模式植物擬南芥t-dna插入突變體的鑒定

1、模式植物擬南芥t-dna插入突變體的鑒定摘要：通過本次實(shí)驗(yàn)，了解了擬南芥t-dna插入突變體鑒定的原理，掌握了 dna提取技術(shù)、pcr技術(shù)以及 電泳鑒定技術(shù)，對(duì)擬南芥的基因型做出判斷。實(shí)驗(yàn)首先提取擬南芥的dna,將獲得的dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增， 將擴(kuò)增好的dna加入上樣緩沖液后與dnamarker 一起進(jìn)行電泳，用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)凝膠進(jìn)行處理，可以看 到大小不同的dna條帶分離。通過這種方法鑒定岀擬南芥是否為突變體。關(guān)鍵詞：t-dna插入突變體、dna提取、pcr、電泳鑒定、凝膠成像系統(tǒng)1 前言擬南芥作為生物學(xué)研究的模式植物，由于其易于種植、?；钪芷诙獭⑦z傳背景清晰、易 于轉(zhuǎn)基因操作等特點(diǎn)，已被廣

2、泛應(yīng)用于植物學(xué)的各種基礎(chǔ)和應(yīng)用研究領(lǐng)域中。同時(shí)，擬南芥 t-dna飽和突變體庫(kù)的建立和dna側(cè)翼序列的確定，為功能基因纟r學(xué)提供了豐富、有效 的遺傳材料。2.實(shí)驗(yàn)2. 1實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?）提取植物基因組dna的方法;（2）pcr操作方法；（3）瓊脂糖凝膠分離核酸方法。2. 2實(shí)驗(yàn)原理ti質(zhì)粒是土壤農(nóng)桿菌的天然質(zhì)粒，該質(zhì)粒上冇一段特殊的dna區(qū)段，當(dāng)農(nóng)桿菌侵染植 物細(xì)胞時(shí)，該dna區(qū)段能自發(fā)轉(zhuǎn)移進(jìn)植物細(xì)胞，并插入植物染色體dna'i'o所以ti質(zhì)粒上 的這一段能夠轉(zhuǎn)移的dna被叫做t-dnaotumor product!on .nopaline synthesisdna transf

3、er functionsnopali ne utilizati onorigin of replication將ti質(zhì)粒進(jìn)行改造，將感興趣的基因放進(jìn)t-dna區(qū)段中沒通過農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞, 實(shí)現(xiàn)外源基因?qū)χ参锏倪z傳轉(zhuǎn)化。t-dna雜交質(zhì)村卻開粘性末瑞+夕念-農(nóng)纟il丿貢粒丿無粉含vlr基 因不禽 t-dna農(nóng)桿閑農(nóng)桿閑 感染煙時(shí)農(nóng)桿苗t" 轉(zhuǎn)基因的植物染色休蟲帶外源基因整各t-dna朋住t dna插圖到植物染色體上的什么位置，是隨機(jī)的。如果t-dna插入進(jìn)某個(gè)功能基因的 內(nèi)部，特別是插入到外顯子區(qū)，將造成基因功能的喪失。所以利用農(nóng)桿菌ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物 細(xì)胞，是獲得植物突變體的一種重

4、要方法。用pcr方法鑒定t-dna插入船和突變體。農(nóng)桿菌ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞示，在獲得的示 代分離群體匯總，有t-dna插入的純合突變體，雜合突變體和野住型。在突變體研究中，需 要的材料是純合突變體，所以必須從分離群體中將純合突變體鑒定出來。900 >410+n (m=g-3oo)ithzhm“三引物法”的原理如圖1所示，即用三種引物（lp、bp、rp）進(jìn)行pcr擴(kuò)增，野生型 植株目的基因的兩條染色休上均為發(fā)牛t-dna插入，所以具pcr產(chǎn)物僅有一種，分子量約為 900bp（即從lp到rp）；純合突變體植株目的基因的兩條染色體上均發(fā)生t-dna插入，而t-dna 木身的長(zhǎng)度約為17kb,

