直接從細胞培養(yǎng)上清液中簡單高效固定胞外組氨酸標記的酶作為有活性的

1、蛋白質(zhì)純化翻譯 姓名：楊峰 學號：102061413 班級：釀酒1401直接從細胞培養(yǎng)上清液中簡單高效固定胞外組氨酸標記的酶作為有活性的,可回收的納米催化劑:高性能的從廢油脂中生產(chǎn)生物柴油 新加坡國立大學化學與生物分子工程 摘要:一種不需要酶的預純化的簡單固定胞外酶方法取得了很大發(fā)展. 固定胞外His標記的脂肪酶（His-TLL）的親和力是通過用巴氏畢赤酵母（h-TLL）的細胞培養(yǎng)上清液直接處理包含長臂鎳 - 次氮基三乙酸表面基團（Ni-NTA-MNP）的核 - 殼結構的氧化鐵磁性納米顆粒.讓酶有高活性,專一性和高效的催化效率.用納米生物催化劑His-TLL-MNPs催化一罐廢油脂轉(zhuǎn)化為生物柴

2、油的轉(zhuǎn)化效率為94%,顯示出優(yōu)越的回收性能. Ni-NTA-MNPs容易從循環(huán)到生物催化劑中再生并且可以反復用于酶的固定.通過從P. pastoris (h-CALB)細胞培養(yǎng)上清液中固定胞外His標記的南極洲假絲酵母脂肪酶B(His-CALB)證明這種方法是通用的.關鍵詞:酶的固定 胞外酶 磁性納米顆粒 油脂 生物柴油 脂肪酶 酶催化作用以及成為可持續(xù)生產(chǎn)化學產(chǎn)品和聚合物的重要綠色工具.固定化酶可以提高穩(wěn)定性并且通過酶的回收降低酶的成本.因此,越來越多的固定化技術發(fā)展起來了.其中,把酶固定在功能性的磁性納米顆粒上作為納米生物催化劑吸引了很多注意,因為磁性納米顆粒獨一無二的性能,比如表面積與體

3、積比很大,高分散性且傳質(zhì)限制較小,容易進行磁分離.目前,大多數(shù)固定化酶方法都要求預純化,但這個過程都很貴而且低效.對于胞外酶來說,這個操作更加困難,因為表達的胞外酶在細胞培養(yǎng)液中的濃度很低.因此,開發(fā)從細胞培養(yǎng)液上清液直接固定胞外酶而不進行預純化的簡單有效方法是十分必要的.因此,我們要報道的方法是,先用組氨酸標記物標記目標胞外酶,然后用表面含有Ni-NTA的MNPs作為載體,通過親和力直接從細胞培養(yǎng)液上清液高度特異性的吸附組氨酸標記過的胞外酶.所得到的納米生物催化劑是有活性和可回收的,并且Ni-NTA-MNPs可以直接從用過的納米生物催化劑中再生. TLL被選中作為目標胞外酶去證實簡單固定方法

4、和實際應用中的固定化酶.已知TLL能催化植物油和甲醇的脂交換用于生產(chǎn)生物柴油,一種清潔的和可再生的取代石油的柴油.然而植物油是可以食用的而且貴.最近,廢油脂已經(jīng)成為生產(chǎn)生物柴油的有吸引力的原料,因為它不可食用而且廉價.由于廢油脂的高游離脂肪酸,常規(guī)的堿催化過程不再適用了.涉及FFA的酸催化脂化和隨后的甘油三脂的堿催化酯交換的兩步法失效了.為了高效的將廢油脂轉(zhuǎn)化成生物柴油,我們不斷努力的開發(fā)一種一步式酯化和酯交換工藝.固定化的脂肪酶被證明是適合這個轉(zhuǎn)化過程的.然而酶純化的要求已經(jīng)變成了一個阻礙發(fā)展合算的酶固定方法和廢油脂轉(zhuǎn)化為生物柴油技術的瓶頸.圖像一: 從細胞培養(yǎng)液上清液直接固定胞外酶到納米磁

