采用代謝組學(xué)策略探究佛手散對(duì)急性血瘀大鼠活血化瘀作用機(jī)制

1、采用代謝組學(xué)策略探究佛手散對(duì)急性血瘀大鼠活血化瘀作用機(jī)制摘要采用冰水浴游泳和皮下注射鹽酸腎上腺 素法復(fù)制急性血瘀大鼠模型。采用uplc-q-tof/ms方法分析 正常大鼠、急性血瘀大鼠和給藥佛手散干預(yù)急性血瘀大鼠尿 液之間的內(nèi)源性代謝物差異，并通過(guò)變量重要性投影選取潛 在的生物標(biāo)志物，結(jié)合質(zhì)譜信息和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索對(duì)潛在的生物 標(biāo)志物進(jìn)行鑒定，將鑒定到的生物標(biāo)志物輸入metpa數(shù)據(jù)庫(kù) 中構(gòu)建代謝通路。研究急性血瘀大鼠給藥佛手散后大鼠尿液 內(nèi)源性代謝物變化，尋找可能的生物標(biāo)志物，探討佛手散的 活血化瘀作用機(jī)制。結(jié)果在急性血瘀大鼠尿液中發(fā)現(xiàn)并鑒定 了 11個(gè)潛在的生物標(biāo)志物，這些標(biāo)志物主要和苯丙氨酸代

2、謝、色氨酸代謝和鞘脂類(lèi)代謝3條代謝通路相關(guān)。而佛手散 可調(diào)節(jié)急性血瘀模型大鼠體內(nèi)紊亂的代謝通路并使其向正 常狀態(tài)轉(zhuǎn)歸。該研究結(jié)果表明代謝組學(xué)在中藥整體性藥效評(píng) 價(jià)、作用機(jī)制的闡明等方面具有很好的應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞uplc-q-tof/ms；佛手散；代謝組；急性血瘀; 活血化瘀佛手散出自宋許叔微普濟(jì)本事方，為養(yǎng)血活血之 劑，由當(dāng)歸6兩、川葦4兩組成，每服2錢(qián)，水一小盞，煎 至將干，投酒一大盞，止一沸，去渣溫服，主治妊娠傷胎、 難產(chǎn)、胞衣不下等。該方在臨床主要用于婦女調(diào)經(jīng)及心腦血 管疾病等。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，佛手散對(duì)急性血瘀大鼠 的血液流變學(xué)和凝血功能相關(guān)指標(biāo)有顯著的改善作用1 o 但其作用機(jī)制

3、尚不明確，而代謝組學(xué)作為后基因組時(shí)代的一 種全新的組學(xué)技術(shù)，它從整體觀出發(fā)，通過(guò)考察由病理生理 刺激或遺傳修飾引起的生物體內(nèi)源性低分子量代謝產(chǎn)物的 動(dòng)態(tài)規(guī)律變化或其隨時(shí)間的變化，來(lái)研究整體的生物學(xué)狀況2。代謝組學(xué)最顯著的特點(diǎn)在于拋開(kāi)體內(nèi)紛繁復(fù)雜的生理 過(guò)程，選擇機(jī)體終端代謝產(chǎn)物“自上而下”進(jìn)行分析，與中 藥研究的整體觀思維較為一致3。本研究以佛手散和鹽酸 腎上腺素加冰浴游泳誘導(dǎo)的急性血瘀大鼠模型為研究對(duì)象， 采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（uplc-q-tof/ms）技術(shù)，分析急性血瘀大鼠模型的代謝表 型變化及給予佛手散后對(duì)急性血瘀大鼠的作用機(jī)制，探討代 謝組學(xué)在動(dòng)物模型復(fù)制和中藥

4、藥效研究中的應(yīng)用。1材料1. 1儀器與試劑 美國(guó)waters uplc acquitytm系統(tǒng)； behc18 色譜柱（2. 1mm x 50 mm, 1.7 um）； synapttm q-tof 質(zhì)譜儀，配有l(wèi)ock-spray接口，esi離子源和masslynx 4. 1 質(zhì)譜工作站軟件。鹽酸腎上腺素注射液（天津金耀氨基酸有 限公司，批號(hào)1003121）；疊氮鈉（nan3,分析純，天津市福 晨化學(xué)試劑廠）；肝素鈉注射液（常州千紅生化制藥股份有 限公司，批號(hào)100731）；乙睛和甲酸為色譜純?cè)噭绹?guó) fisher公司）；亮氨酸-腦啡肽（美國(guó)sigma公司）；純凈水 由南京易普易達(dá)純水儀制