5、過長(zhǎng)的模版會(huì)阻抑h的基因特異擴(kuò)增產(chǎn)物的形成，所以也只能得到1 種以lb -u lp （或rp）為引物進(jìn)行擴(kuò)增的產(chǎn)物，分子雖:約為410+nbp （即從lp或rp到t-dna 插入位點(diǎn)的片段）,長(zhǎng)度為300卜/vbp,再加上從lb到t-dna載體左邊界的片段,長(zhǎng)度為hobp）； 雜合突變體植株只在冃的基因的一條染色體上發(fā)生了 t-dna插入，所以pcr擴(kuò)增后町同時(shí)得 到410+/v bp和900bp兩種產(chǎn)物。上述3種情況的電泳結(jié)果壽異明顯，能有效區(qū)分不同基因 型的植株。此法的有點(diǎn)事可同時(shí)鑒定出純合突變體并確證t-dna的插入情況。圖 1 "三引物法"原理示意（http:/si

6、/tdnaprimers.html）a: t-dna插入目的基因編碼瘁列的方式、位萱以及pcr鑒定反應(yīng)所需引物.lp. rp：與目的基因片段互補(bǔ)的特異引物； lb：插入t-dna片段的特異引物；n： t-dna的實(shí)際插入位點(diǎn)與側(cè)翼序列z間的距離（通常為0-300 bp）- b： 3種可能的基 圉型植株pcr產(chǎn)物的差異。wt：野生型植株；hz：雜合突變體植株：hm：純合突變體植株?！半p引物法”的基木原理與“三引物法”相似，即采用特異引物擴(kuò)增目的基因片段和 t-dna插入片段，通過比対擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行突變體的鑒定。具體方法圖2所示：首先以基因組 dna為模版，用一對(duì)特意產(chǎn)物（

7、lp和rp）擴(kuò)增冃的基因片段，初步鑒定出純合突變體（圖2-a)；然后再以基因組dna為模版，由t-dna片段的特界引物(lb)打lp或rp組成一對(duì)引 物，擴(kuò)增冃的基因t-dna插入片段，以確證所獲得突變體為t-dna插入冃的基因的突變體。 此法的不足之處是完成最終鑒定需要進(jìn)行兩輪pcr擴(kuò)增。wthzhmii ii i1wthzhm900 1410" a（楓4300）、b圖 2 雙引物普通 pcr 法原理示意(/tdnaprimers.html)ax以lp. rp為引物，不同基因型植株pcr產(chǎn)物的差異.b：以lp、lb或lb. rp為引物，不同

8、堪因型植株pcr產(chǎn) 物的差異。n、wt、hz、hm同圖i。聚合酶鏈反應(yīng)是體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性 好、易自動(dòng)化等突出有點(diǎn)。pcr能在一個(gè)試管內(nèi)將索要研究的目的基因或某一 dna片段于數(shù) 小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍，使肉眼能直接觀察和判斷。dna含有p0產(chǎn)基團(tuán),在pii8.0 buffer !'帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。自由電泳時(shí), 山于不同大小的dna片段的電荷密度大致相同，各核酸分子難以分開選用適當(dāng)濃度的瓊脂糖 凝膠作為支持物，使z具備一定的孔徑，即可發(fā)揮分了篩效應(yīng)，使大小不同的核酸片段遷移 率出現(xiàn)較大差異，達(dá)到分離的目的；同樣條件對(duì)血ker電

9、泳；起到鑒定的作用。瓊脂糖凝膠電泳濃度與dna分離范圍5-600. 6%1-2 00. 9%0. 570. 8-101. 2%0 4一6dna經(jīng)澳乙錠(eb)染色，漠乙錠可以插入dna雙螺旋結(jié)構(gòu)兩個(gè)堿壟z間，與核酸形成 絡(luò)合物，在紫外(300nni, 360nm)激發(fā)下，產(chǎn)生桔黃色熒光(590 nm可見光)。2. 3實(shí)驗(yàn)材料(1) 實(shí)驗(yàn)材料：擬南芥(2) 實(shí)驗(yàn)試劑：2*ctab提取液、液氮、te、1*tbe緩沖液、tps、eb、瓊脂糖、loading buffer. dl2000 marker bploo ladder marker lambda dna/ecori marker> 10

