膽管細(xì)胞癌活檢組織T細(xì)胞的免疫組化檢測(cè)與分析

1、膽管細(xì)胞癌活檢組織t細(xì)胞的免疫組化檢測(cè)與分析崔彬1姜漢國(guó)21 .廣東省廉江市人民醫(yī)院病理科廣東廉江 5 2 4 40 0;2 .廣東醫(yī)學(xué)院病理教研室廣東東莞 5 2 3 0 0 0【摘要】目的探討cd 4 +cd2 9 +輔助性t細(xì)胞在肭管癌發(fā)病機(jī)制的 作用.方法收集1 6例膽管癌患者外周血及手術(shù)活檢標(biāo)木,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 外周血cd 4 +cd2 9 +t細(xì)胞及其胞內(nèi)腫瘤壞死因子α(tnf α及 γ干擾素(ifn γ)的百分含量;收集1 3例膽管炎患者作為對(duì)照.采 用免疫組化sp法檢測(cè)膽管組織內(nèi)cd 4及cd

2、2 9分子的表達(dá)含量，以及tnf- α及ifn γ的含量.結(jié)果與對(duì)照組比較，膽管癌患者外周血cd 4 + cd 2 9+t細(xì)胞的h分含量明顯升高(p= 0 . 0 1 6),但胞內(nèi)tnf α及ifn γ卻無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(分別為p= . 1 1 4及. 2 2 3 ).免疫組化顯示 膽管癌患者膽管組織內(nèi)cd 4、cd 2 9分子及tnf α表達(dá)含量均明顯高于 對(duì)照組(分別為 p= 0 . 0 0 2 , 0 . 0 0 6 及 0 . 0 2 1 ),但 ifn γ含 量卻明顯降

3、低(p=0. 0 1 3).結(jié)論cd4+cd2 9 +輔助性t細(xì)胞及其胞內(nèi) tnfα升高，而ifn γ降低，導(dǎo)致th 1 /th 2平衡向th 1傾斜，可能 是膽管癌的新型免疫機(jī)制.【關(guān)鍵詞】肌管癌；輔助性t細(xì)胞；免疫組化；流 式細(xì)胞術(shù)【中圖分類號(hào)】r3 9 2【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】b【文章編號(hào)】1 0 0 8 63 1 5 ( 2 0 1 5)1 2 0 5 94 0 1 膽管癌的發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前己知其與免疫存在重要關(guān)系.研究表明，輔助性t細(xì)胞的異常，導(dǎo)致抗原提呈過(guò)度致使腫瘤微環(huán)境破壞，最終導(dǎo)致正常細(xì)胞的 過(guò)度增值,是腫瘤的一個(gè)新機(jī)制1 .在輔助性t細(xì)胞

4、亞群當(dāng)中,cd4 +cd2 9 +t 細(xì)胞是相對(duì)獨(dú)特的，在部分腫瘤發(fā)病當(dāng)中起到重要角色2 .但目前尚無(wú)研究探 討該細(xì)胞在膽管癌患者的表達(dá)及其意義，這對(duì)進(jìn)一步闡明膽管癌的免疫機(jī)制是不 利的.木研宄從全身及腫瘤局部入手，探討該細(xì)胞在膽管癌患者外周血及癌組織的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)膽管癌患者該細(xì)胞數(shù)量增加，具體過(guò)程如下：1資料與方法1.1患者資料選取2 0 0 5至2 0 1 2年期間我院收治的膽管癌患者作為觀察對(duì)象，入選條件如下:經(jīng)手術(shù)切除標(biāo)本，經(jīng)he染色確診為膽管癌，近8周內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑等，最后共入選1 6例，男性1 0例，女 性6例，年齡（5 6.7 2 ± 13

5、.46 歲.選取同期行手術(shù)治療的1 3例膽 管炎患者作為對(duì)照組，其中男性8例，女性5例.經(jīng)檢驗(yàn)，兩組患者的性別構(gòu)成及年 齡均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.1.2 流式細(xì)胞術(shù)清晨采集以上對(duì)象的靜脈血約5 ml,使用 beckmancoultercell多色流式細(xì)胞儀，分別檢測(cè)cd 4及cd 2 9雙陽(yáng)性的t細(xì)胞所 占的百分比，從而代表cd4+cd2 9+t細(xì)胞的數(shù)量.使用dmi6 0 0 0 b熒光顯 微鏡（leica公司生產(chǎn)觀察并攝像,fitc的激發(fā)波長(zhǎng)為4 8 8 nm,tritc的激發(fā)波長(zhǎng) 為5 6 8 nm,用于圖像采集的顯微鏡物鏡為4 0倍油鏡，數(shù)值孔徑為1 . 3 .cd 4 工作濃度1:5 0，綠

6、色熒光;cd 2 9工作濃度1:10 0，紅色熒光;dapi核染，藍(lán)色 熒光，兩者共表達(dá)則表現(xiàn)為黃色熒光，定位方面以細(xì)胞質(zhì)為主.為定量分析兩種膠 質(zhì)瘤細(xì)胞系中cd 4及cd 2 9熒光強(qiáng)度，選擇細(xì)胞較為密集的區(qū)域，每高倍視野隨 機(jī)選取2 0個(gè)腫瘤細(xì)胞，利用leicaconfocalsoftware軟件分析焚光強(qiáng)度，分析焚光 強(qiáng)度所占視野平均強(qiáng)度的百分率，并ii重復(fù)觀察3次,以相對(duì)平均熒光強(qiáng)度作為該 蛋白的相對(duì)表達(dá)量（釆用百分?jǐn)?shù)表示）.1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理2 結(jié)果2. 1外周血流式細(xì)胞術(shù)與對(duì)照組比較，膽管癌患者外周血cd 4+ cd 2 9 + t細(xì)胞的百分含量明顯升高（p= 0.016 ），但