5、得。其他試劑均為分析純。1.2動(dòng)物spf級(jí)sd大鼠，雌性，體重（200 ± 20） g, 由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)scxk （滬）2008-0016o1. 3藥材及樣品制備 當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸angelica sinensis （oliv. ） diels的干燥根，來(lái)源于甘肅岷縣當(dāng)歸 gap種植基地；川葦為傘形科植物川 ligusticum chuanxiong hort.的干燥根莖，來(lái)源于四川彭州川葦gap種 植基地，并經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)輝副教授鑒定。按佛手散中 當(dāng)歸與川葦?shù)谋壤?： 2）稱(chēng)取藥材飲片，混合，共500 go 用8倍量的水進(jìn)行熱回流提取兩次

6、，每次均為2 h,自然冷 卻后，傾出水溶液，過(guò)濾。藥渣再用95%乙醇進(jìn)行熱回流提 取2 h,自然冷卻后，傾出乙醇水溶液，過(guò)濾藥渣，與水提 液合并，進(jìn)行真空減壓濃縮，干燥至浸膏，得制備樣品。2方法2. 1急性血瘀模型的復(fù)制大鼠皮下注射鹽酸腎上腺素 注射液0.8 mgkgl共2次，間隔時(shí)間為4 h。第1次皮下 給予鹽酸腎上腺素后2 h,將大鼠置于02 °c冰水中游泳4 min,造成大鼠急性血瘀模型4。2.2動(dòng)物分組及給藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按體重隨機(jī)分為3組，每組9只，分別為正常組（control）,模型組（model）和佛手散組（fss）o佛手散給藥劑量為臨床等效量的6倍量（5. 4 g生藥/kg

7、大鼠體重）。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前各組動(dòng)物自由飼養(yǎng)一周， 然后置代謝籠中自由飼養(yǎng)適應(yīng)3 do佛手散組大鼠每日早晚各灌胃1次，共7次，正常組和模型組大鼠灌胃給予等量的 生理鹽水。在造模過(guò)程中，正常組大鼠亦皮下注射等量生理 鹽水。模型組和佛手散大鼠于實(shí)驗(yàn)的第3天按照2. 1項(xiàng)下方 法造模。2.3尿液樣品收集與處理實(shí)驗(yàn)第3天模型組和佛手散 組大鼠最后一次注射鹽酸腎上腺素后，連同正常組大鼠禁食 不禁水，收集尿液12 h,接尿管中加1 ml l%nan3作為抑菌 劑和防腐劑。收集的尿液于4 °c離心機(jī)3 000 r - mini離心10 min,取上清2 ml置冷凍管中，浸入液氮罐中進(jìn)行快速 淬滅，然后撈

8、出冷凍（-20 °c）保存待測(cè)。分析前將冷凍尿 液樣品于室溫解凍，解凍后樣品于4 £離心機(jī)13 000 r mini離心10 min,取上清500 u l,加甲醇500 u l, 渦旋振蕩30 s,靜置10 min,于4 °c離心機(jī)13 000 r - mini離心10 min,取上清液進(jìn)樣檢測(cè)。2. 4色譜和質(zhì)譜條件色譜條件：流動(dòng)相a為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相b為0. 1%甲酸乙月青溶液。梯度洗脫：05 min, 10%30%b； 58 min, 30%50%b； 810min, 50%60%b；1013 min, 60%90%b。柱溫 35 °c,

9、流速 0. 4 ml - mini, 進(jìn)樣量5 ulo質(zhì)譜條件：毛細(xì)管電壓3.0 kv,離子源溫度 120 °c,脫溶劑氣溫度350 °c,錐孔電壓45 v,離子能量 1. 0 v。錐孔氣流量50 lhl,脫溶劑流量600 lhl,在 碰撞能量為4 ev情況下，掃描時(shí)間為0.5 s,間隔掃描時(shí)間 為0. 02 s ；準(zhǔn)確質(zhì)量測(cè)定采用亮氨酸-腦啡肽(leucine-enkephalin, esi+： m/z 556.277 1, esi-： m/z 555. 261 5)溶液為鎖定質(zhì)量溶液；掃描范圍m/z501 000, 以centriod模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。2. 5代謝組學(xué)數(shù)

10、據(jù)處理和分析 樣品經(jīng)waters公司的uplc-q-t0f/ms分析，得 到代謝指紋輪廓圖譜。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用waters公司的masslynx 軟件v4. 1進(jìn)行色譜峰提取、峰對(duì)齊及歸一化等處理。主要 參數(shù)包括：保留時(shí)間014 min；質(zhì)荷比m/z 1001 000(±0.01 da),峰強(qiáng)度閾值50,質(zhì)量窗口 0.05 da,保留時(shí) 間窗口 0. 20 min,自動(dòng)檢測(cè)5%峰高及噪聲。在進(jìn)行多元變 量分析前要對(duì)每個(gè)檢測(cè)峰的離子強(qiáng)度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，即對(duì)原始 變量進(jìn)行pareto標(biāo)尺化處理，然后利用markerlynx軟件對(duì) 峰面積、樣品名稱(chēng)和離子強(qiáng)度組成的數(shù)據(jù)表進(jìn)行分析。將處 理后的數(shù)據(jù)按

