動物組織基因組DNA的分離純化及鑒定

1、動物組織基因組dna的分離純化及鑒定郝春霖（武漢大學藥學院，2009302590232）摘要：采用鹽溶法和有機溶劑抽捉分離純化豬肝基因組dna,并利用紫外吸收和二苯胺顯色 法進行核酸定量和純度測定。制備的樣品a260/a280值在1.8附近，純度較高。但由紫外吸收 法數(shù)據(jù)計算出樣品dna濃度遠大于二苯胺顯色法的計算結果，本文對數(shù)據(jù)差異做了相關討 論。abstract： the genomic dna of poker liver were isolated and purified by salting-in and organic agent extraction method in ord

2、er to determine the quantitative and to test the fineness of our sample, it has been reacted with diphenylamine to produce the color product and exposed to the uv to find its o.d value the a260/ a280 value of the sample is about 1.& which indicates itself highly purified. however, the data of th

3、e two different methods are so different that it confuses us. this essay discusses the differences deeply and analyzes the reasons for the results.關鍵詞：豬肝鹽溶法抽提基因組dna紫外吸收法二苯胺key words: poker liver salting-in method extract genomic dna uvpcx diphenylamine引言：制備組織基因組dna在基因結構和功能的研究屮扮演著重要角色，是分了生物學研究 屮最重要的實

4、驗操作技術之一，樣品分離純化的程度對后續(xù)實驗結構起到?jīng)Q定性作川；而不 同種類生物的基因組dna提収方法各界，同一生物的不同組織或器官也因莫細胞結構及成 分差異，而需采用不同的提取方法。通常要求所得到的dna片段長度應不小于100kb,在提 取過程中要盡可能排除可使dna斷裂和降解的各種物理、化學或生物因索，以保證樣品以 結構的完整。鹽溶法是制備基因紐dna的常規(guī)操作技術，在溶解細胞，核蛋白釋放后，根據(jù)dna 不溶于0.14mol/lnacl溶液而rna可溶的特性將dna核蛋口與rna核蛋白分離，得到粗 品。粗品中主要成分為dna和蛋白質，用酚/氯仿併戊醇進行抽提，可除去其中的蛋白質。 再加入一

5、定量的界丙醇或乙醇，較長的基因組dna分子將形成纖維狀絮團漂浮其中，而質 粒或細胞器屮的小分了 dna則只能形成顆粒狀沉淀物附著在容器壁或底部，用玻棒挑出纖 維狀絮團即可達到比鮫滿意的分離效果，得到純度較高的基因組dnac核酸中喋吟環(huán)和唏呢環(huán)的共軌雙鍵系統(tǒng)在260nm處冇最大吸收峰，故可采川紫外光吸 收法對樣品進行定最和純度測定。本文還利用二苯胺與核酸的顏色反應對樣品進行了定最測 定。1實驗部分1.1儀器與試劑722s型對見光光度計、紫外分光光度計、冷凍離心機、水浴鍋、燒杯、量簡、玻璃棒、三 角瓶、離心管、ep管等。sc緩沖液,5%sds溶液,95%乙醇、氯仿、異戊醇,固體氯化鈉等。1.2材料

6、新鮮豬肝1.3豬肝基因組dna的分離純化取新鮮豬肝4.0g,用sc緩沖液洗血，低溫剪碎后，加入s.omlsc溶液搗碎，將勻漿 裝入離心管，平衡后于4000r/min離心lomin,棄上層rna提取液；將下層加入sc溶液 5.0ml混勻、平衡后，再次于4000r/min離心lomin,棄上層；下層沉淀轉入三角瓶，加入 sc溶液20.0ml, 3mlsds溶液混勻，15ml氯仿/異戊醇混勻；再加入固體氯化鈉1.2g,邊 加邊混勻，充分震蕩30min；于4000r/min離心20min；取出離心管后可觀察到內容物分為 三層，取上層水相（dna溶于水相中），加入等體積氯仿/：片戊醇振蕩lomin,于4

7、000r/min 離心20min；取上清，加等體積95%冷乙醇，邊加邊向一個方向緩緩攪拌，町觀察到纖維狀 絮團逐漸纏繞在玻棒上。用玻棒挑出dna絮團，用少最95%乙醉淋洗一次麻，輕輕擠壓排 盡吸附的乙醇，將絮團裝入ep管，加lnilsc溶液封存。1.4紫外吸收法取1.3中樣品,加入lomlnaoh, 8000r/min離心5min,取上清進行稀釋,當稀釋比為 1： 10 和 1： 15 時，以 ddhzo 調零，測 a260>a280.1.5二苯胺顯色法按tab-1.5配制各號試管:試劑012345樣品1（1： 15）樣品2（1： 10）dna標準溶液（200u g/ml）/ml00.4