10、*taq buffer (mgcfree)> mgci2> 引物 lp、引物 bp、引物 rp、dntp、taq 酶(3) 實(shí)驗(yàn)儀器：離心機(jī)、pcr儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)2. 4實(shí)驗(yàn)步驟線狀dna分離范圍/kb（1）dna提取a. ctab 法 用液氮將100 mg幼嫩葉片研辭成細(xì)粉，置于1.5 ml離心管中加入預(yù)熱至65°c的600 u 1的2xctab提取液，輕搖混勻； 65°c水浴30 min,其間輕搖混勻； 向上清液加入等體積的氯仿/異戊醇（24： 1）,室溫下輕輕混勻10 min, 12000 rpm離心15 min,再轉(zhuǎn)移上清入新管； 向上清液中2

11、倍無水乙醇或等體積的界丙醇，小心混勻，-20 °c下30 min , 12000 rpm 離心15 min,棄上清; 用70%乙醇洗滌沉淀一次，12000 rpm稍離心，棄上清； 將沉淀晾干，加20-50 u 1 te （ph &0）,65°c水浴30 min溶解dna。 將水浴后的dna進(jìn)行pcr或置于-20°c保存b. tps 法 剪取l-2mm2的幼葉,放入0. 2ml離心管中; 加入20ultps； 用200ul槍尖研磨（冰上）； 在pcr儀±95°c15min.之后立即放入-20 °c下晾透（約需3. 5min）；

12、加入180ul dcih20混勻。（2）pcr擴(kuò)增 配成反應(yīng)體系，用離心機(jī)4000r/min離心10s,并用移液槍反復(fù)抽打混勻 將反應(yīng)體系分裝到裝有模版dna的離心管屮，用離心機(jī)4000r/mi n離心10s 將離心后的離心管放入pcr儀,設(shè)定程序開始pcr（3）電泳鑒定 將50*tae溶液稀釋到1*,為電極緩沖液； 量筒量出40mltae加入到錐形瓶小，并稱取0. 64g瓊脂糖加入錐形瓶，用微波爐反復(fù)加熱 使瓊脂糖溶于tae； 待混合液稍微冷卻后，將其加入到制作瓊脂糖凝膠的模版中，50min后，制得瓊脂糖凝膠; 將凝膠放在托板上，一起放入電極槽，1*tae （電極緩沖液）倒入電極槽，使緩沖液

13、沒過 凝膠； 將擴(kuò)增好的dna加入上樣緩沖液后，分別用移液槍進(jìn)行點(diǎn)樣，每個(gè)孔點(diǎn)20u1； 用移液槍取適量的marker點(diǎn)樣； 川電極槽按5v/cm的電壓電泳40 -45min； 取電泳后的凝膠放入eb屮染色15min； 將染色后的凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察。3 結(jié)果至今為止，我一共進(jìn)行了七次實(shí)驗(yàn)，英中能看到dna片段的共冇兩次，下面將其結(jié)果呈現(xiàn):（1）本次試驗(yàn)用的是tps法制得的dna,反應(yīng)體系是: 25ul體系mgci2(25mm)2ul引物 1(10 um)1 ul引物 2(10 um)1 ul2ul1 ul1 uldntp(各 2.5mm)0.5ul模板 dna(30-50ng/n i

14、)2ultaq 酶(5u/u i)0.2ul這次失敗我們懷疑可能是中間需要混勻的兒個(gè)步驟出現(xiàn)了差錯(cuò)。(2) 本次試驗(yàn)點(diǎn)樣較多，其中有ctab法和tps法制得的dna,但仍沒有看到片段，體系 仍為:25ul體系h2016ulloxtaq buffer (mgci2free)2.5ulmgci2(25mm)2ul引物 1(10 um)lul引物 2(10 um)luldntp(各 25mm)0.5ul模板 dna(30-50ng/u 1)2ultaq 酶(5u/p 1)0.2ul(3) 本次試驗(yàn)山學(xué)長(zhǎng)進(jìn)行操作，酶也是學(xué)長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)室的，在2樓實(shí)驗(yàn)室完成的整個(gè)過程。結(jié)果出來了,不it marker選取得不