11、照參考文獻(xiàn)要求5進(jìn)行外源性成分?jǐn)?shù)據(jù)的剔 除，然后將剔除后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入ezinfo 2.0進(jìn)行有監(jiān)督的偏 最小二乘判別法(pls-da)進(jìn)行分析。相應(yīng)的參數(shù)(r2y, q2)等用以考察模型的有效性，r2y表示pls-da模型建模過(guò) 程中所能解釋的變量數(shù)據(jù)的比例，r2表示模型的擬合度，q2 表示模型的可預(yù)測(cè)度，它們的大小直接反映了該模型的可靠 程度。使用spss 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，2組間比較采 用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)志性代謝物組間差異的顯著性。顯著性標(biāo) 準(zhǔn)界值定為p1且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量被認(rèn)為對(duì)模型有顯 著貢獻(xiàn)。3組間差異方向上，距離中心越遠(yuǎn)的點(diǎn)對(duì)差異的貢 獻(xiàn)度越大，越有可能是潛在的特征代謝物

12、。潛在的生物標(biāo)志物根據(jù)其串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，在公共數(shù)據(jù)庫(kù) hmdb ( http : /www. hmdb. ca/ ) , metlin ( http : /www.metlin. scippsedu/ ), kegg ( http :/www. genome jp/kegg/), smpd (http： /wvw. smpdb ca/) 中進(jìn)行檢索和確認(rèn)，并與文獻(xiàn)進(jìn)行比較.共鑒定出11個(gè)潛在 的生物標(biāo)志物，見(jiàn)表lo與正常組比較，模型組大鼠尿液中 的山梨醇(sorbitol)、琥珀酸(succinic acid)、肌酸 (creatine)、苯丙酮酸(phenylpyruvic acid)、苯乙酸

13、 (phenylacetic acid)和精胺(spermine)的含量升高;精瞇(spermidine ) > l-色氨酸(l-tryptophan )、色胺 (tryptamine)> 氨基己二酸(aminoadipic acid)和二氫 鞘氨醇(sphinganine)的含量降低。給藥佛手散后，這些 標(biāo)志物的水平均向正常狀態(tài)變化。說(shuō)明了佛手散對(duì)急性血瘀 大鼠代謝的調(diào)節(jié)作用。3.3代謝通路分析將表1中鑒定出的標(biāo)志物輸入metpahttp:/metpa. metabolomics. ca. /metpa/faces/home. jsp ) 數(shù)據(jù) 庫(kù)中，構(gòu)建分析代謝通路。代謝通路影

14、響值的臨界值設(shè)置為 0. 10,高于這個(gè)值，將會(huì)被選擇作為潛在的靶標(biāo)路徑。見(jiàn)圖 4,由鹽酸腎上腺素和冰水游泳聯(lián)合誘導(dǎo)的急性血瘀大鼠代 謝紊亂主要與苯丙氨酸代謝(phenylalanine metabolism)、 色氨酸代謝(tryptophan metabolism )和鞘脂類(lèi)代謝 (sphingolipid metabolism) 3條代謝通路相關(guān)。在佛手散 用藥組中，代謝物的含量得到回調(diào)，代謝通路的紊亂得到改 善，在代謝層面驗(yàn)證了佛手散對(duì)由鹽酸腎上腺素和冰水游泳 聯(lián)合誘導(dǎo)的急性血瘀大鼠有較好的治療作用。佛手散主要是 通過(guò)對(duì)上述3條代謝通路的調(diào)節(jié)來(lái)發(fā)揮活血化瘀功效的。鑒定到的11個(gè)標(biāo)志物中

15、，苯丙酮酸和苯乙酸主要參與 苯丙氨酸代謝；l-色氨酸和色胺主要參與色氨酸代謝；二氫 鞘氨醇主要參與鞘脂類(lèi)代謝；肌酸、精瞇和精胺主要參與精 氨酸和脯氨酸代謝；山梨醇主要參與果糖和甘露糖代謝；琥 珀酸主要參與檸檬酸循環(huán)；精腓和精胺還主要參與谷胱甘肽 代謝和丙氨酸代謝。4討論血瘀時(shí)出現(xiàn)血黏度升高的現(xiàn)象，其主要作用因素是腎功 能的異常導(dǎo)致許多活性物質(zhì)直接作用于血管，如腎素-血管 緊張素系統(tǒng)可直接收縮血管，同時(shí)刺激腎上腺素能神經(jīng)釋放 去甲腎上腺素和腎上腺素均能收縮血管，引起血黏度的升 高。血管平滑肌細(xì)胞膜增加了對(duì)鈣離子的通透性，使細(xì)胞內(nèi) 鈣離子增加，進(jìn)而增強(qiáng)了血管平滑肌興奮-收縮耦聯(lián)，增加 血管收縮和痙

