藏藥寨卡有效部位的分離鑒定及其抗腫瘤活性研究

1、藏藥寨卡有效部位的分離鑒定及其抗腫瘤活性研究作者：李艷，江南，羅霞，清源，許曉燕，楊志榮【摘要】目的分離鑒定藏藥寨卡的有效部位并對其抗腫瘤活性進行初步研究。方法采用甲醇萃取、酸性氧化鋁層析柱層析和譜圖 分析對寨卡有效部位進行分離提取和鑒定，采用s180荷瘤小鼠模型和 ct-26荷瘤小鼠模型，探討寨卡有效部位提取物的抗腫瘤活性。結(jié)果 提取分離得到了寨卡中有抗腫瘤活性的有效部位，并經(jīng)譜圖分析鑒定 該部位為硫代葡萄糖昔類。經(jīng)抑瘤實驗表明，其能明顯抑制s180荷瘤 小鼠和ct-26荷瘤小鼠的腫瘤增殖。結(jié)論硫代葡萄糖昔是寨卡抑制腫 瘤增殖的有效部位，具有一定的抗腫瘤活性?！娟P(guān)鍵詞】寨卡；有效部位；硫代葡

2、萄糖昔abstract:objectiveto extract and identify the active fraction of the seeds of tibet medicine thlaspi arvense linn. and to study its antitumor activities methodsthe active fraction of thlaspi arvense linn was extracted and identified by nethanol-extraction, tarta1203 colum chromatography, tlc and

3、hplc.the anti-tumor effect was observed on the mouse model ofs180 and ct-26.resultsthe active fraction of thcaspi aruenselinn. was glucosinolate, and it could evidently inhibit the tumor propagation of the two kinds of animal modelsconclusionglucosinolate is the active fraction of thlaspi arvense li

4、nn and it has good antitumor effectskey words:thlaspi arvense linn; active fraction; glucosinolate寨卡是一味常用藏藥，為十字花科植物薪莫thlaspi arvense linn.的干燥成熟種子。在傳統(tǒng)藏醫(yī)藥應(yīng)用中，寨卡主要用于治療目赤 腫痛、流淚、肺熱、咳嗽、腎熱、淋病、消化不良、嘔吐等病癥。目 前，國內(nèi)外針對寨卡開展的系統(tǒng)研究甚少，僅通過初步的植物化學研 究知其含黑芥子昔(sinigrin)脂肪油、揮發(fā)油、卵磷脂等成分，因 此，開展寨卡有效部位分離提取和藥效研究，對藏藥寨卡的藥物開發(fā) 具有良好的

5、指導(dǎo)作用和應(yīng)用價值。十字花科植物已被大量研究證實具有非常突出的抗腫瘤活性，主 要原因是其富含抗癌活性成分前體 硫代葡萄糖昔 (glucosinolate)類物質(zhì)。硫代葡萄糖昔在一些十字花科植物屮的含 量大約占干重的1%,在一些植物種子中的含量達到10% 1, 2。當十 字花科植物因收割、加工、咀嚼等或植物水解而使其細胞破碎吋，內(nèi) 源性黑芥子酶釋放出來，使硫代葡萄糖昔水解為異硫氧酸鹽(isothiocyanates, itcs)硫氧酸鹽(thiocyanates)和丿睛(nitriles) 而發(fā)揮抗腫瘤作用3, 4o本實驗室在前期已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)寨卡粗提物具有明顯的抑制腫瘤 增殖活性的作用，且發(fā)現(xiàn)等

6、劑量的寨卡粗提物與芥子昔純品相比，抑 瘤活性更強；根據(jù)現(xiàn)有資料，本實驗室推測寨卡抗腫瘤有效部位可能 為硫代葡萄糖莒類物質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，本文擬開展對寨卡有效部位進 行提取、分離和鑒定的研究，并對有效部位抗腫瘤活性進行驗證。1儀器與材料1.1儀器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申順生物科技有限公司，senco r201),層 析柱(上海滬西分析儀器廠有限公司，4)25 mmx 300 mm),蠕動泵 (watson marlow 504u), iiplc： waters 1525, waters 2487, spd-10av 紫外檢測器，aichrom色譜柱，色譜工作站(天津)，凝膠成像系統(tǒng) (bio-rad,

7、gel doc xr)。1.2藥材寨卡采摘收集自卩l(xiāng)|川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣，經(jīng)四川 省中藥研究所中藥研究室鑒定為十字花科植物薪莫thlaspi arvense linn.的成熟種籽。1.3細胞系和實驗動物s180 (小鼠腹水瘤細胞)，由四川省中藥研究所提供；ct-26(小鼠結(jié)腸癌細胞，atcc編號：crl-2638),購于南京凱基生物科技 發(fā)展有限公司。昆明種小鼠，清潔級，雌雄各半，1822 g,由四川 省屮藥研究所動物室提供(川實動質(zhì)第2002-33號)；balb/c純種小 鼠，雄性2025 g,由四川省成都中醫(yī)藥大學動物中心提供。1.4藥品與試劑芥子 (sinigrin),購于si