8、0.81.21.62.02.0ml樣液2.0ml樣液ddh?o/ml2.01.61.20.80.4000二苯胺溶液/ml4.04.04.04.04.04.04.04.0tab-1.5.1混勻后,于60°c水浴lh,冷卻后，測a595.2實驗結果與分析討論2.1實驗結呆紫外吸收法結果見tab-2.1.1項目樣液 1 （1： 15）樣液 2 （1： 10）o.d.2602.2652.998o.d.2801.2481.63826（/ 人2801.811.83tab-2.1.1二苯胺顯色法結果見tab-2.1.2試劑012345樣品1（1： 15）樣品2（1： 10）o.d.59500.12

9、20.2240.3210.4070.4780.1030.164tab-2.1.2由tab-2.1.2中笫0到5號管o.d.值結果，dna含量為橫坐標，光密度為縱坐標，繪制dna標準曲線如fig-2.1.1dna含量標準曲線s6sq00 111110100200300400500fig2.1.1dna 含量 pg山標準曲線作圖可知，樣液1和樣液2的dna含量分別為：65.25116.08 pg,樣液濃度分別為：32.63 u g/ml> 58.04 u g/ml.稀釋前原液濃度為：534.93 u g/ml, 10inl原液 共含 dna5349.3 p g.按紫外吸收法結果計算，樣液1和

10、樣液2的dna濃度分別為：113.25 n g/ml、149.9 u g/ml.稀釋前原液濃度為：1598.88 u g/ml, 10ml 原液共含 dna15988.8 u g. (10.d=50u g/ml)2. 2結果分析與討論2.2.1紫外吸收法與二苯胺顯色法結果差異分析紫外吸收法所得數(shù)據(jù)計算出dna原液濃度為1598.88 m g/ml,總量為15988.8 ug,而 二苯胺顯色法數(shù)據(jù)計算結果為，dna原液濃度534.93 u g/ml,總量5349.3 ug；示者僅為 前者的33.46%.原因分析如下：紫外吸收法利用dna溶液在260nm處有最大吸收峰的特性，對其進行定量測定。而

11、rna的最大吸收峰也在260nm處，故當樣品中混冇較多rna時，會干擾dna含雖的測定, 實際測定結果應該是dna和rna光吸收值的總和。dna在260nm與280nm處的吸光度比值為1.8, rna在260nm與280nm處的吸光度 比值在2.0以上，當樣品中存在rna時，a26(/ a28o會升咼。實驗中i從j個稀釋度的a260/ a28o 值均大于1.8, r稀釋度小的比值升高更多，表明樣品中含冇一定量的rnao紫外吸收法測定樣品dna含最時，樣品屮其他具有紫外吸收特性的物質也會影響測定 結果。蛋口質的紫外吸收峰在280nm處，其在260nm處的吸光度不到核酸的1/10,因此樣 晶中少量

12、存在的蛋口質對測定結果影響不大。另外，在采用紫外吸收法測定dna含量時，應固定ph值，否則結果也會受到相應影 響。在二苯胺顯色法屮，dna在酸性條件下加熱，其嚓吟堿與脫氧核糖間的糖廿鍵斷裂， 主成喋吟堿、2-脫氧核糖和脫氧嚅噪核井酸，其小2-脫氧核糖在酸性環(huán)境屮加熱脫水住成3 -嶷基酮皋戊糖，進而與二苯胺試劑產(chǎn)生藍色的顏色反應，rna卻不能在此條件下與二 苯胺試劑產(chǎn)生顏色反應，樣品中少量的rna并不影響測定。但蛋白質、多種糖類及其衍生 物、醛等可與二苯胺產(chǎn)生顏色反應，從而十擾dna的定量。木實驗中，二苯胺顯色法各錚 試劑配制時沒有特別造成酸性環(huán)境，冇可能使得顏色反應不充分，而使相應的實驗數(shù)據(jù)偏低。 2.2.2 dna含量標準曲線不過原點按照理論，dna含量的標準曲線應該是一條過原點的直線，但實驗所得標準曲線向y 軸正向偏移0.0247個單位，其原因可能是分光光度計的系統(tǒng)謀差，也可能是操作失謀引起