5、性顆粒上, 用納米生物催化劑的生物轉(zhuǎn)化和再循環(huán)以及從使用的催化劑再生Ni-NTA-MNP。圖像二:a細胞生長，蛋白質(zhì)分泌和酶活性.補料分批培養(yǎng)期間巴氏畢赤酵母（h-TLL）在生物反應器中的細胞密度（），體積活性（）和蛋白質(zhì)濃度（）。箭頭表示用于蛋白質(zhì)誘導的甲醇的連續(xù)進料的起始時間點。 （b，c）使用Ni-NTA-MNP以不同比例（w / w）的MNP與總蛋白（His-TLL：60）從室溫和pH 5.5的培養(yǎng)物上清液同時純化和固定His-TLL的關鍵性能參數(shù): （b）特異性酶負載量（）和酶加載效率（），（c）比活性（）和總活性回收率（）。數(shù)據(jù)是來著三分實驗的具有偏差的平均值. （d）His-TL

6、LMNPs的FESEM圖像。 為了證明固定化方法,通過方案1中所示的途徑合成Ni-NTA-MNPs.根據(jù)公開的方法,合成含有氧化鐵核和甲基丙烯酸縮水甘油酯殼的PGMAMNP,然后用長鏈二胺官能化得到TDA_MNP.將長臂引入MNP的表面上是為了提供更多的空間和靈活性.以讓酶被附著時仍能保持活性,然后引入醛基形成GA_MNPS,與N-雙（羧甲基）-L-賴氨酸水合物和隨后的氯化鎳的進一步反應把PGMAMNP變成Ni-NTA-MNP, 產(chǎn)率為83%.通過TEM,FESEM和DLS表征得到在每個步驟中合成的MNP的尺寸和形態(tài).所有MNPs顯示球殼結構和窄分散性。通過工程化包含pPICZA-His-TL

7、L質(zhì)粒的巴斯德畢赤酵母（h-TLL）和在生物反應器中高細胞密度培養(yǎng)產(chǎn)生胞外His標記的脂肪酶（His-TLL）.如圖2a所示, 細胞在第一個13.5小時處于滯后期，之后達到對數(shù)期，在23小時細胞密度到達25g cdw / L. 在該點，觀察到DO值的突然升高, 這意味著作為碳源的甘油受到了限制. 通過在23小時加入甲醇開始蛋白質(zhì)誘導, 導致蛋白質(zhì)濃度和培養(yǎng)上清液活性逐漸增加。誘導13小時后,單位體積的活性開始以一個恒定且很大的比列增加. 在發(fā)酵結束時（67h）,單位體積的活性達到2.47 U/mL, 蛋白質(zhì)濃度為0.6 mg/mL,細胞密度為73.3 gcdw/L. 在不同時間點取得的細胞培養(yǎng)

8、物上清液的SDS-PAGE（圖S7）顯示誘導后His-TLL（在35kDa處）的表達水平的明顯上升,在67小時時細胞培養(yǎng)液上清液中形成了很多His-TLL.從一小部分67小時細胞培養(yǎng)上清液中純化出來的His-TLL,可推導出His-TLL的表達水平占總細胞外蛋白的60.方案一: 合成Ni-NTA-MNPs和制備納米催化劑His-TLL-MNPs的路線 在無法通過His標簽和Ni-NTA功能之間的親和性來選擇性固定His-TLL之后，將Ni-NTA-MNP加入到培養(yǎng)了67小時的培養(yǎng)物上清液中. 在不同條件下進行固定，并通過固定前后上清液中的His-TLL含量計算酶負載效率。讓培養(yǎng)物上清液中的MN

9、Ps與總蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為12：1,然后觀查 2-8小時, 沒有觀察到對固定存在顯著影響。顯然，由于高親和力,2小時的孵育時間足以完成固定.我們也研究了溫度的影響. 當溫度從4升至25時，特異性酶負載從27.9mg / g至43.5mg / g,酶負載效率從53增加至89（圖S4）。當溫度從25進一步增加到35,兩種性能參數(shù)的增加程度小了很多. 因此，我們選擇室溫來進行后面的固定實驗。在室溫下,在2小時內(nèi)觀察不同質(zhì)量比的MNPs和總蛋白質(zhì)對固定化的影響。如圖2b，c所示，當MNPs和總蛋白質(zhì)的比例從8:1增加至14:1時,特定酶負載幾乎線性地從54降低至38mg / g MNP，而酶負載效率從7

10、5線性增加至95. 因為更多的顆粒被使用了。當比率從8:1至12:1的增加,通過用p-NPB測定5分鐘固定化酶的活性,發(fā)現(xiàn)酶活從6.8 U / mg幾乎線性地增加至8.3 U / mg. 而且總酶活性的回收率從71提高至106. 略高于100的活性回收率可能是由于固定后酶活性的輕微增加。MNPs與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比從12:1至14:1的進一步增加沒有進一步提高酶活性回收率和酶的活性。由兩個關鍵性能的參數(shù)表現(xiàn)。MNPs與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為12：1似乎是合適的. 這些固定化實驗在pH5.5下進行，并在該pH下培養(yǎng)細胞。檢查其它pH值下固定化表現(xiàn).。將細胞培養(yǎng)上清液調(diào)節(jié)至pH8.0，讓MNPs與蛋白質(zhì)的比