8、gma公司；酸性氧化鋁，購于上 海陸都化學試劑廠;甲醇、乙醇、pb(ac)2、ba (ac) 2和kn03等提取 試劑及層析分析試劑均為國產(chǎn)分析純；色譜試劑均為國產(chǎn)色譜純。2方法與結(jié)果2.1寨卡有效部位的制備32. 1. 1寨卡有效部位的提取將寨卡炒香，打粉，過40目篩，得到寨卡粉末。在充分攪拌 下，將600 ml甲醇中加熱至微沸，緩慢加入200 g寨卡粉末，加料完 畢后繼續(xù)于微沸狀態(tài)下攪拌20-30 mine待整個體系冷卻，將其置于 冰浴中使懸浮物完全沉降，收集上清液。固體殘渣用600 ml體積分數(shù) 為70%的甲醇水溶液進行第2次提取，保持微沸狀態(tài)下攪拌2030 min,冷卻后，將其置于冰浴

9、中使懸浮物完全沉降，收集上清液。合并 提取液,加入其體積1/50的pb(ac)2-ba(ac)2溶液(0. 5mol/l)沉 降提取液屮蛋白質(zhì)。抽濾，濾液于40°c旋蒸濃縮至體積不再減少，以 除去人部分甲醇，得棕色硫昔提取液。2. 1.2寨卡有效部位的分離和層析純化將“2. 1. 1”得到的濃縮提取液轉(zhuǎn)入經(jīng)蒸憾水平衡的酸性氧化 鋁柱中進行純化，先用蒸憾水淋洗以洗凈提取液中的有色雜質(zhì)，再用1 000 ml 0. 1 mol/l kn03溶液淋洗，收集kn03溶液淋洗的全部洗脫 液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，至近干時加入約30 ml的無水乙醇，繼續(xù)濃縮 至干，得到白色固體。將固體樣品溶入150ml

10、甲醇中，達到平衡后濾 去不溶物以除去其屮的kn03o濾液繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，溶于少量無 菌水中，于-50°c下冷凍干燥，得到近似白色的固體粉末，即為寨卡有 效部位提取物(active fractions of pennycress, zaf),精密稱重, 計算得率。zaf得率(%)二zaf重量/寨卡藥材重量x100%2.2寨卡有效部位的譜圖分析2. 2. 1薄層層析法鑒定寨卡有效部位純度采用硅膠g板為層析板，展開條件為止丁醇：乙醇：氨水的 比例為5 ： 1 ： 2o按比例配制展開劑。將4批次寨卡有效部位提取物 (zaf)點樣后進行薄層層析。層析完后在紫外光下顯色，并用凝膠成 像系統(tǒng)照

11、像記錄。2.2.2 hplc法檢測寨卡有效部位含量采用hplc法對寨卡有效部位提取物(zaf)進行檢測，采用 峰面積歸一化法檢驗含量。iiplc的試驗條件為：色譜柱為aiciirom, (5 lim,4.6mmx150miii)；流動相組成為乙睛:水二20 : 80,柱溫 30°c, 流速1.0 ml/min,檢測波長為227 nmo數(shù)據(jù)采集由waters化學工作 站完成。 2.3寨卡有效部位提取物(zaf)對s180荷瘤小鼠瘤重 的影響無菌傳代后7 d的s180小鼠肉瘤細胞懸液，生理鹽水稀釋調(diào) 整濃度為2x107個/ml,接種于昆明種小鼠右前腋窩皮下，0.2 ml/ 只，24 h后

12、隨機分為3組，每組10只，分別為模型對照組、zaf低劑 量組(25 mg/kg), zaf高劑量組(50 mg/kg),按實驗設(shè)計劑量腹腔 注射給藥，模型對照組給予等劑量生理鹽水，1次/d,連續(xù)10 do末 次給藥后24h,小鼠稱重，處死小鼠剝?nèi)×鰤K，精密稱重。采用統(tǒng)計 學軟件進行數(shù)據(jù)處理。實驗所得數(shù)據(jù)采用土s表示，實驗組與對照組 用t檢驗。2. 4寨卡有效部位提取物(zaf)對ct-26荷瘤小鼠瘤重的影 響2.4. 1 ct-26荷瘤小鼠的造模4, 5用pbc洗滌處于對數(shù)生長期的ct-26小鼠結(jié)腸癌細胞，用胰 蛋白酶消化液消化，用無血清培養(yǎng)液吹打稀釋，以1 500 r/min的速 度離心5