16、攣而使血液黏度升高，造成血瘀6-7 o 苯丙氨酸是一種人體所必需的芳香族氨基酸，在正常情況 下，除作為氨基酸合成機(jī)體組織細(xì)胞各種蛋白之外，主要在 肝臟等組織經(jīng)代謝生成酪氨酸，進(jìn)而在神經(jīng)系統(tǒng)和腎上腺髓 質(zhì)合成某些激素、神經(jīng)遞質(zhì)如多巴胺、腎上腺素和去甲腎上 腺素等8-9 o因此，機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育和正常生理機(jī)能的維 持需要穩(wěn)定的苯丙氨酸代謝狀態(tài)。研究表明，肝腎疾病、遺 傳、免疫、神經(jīng)體液等多種因素可引起苯丙氨酸代謝失調(diào)， 導(dǎo)致苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為酪氨酸受阻，引起血中苯丙氨酸濃度過(guò) 高或苯丙氨酸/酪氨酸比值升高10-12 o在血瘀狀態(tài)下，由 于酪氨酸軽化酶和多巴胺-b -釋化酶2種合成限速酶的大量 表達(dá)使得兒

17、茶酚胺生成增加，而腎上腺素和去甲腎上腺素合 成增加導(dǎo)致血管收縮，進(jìn)而使血黏度升高造成血瘀。表1結(jié) 果也顯示，當(dāng)大鼠血瘀時(shí)，苯丙氨酸的代謝通路受到阻礙， 更多的苯丙氨酸隨尿液排出體外，與文獻(xiàn)結(jié)果一致13 o色氨酸作為機(jī)體的必須氨基酸之一，是蛋白質(zhì)生物合成 的基礎(chǔ)，生物體自身不能合成，需要從食物中攝取以滿(mǎn)足自 身的需要，在維持氮平衡、肌肉質(zhì)量和體重等方面具有重要 作用。它參與多條代謝通路，是神經(jīng)遞質(zhì)5-密色胺合成的前 體，色氨酸代謝涉及許多不同的生理、病理過(guò)程14-15 o5-龕色胺是體內(nèi)重要的信使和神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，也是血小板凝 血因子和神經(jīng)激素，它具有很強(qiáng)的收縮血管作用16,與存 在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)

18、的5-ht1受體結(jié)合，可使血管阻力減少， 血壓下降；與分布在外周血管平滑肌上的5-ht2受體結(jié)合后, 使血管收縮，血壓上升，還能增強(qiáng)縮血管物質(zhì)的縮血管作用17。由于體內(nèi)血瘀的形成，造成主要參與色氨酸代謝的l- 色氨酸和色胺含量在急性血瘀模型大鼠尿液中降低。鞘脂類(lèi)（鞘胺醇和植物鞘胺醇）是真核細(xì)胞膜上普遍存 在的成分。鞘胺醇在體內(nèi)鞘胺醇激酶1和鞘胺醇激酶2催化 下被磷酸化產(chǎn)生鞘胺醇-1-磷酸，后者是一種有力的信號(hào)脂 類(lèi)分子。鞘脂的代謝物如神經(jīng)酰胺、鞘胺醇和鞘胺醇-1-磷 酸，均為信號(hào)脂類(lèi)分子，參與多種細(xì)胞過(guò)程。脫氫鞘胺醇在 煙酰胺腺嚓吟二核昔酸磷酸（nadph）的作用下還原為二氫 鞘胺醇，后者再被

19、黃素腺嗥吟二核昔酸（fad）氧化為鞘胺 醇：18 o二氫鞘胺醇含量的降低可能是由于血瘀狀態(tài)下增加 了鞘磷脂類(lèi)的消耗，因?yàn)榍柿字?lèi)和鞘胺醇的磷酸鹽在血管 成熟、血虛、癌癥的病理生理、傷口愈合和動(dòng)脈粥樣硬化等 方面具有重要的作用19。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，急性血瘀大鼠尿液代謝譜發(fā)生了明顯變 化。佛手散可明顯改善急性血瘀大鼠體內(nèi)的代謝異常。研究 提示，代謝組學(xué)可在中藥的整體性藥效評(píng)價(jià)、作用機(jī)制的闡 明等研究發(fā)揮積極的作用。參考文獻(xiàn)1李偉霞，唐于平，郭建明，等.比較評(píng)價(jià)當(dāng)歸 川葦配伍對(duì)急性血瘀大鼠血液流變學(xué)及凝血功能的影響j. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012,32(6)：807.2 nicholson j k

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