11、例為8：1在室溫下固定2小時. 在這種條件下特定酶負載達到了61mg / g MNP，酶負載效率為84，His-TLL的酶活性為8.3U / mg和酶活性回收率是百分之百（表S1）. 與pH 5.5相比，這些關鍵性能參數(shù)更好?？紤]在較少MNP和中性pH條件下的優(yōu)點，選擇質(zhì)量比為8：1（w / w）的MNP與蛋白質(zhì)和8.0的pH作為酶固定的最佳條件.培養(yǎng)物上清液從1毫升放大至10毫升. 結果62mg / g特定酶負載為 MNP，酶負載效率85，His-TLL,比活性為8.2U / mg和活性回收率為100（表S1）。這些關鍵性能指標幾乎與1 mL規(guī)模中獲得的相同，這證明了使用該方法進行大規(guī)模酶固

12、定化的適用性。通過FESEM來分析His-TLL-MNPs納米載體。如圖2d所示，His-TLL-MNP是直徑為80nm的均勻球形顆粒，其略大于Ni-NTA-MNP（63nm，通過TEM）。在His-TLL-MNPs和Ni-NTA-MNP（圖S5）的FTIR光譜中，表面上的NTA基團在3400cm -1（OH）處具有特征寬吸收，在1725cm -1 C=O有強吸收帶）.用SDS-PAGE（圖S7）來確認Ni-NTA-MNP是否選擇性固定His-TLL。固定化后，上清液在35kDa處的蛋白條帶顯著降低。用10mM咪唑洗滌納米生物催化劑His-TLL-MNP，沒有洗掉蛋白質(zhì)。用250mM咪唑進一步

13、洗滌納米生物催化劑.His-TLL在洗脫的SDSPAGE中產(chǎn)生35kDa的蛋白質(zhì)單條帶。這表明只有His-TLL連接在Ni-NTA-MNP上圖3.（a）通過使用納米生物催化劑His-TLL-MNP來實現(xiàn)FFA的同時酯化和TG與甲醇的酯交換將廢油脂轉(zhuǎn)化為生物柴油. （b）在重量%比3（），4（）和5（×）負載下使用納米生物催化劑His-TLL-MNP，將廢油脂（1g）生物轉(zhuǎn)化成生物柴油的時程, 分別在50逐步加入甲醇（在0,2和6小時，每次用63L）。（c）在5重量催化劑負載和50條件下，通過逐步添加甲醇（參見部分b）在24小時用His-TLL-MNPs將廢油脂（1g）生物轉(zhuǎn)化成生物柴

14、油的生物轉(zhuǎn)化過程中的His-TLL-MNPs的回收和再利用. 在b和c中的所有實驗都進行了三次，數(shù)據(jù)是具有標準偏差的平均值.用His-TLL-MNP通過FFA的同時酯化和甘油三酯與甲醇的酯交換從含有24重量FFA的廢油脂生產(chǎn)生物柴油（圖3a）。研究溫度和甲醇添加以進行有效的生物轉(zhuǎn)化。在30-50下使用1g廢廢油脂和50mgHis-TLL-MNP,逐步（63L×3）或一次（189L）添加甲醇反應24小時. 在反應系統(tǒng)中加入硅膠微珠（20重量）以通過吸收水提高FAME產(chǎn)率. 通過GC分析（圖S6）確定FAME產(chǎn)率，結果在表1中給出.一次加入甲醇（條目3,40）得到74FAME產(chǎn)率，而逐步

15、加入甲醇（條目2,40）得到81FAME產(chǎn)率. 產(chǎn)量增加是由于通過逐步添加甲醇降低了對酶的毒性. 在逐步加入甲醇時，F(xiàn)AME產(chǎn)率從40（條目2）的81增加至50（條目4）的94.顯然，50對于該反應是更好的. 在50下,在相同的酶負載下和相同的轉(zhuǎn)化率下檢測游離TLL，同時逐步加入甲醇，得到92FAME產(chǎn)率. 因此，在脂肪的生物轉(zhuǎn)中,His-TLL-MNP甚至顯示出比游離TLL稍微更高的產(chǎn)率. 在50下檢查不同的催化劑負載; 生物轉(zhuǎn)化的時間進程在圖3b中給出。在5重量催化劑負載下實現(xiàn)最高的FAME產(chǎn)率（94）; 在3和4重量催化劑負載下，也分別以87和89產(chǎn)率獲得FAME. 在3重量催化劑負載下

