物的傳遞速度)微生物體內(nèi)的氧(氧的利用速度)產(chǎn)物 在氧的傳遞過程中液膜阻力是控制因素。 為了供

40、給微生物必需的氧量，必須注意發(fā)酵罐的類型及運(yùn)轉(zhuǎn)以維持所要求的Kla。一一 雙膜理論的基本前提雙膜理論的基本前提 （1）在氣泡與包圍著氣泡的液體之間存在著界面，在界面的氣泡一側(cè)存在著一層氣膜，在界面的液體一側(cè)存在著一層液膜。氣膜內(nèi)的氣體分子和液膜中的液體分子和液膜中的液體分子都處于層流狀態(tài)，分子間無對流運(yùn)動，因此氧的分子只能以擴(kuò)散方式，即籍濃度差而透過雙膜。 另外，氣泡內(nèi)除開氣膜以外的氣體分子，處于對流狀態(tài)，稱為氣體主流，在空氣主流空間的任一點(diǎn)，氧分子的濃度相同，液體主流中也是如此。 （2）在雙膜之間的界面上，氧氣的分壓強(qiáng)與溶于液體中的氧的濃度 （3）傳質(zhì)過程處于穩(wěn)定狀態(tài)，傳質(zhì)途徑上各點(diǎn)的氧的濃

41、度不隨時間而變。氧傳遞的動力和阻力氧傳遞的動力和阻力 在氧從氣泡傳遞到細(xì)胞內(nèi)要克服一系列的阻力，相對大小取決于流體力學(xué)特性、溫度、細(xì)胞活性和濃度、液體的組成、界面特性以及其他因素。 傳遞過程的總推動力是氣相與細(xì)胞內(nèi)的氧分壓之差。 氣液相間的氧傳遞阻力：氣膜和液膜中。 液固相間的氧傳遞：細(xì)胞或細(xì)胞周圍的液膜阻力可忽略。 在發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)上如何保證發(fā)酵中氧的供給，以滿足生產(chǎn)菌對氧的需求，是穩(wěn)定和提高生產(chǎn)、降低成本的關(guān)鍵之一。 在發(fā)酵中氧究竟夠不夠，即產(chǎn)量是否受到氧的限制，單憑通氣量大小是難于確定的。 了解通氣攪拌對發(fā)酵的影響，最簡便有效的辦法便是就地測量發(fā)酵液中氧的濃度。從氧濃度變化曲線可以看出氧供

42、需的規(guī)律及對生產(chǎn)的影響。 溶氧可作為發(fā)酵中氧是否足夠的度量，發(fā)酵異常情況的指示，發(fā)酵中間控制的手段之一和考查設(shè)備及工藝條件對氧供需與產(chǎn)物形成影響的指標(biāo)之一。氧在水中的溶解度氧在水中的溶解度 培養(yǎng)液中氧的溶解比水中還小，因?yàn)檠醯娜芙舛入S著溫度的升高而下降，隨著培養(yǎng)液固形物的增多，或粘度的增加而下降。 長期以來深層通風(fēng)培養(yǎng)普遍使用機(jī)械攪拌罐，由于罐的直徑與通風(fēng)管徑相差懸殊，故通入氣體的細(xì)碎與醪液的混合完全依靠機(jī)械攪拌作用。影響氧溶解效果的因素影響氧溶解效果的因素 發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)如高徑比 擋板安置情況 罐內(nèi)壓與發(fā)酵液深度 攪拌器型式 攪拌轉(zhuǎn)速 通風(fēng)量 培養(yǎng)基組成。 主要是攪拌轉(zhuǎn)速與通風(fēng)量。機(jī)械攪拌可以提高通風(fēng)效果機(jī)械攪拌可以提高通風(fēng)效果的原因的原因 攪拌將通入的空氣打碎成細(xì)泡，增加了氣液接觸面積 小氣泡從罐底上升到液面的速度要比大氣泡慢，這又使氣液接觸的時間增加 由于攪拌使液體形成湍流，使氣泡不是直線上升而是成螺旋線上升，延長了氣泡在液體中運(yùn)動的時間與路程 由于液體呈湍流運(yùn)動因而減少了氣泡周圍的液膜厚度，增加了氧擴(kuò)散到液體中的速度。發(fā)酵過程中溶解氧的變化發(fā)酵過程中溶解氧的變化 每種產(chǎn)物發(fā)酵的溶氧濃度變化都有自己的規(guī)律。 明顯下降：需氧量超過供氧量，使溶氧濃度明顯下降，出現(xiàn)一個低峰，產(chǎn)生菌的攝氧率同時出現(xiàn)高峰。發(fā)酵液中的菌濃也不斷上升。粘度一般在這個時期也會出現(xiàn)一高峰階段。這都說明產(chǎn)物