15、恰當(dāng)，并r非特異性條帶特別多。反應(yīng)體系:20ul體系13ulh20mgci2 (25mm)2ul引物 1(10 um)0.5 ul引物 2(10 um)0.5 uldntp(各 2.5mm)0.5ul模板 dna(30-50ng/u 1)lultaq 酶(5u/u 1)0.5ulloxtaq buffer (mgci2free)2ul(4) 本次試驗(yàn)采川的是老師的體系，但是依舊沒有結(jié)果。這次點(diǎn)樣的時(shí)候marker加得也有問題。反應(yīng)體系:25ul體系h2o16ulloxtaq buffer (mgci2free)2.5ulmgci2(25mm)2ul引物 1(10 um)lul引物 2(10 u

16、m)luldntp(各 2.5mm)0.5ul模板 dna(30-50ng/ u 1)2ultaq 酶(5u/ui)0.2ul(5) 本次試驗(yàn)是采用學(xué)長(zhǎng)20 ul的體系，在6樓實(shí)驗(yàn)家完成的，但是依舊沒有出結(jié)果，我們 懷疑6樓的實(shí)驗(yàn)材料的純度冇問題。反應(yīng)體系：20ul體系h2o13ulloxtaq buffer (mgci2free)2ulmgci2 (25mm)2ul引物 1(10 um)0.5 ul引物 2(10 um)0.5 uldntp(各 2.5mm)0.5ul模板 dna(30-50ng/n i)lultaq 酶(5u/u i)0.5ul（6）木次實(shí)驗(yàn)采用的是一種新的20ul的配方，

17、原料除三種引物外都是2樓實(shí)驗(yàn)室的，在2 樓實(shí)驗(yàn)室完成的。出現(xiàn)的結(jié)果相對(duì)較好，能夠辨認(rèn)出擬南芥的基因型了。反應(yīng)體系：20ul體系h2016ulloxtaq buffer (mgci2free)2ulmgci2(25mm)2ul引物 1(10 um)0.5 ul引物 2(10 um)0.5 uldntp(各 25mm)0.5ul模板 dna(30-50ng/u 1)1.5ultaq 酶(5u/pi)lul（7）本次試驗(yàn)所使用的是和第六次相同的體系，幾個(gè)不同點(diǎn)是：原料不同、時(shí)間不同、pcr儀不同，但是這次述是沒出結(jié)果，我又一次懷疑6樓的實(shí)驗(yàn)試劑有問題。4.討論（1）ctab法提取dna,在加入液氮后

18、研磨的時(shí)候要快，液氮若快升華完了，則立即補(bǔ)充， 不要在無液氮的時(shí)候研磨；（2）提取dna,混勻時(shí)不可用力過猛;（3）將dna加入到反應(yīng)體系時(shí)，授好將同種的反應(yīng)體系一同配好，然后再分裝到不同的管 里，這樣可以減少謀差，在配置總反應(yīng)體系時(shí)，加入的量應(yīng)該比實(shí)際的分?jǐn)?shù)多1-2份，避免 在移液過程中損失；（4）k成后可以用移液槍連續(xù)抽打混勻；（5）在移液過程屮，若有微量液體附著于管壁上，可用離心機(jī)離心；（6）移不同成分液體的時(shí)候注意更換槍頭；（7）在進(jìn)行pcr時(shí)，可先觀察具運(yùn)行一個(gè)循壞，看是否有異常情況發(fā)生；（8）用瓊脂糖溶液制作凝膠時(shí)，要趁熱將溶液倒入模版屮，當(dāng)傾倒的最后，液流變得很細(xì) 小時(shí)停止傾倒，避免凝膠表面不平；（9）移動(dòng)凝膠時(shí)要小心操作，不可使其受到損傷；（10）電泳前要對(duì)pcr過的dna加入loading buffer, loading buffer有兩個(gè)作用:增加dna的比重，使它的比重大于電極緩沖液，凝膠上的小孔里；著色，電泳的時(shí)候可根據(jù)有色條帶判斷電泳進(jìn)行的程