16、將油脂轉(zhuǎn)化為FAME的前20分鐘內(nèi)的平均比活性測定為10.5U / mg His-TLL或0.6U / mg His-TLLMNPs. 在這些生物轉(zhuǎn)化中，通過滴定測定，沒有FFA保留在最終反應混合物中. 通過1g廢油脂和甲醇（63L×3）與50mg His-TLL-MNP和0.2g硅膠微珠在50下反應24小時來檢查納米生物催化劑His-TLL-MNPs的可回收性. 每批后，通過使用磁體從反應混合物和硅膠中分離納米生物催化劑His-TLL-MNP. 洗滌催化劑并將其重新用于在相同條件下的下一批油脂生物轉(zhuǎn)化為生物柴油. 如圖3c所示，納米生物催化劑的可回收性是優(yōu)異的，在第七個循環(huán)中保持9

17、7的生產(chǎn)率. 我們發(fā)現(xiàn)納米生物催化劑的高可回收性可部分歸因于MNP容易恢復并幾乎可以完全恢復. 另一個原因是酶對MNP的強親和力附著，在生物轉(zhuǎn)化和再循環(huán)實驗期間沒有產(chǎn)生可檢測的酶滲漏. 此外，固定化酶是高度穩(wěn)定的，如在循環(huán)實驗期間的7天的反應中所證實的，沒有酶生產(chǎn)力的顯著損失. 納米生物催化劑的再循環(huán)和再利用可以顯著降低催化劑的成本，并因此降低生物柴油的生產(chǎn)成本.還檢查了從His-TLL-MNP再生Ni-NTA-MNP的可能性. 在7次總反應時間為7天的生物轉(zhuǎn)化的7個循環(huán)后回收的納米生物催化劑首先用500mM咪唑洗滌以除去His-TLL. 在用EDTA進一步處理以除去咪唑后，用水洗滌MNP并用

18、氯化鎳（II）處理，以100的產(chǎn)率得到Ni-NTA-MNP. 再次使用再生的MNP在確定的最佳條件下從巴斯德畢赤酵母（h-TLL）的細胞培養(yǎng)上清液中固定His-TLL，觀察得到酶負載效率，活性回收率和特異性酶負載量為65，80 ，和49mg / g MNPS因此，再生的Ni-NTA-MNPs達到新合成的Ni-NTA-MNPs的這些關鍵酶固定性能參數(shù)的80. 由再生顆粒制備的納米生物催化劑的比活性達到對于p-NPB水解的8.4U / mg His-TLL，其與由新合成的顆粒制備的納米生物催化劑的比活性相同. Ni-NTAMNsP從使用的催化劑的有效再生和這些MNPs用于酶固定的再利用降低了納米載

19、體的成本.為了證明該固定化方法的一般性，還從細胞培養(yǎng)物直接固定了胞外His標記的南極洲假絲酵母脂肪酶B（His-CALB）,通過使用與His-TLL相同的程序，用Ni-NTA-MNPs處理巴斯德畢赤酵母（h-CALB）的上清液. 固定化納米生物催化劑His-CALB-MNP具有70mg / g MNP的特異性酶負載，94酶負載效率，1.1U / mg His-CALB的特異性酶活性（p-NPB測定）和93活性恢復（表S1）. 由于CALB優(yōu)選酯化36，檢查了納米生物催化劑His-CALB-MNPs用于在4.5重量催化劑負載（基于油脂）和30下12小時的甲醇的廢油脂的FFA的酯化，提供98的轉(zhuǎn)化率FFA。 分離His-CALB-MNP，然后重新用于FFA的酯化的新循環(huán)，在第八個循環(huán)中保持98的生產(chǎn)率（圖S8）.總之，通過使用含有長臂N 1 -NTA表面基團的核 - 殼結構的氧化鐵磁性納米顆粒Ni-NTA-MNP以同時純化和固定靶His標記的酶來開發(fā)用于固定細胞外酶而不進行預純化的簡單且有效的方法 既直接從細胞培養(yǎng)物上清液通過親和附著來實現(xiàn)固定. 以高產(chǎn)率（83）合成Ni-NTA-MNP