7、胞內(nèi)tnf α及ifn 一 γ卻無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（分別為p= 0 . 1 1 4及0. 2 2 3,表1左側(cè)，圖a及 b）.2. 2 免疫組化本研究的1 6例患者當(dāng)中有1 1例為高分化腺癌,he染 色見(jiàn)癌組織均在管壁內(nèi)浸潤(rùn)生長(zhǎng)，環(huán)繞整個(gè)管壁;浸潤(rùn)的癌組織呈大小不等，形狀 不規(guī)則的腺體結(jié)構(gòu)，部分可擴(kuò)大呈囊腔.低分化腺癌3例:鏡下可見(jiàn)癌組織部分呈 腺體結(jié)構(gòu)，部分為不規(guī)則的實(shí)性片塊，亦在管壁內(nèi)彌漫浸潤(rùn)生長(zhǎng).經(jīng)免疫組化檢測(cè)， 發(fā)現(xiàn)最具特異性的cd 2 9分子呈褐色，多表達(dá)于膽管壁.經(jīng)t檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)膽管癌患 者膽管組織內(nèi)cd 4、cd 2 9分子及tnf &al

8、pha;表達(dá)含量均明顯高于對(duì)照組(分 別為 p= 0 . 0 0 2 , 0 . 0 0 6 及 0 . 0 2 1 ),但 ifn γ含量卻明顯 降低(p= 0 0 13,).3 討論本研究的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較，膽管癌患者外周血cd4+cd 2 9 +t細(xì)胞的百分含量明顯升高,但胞內(nèi)tnf α及ifn γ卻無(wú)統(tǒng) 計(jì)學(xué)差異.免疫組化顯示膽管癌患者膽管組織內(nèi)cd 4、cd 2 9分子及tnf α表達(dá)含量均明顯高于對(duì)照組，但ifn γ含量卻明顯降低.以上初步 說(shuō)明,cd4 +cd2 9

9、 +t細(xì)胞在膽管癌發(fā)表起到重要作用,以下就該問(wèn)題進(jìn)行討 論.t細(xì)胞是一-群表面表達(dá)cd3分子的淋巴細(xì)胞,大致可以分為cd4 +輔助性(th> 及cd 8+殺傷性(tc)兩個(gè)大的t細(xì)胞亞群.其中th可分為thl及th2兩個(gè)亞群, 并ii兩者構(gòu)成th 1 /th 2平衡，其中th 1細(xì)胞以分泌il 2及ifn γ為特 征,主要支配機(jī)體的細(xì)胞免疫;而th 2細(xì)胞以分泌tnf α及il 4等細(xì)胞因 子為特征，主要支配機(jī)體的體液免疫=;己有研究發(fā)現(xiàn)th 1 /th 2與多種腫瘤相關(guān), 包括肺癌、肝癌、子宮頸癌等,但對(duì)于膽管癌患者,cd 4+cd 2 9+t細(xì)

10、胞究竟起 到何種作用目前尚不明確,更不清楚膽管癌患者cd 4 +cd 2 9 +t細(xì)胞的異常對(duì) th 1/th 2平衡的失調(diào).本研究發(fā)現(xiàn)，膽管癌患者外周血cd 4+cd 2 9+t細(xì)胞的 百分含量明顯高于對(duì)照組,但胞內(nèi)tnf α及ifn γ卻無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異, 這說(shuō)明對(duì)于全身免疫(外周血),cd 4 +cd2 9 +t細(xì)胞的改變最為明顯對(duì)腫瘤 診斷有一定的意義.更具有臨床價(jià)值的現(xiàn)象是:在癌組織內(nèi),cd 4、cd 2 9分子及 tnf α表達(dá)含量均明顯高于對(duì)照組，這進(jìn)一步印證了 cd4 +cd2 9 +t細(xì) 胞是膽管癌的一個(gè)負(fù)面指標(biāo)，可能與

11、膽管癌的發(fā)生及加重有關(guān).至于膽管癌患者 ifn γ下降，說(shuō)明ifn γ可能是一個(gè)抗腫瘤作用，起到 正面作用.由于ifn γ屬于th 1類細(xì)胞因子/tnf α屬于th 2細(xì)胞因子，今發(fā)現(xiàn)膽管癌患者ifn γ降低;tnfα升高，導(dǎo)致th 1 /th 2比 值下降，是膽管癌的一個(gè)重要特征.通過(guò)cd4+cd2 9+輔助性t細(xì)胞及其胞 內(nèi)tnf α升高，而ifn γ降低，導(dǎo)致th 1 /th 2平衡向th 2傾斜，可 能是膽管癌的新型免疫機(jī)制，這對(duì)于膽管癌的診斷具有重要價(jià)值.參考文獻(xiàn)1 詹茜,沈柏用，施源，等.si 0 0a9與cct在膽管癌中的表達(dá)及其意義.外科 理論與實(shí)踐201 1,16(6)