13、min,收集細胞并以pbs配制成細胞懸液，生理鹽水稀釋調(diào) 整細胞濃度為1x106個/ml,接種于balb/c純種小鼠右前腋窩皮下, 0.2 ml/只。接種14 d后，小鼠頸椎脫臼處死，無菌條件下摘取皮下 瘤體，立即置于消毒培養(yǎng)皿內(nèi)，用無菌生理鹽水洗滌，將瘤體剪成約 0. 1 cmxo. 1 cmxo. 1 cm大小的瘤塊，將瘤塊塞入滅菌后的套管針頭 部腔內(nèi)。選用68周齡，取標準體重的balb/c純種小鼠，右前肢外 側(cè)皮膚用碘酒消毒，將塞有瘤塊的套管針穿刺至皮下潛行一小段后， 用針芯將針腔內(nèi)的瘤塊推至皮下。接種后3 d即可出現(xiàn)皮下腫瘤結(jié)節(jié), 成功率100%o2.4.2對ct-26荷瘤小鼠瘤重的影

14、響取接種后已成瘤的balb/c純種小鼠30只，隨機分為3組，每組10只，分別為模型對照組、zaf低劑量組（25mg/kg）, zaf高劑 量組（50mg/kg）,接種5 d后按實驗設(shè)計劑量腹腔注射給藥，模型對 照組給予等劑量生理鹽水，1次/d,連續(xù)21d。末次給藥24 h后，小 鼠稱重，處死小鼠剝?nèi)×鰤K，精密稱重。采用統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處 理。實驗所得數(shù)據(jù)采用土s表示。實驗組與對照組用t檢驗。2.5結(jié)果2. 5.1寨卡有效部位分離提取得率經(jīng)4次重復(fù)提取實驗，得 到4批次寨卡有效部位提取物（zaf）。在寨卡有效部位整個分離提取 過程得率約為0. 30%0結(jié)果見表1。表1 zaf得率（略）2. 5

15、.2譜圖分析鑒定寨卡有效部位薄層層析法檢測寨卡有效部位提取物（zaf）純度：將4批次的 zaf按實驗方法進行點樣，薄層層析，并在紫外光下觀察實驗結(jié)果（見 圖1）。從實驗結(jié)果中可看出，4個不同批次的zaf都有一個在紫外光 下顯色、位置大致相同口顏色一致的熒光斑點，并且該點較為明亮。 說明分離得到的zaf雖是混合物，但其化學成分比較單一，主要成分 相同，冃含量高，可視作一個有效部位。hplc法檢測寨卡有效部位提取物（zaf）含量：以芥了甘為標準 品，采用hplc法對zaf主耍成分的含量進行檢測（采峰血積歸一化法 檢驗純度）。結(jié)果顯示，zaf中的主要有效成分含量為85. 70% （以芥子 昔為對照品

16、），見圖2。圖3為芥子昔純晶對照hplc色譜。以上譜圖分析方法均為硫代葡萄糖昔分析方法。由實驗結(jié)果看 出，寨卡有效部位的主耍化學成分單一，以芥子昔為純品對照時，出 峰時間基本一致，且含量高，由此證明寨卡有效部位主要化學成分確 為硫代葡萄糖昔類物質(zhì)，符合本文推測。2.5.3寨卡有效部位提取物（zaf）對s180荷瘤小鼠瘤重的 影響從表2可看出，zaf低、高劑量都能有效抑制s180腫瘤細胞的增 殖，小鼠瘤重低于模型對照組。其中，低劑量組具有顯著性差異 （p<0. 05）,高劑量組具有極顯著性差異（p<0.01）,表現(xiàn)出一 定的量-效關(guān)系；同時也可看出，同等劑量下，zaf

17、抑制s180腫瘤增 長的效果較芥子甘純品好。2. 5. 4寨卡有效部位提取物(zaf)對ct-26荷瘤小鼠瘤重的 影響從表3可看出，zaf低、高劑量都能有效抑制ct-26腫瘤細胞的 增殖，小鼠瘤重低于模型對照組。其中，低劑量組具有顯著性差異 (p<o. 05),高劑量組具有極顯著性差異(p<0.01),表現(xiàn)出一 定的量-效關(guān)系。表2zaf對s180荷瘤小鼠瘤重的影響(略)表3zaf 對ct-26荷瘤小鼠瘤重的影響(略)3討論硫代葡萄糖昔是廣泛存在于十字花科植物中的抗腫瘤活性成分, 到目前為止已發(fā)現(xiàn)有近120種6o木文通過回流提取、甲醇萃取以 及酸性氧化鋁層析分離，從

18、寨卡中分離得到的有強抗腫瘤活性作用的 有效部位，經(jīng)譜圖分析鑒定為硫代葡萄糖昔(glucosinolate)的混合 物。整個提取過程屮，寨卡有效部位提取物(zaf)得率約為0. 30%, 而通過本文方法，其中硫代葡萄糖昔含量可以達到85%以上。硫代葡萄糖昔的生物活性作用是經(jīng)過水解之后的產(chǎn)物所表現(xiàn)岀 來的，研究發(fā)現(xiàn)，其降解產(chǎn)物異硫氧酸酯類物質(zhì)具有顯著的抗腫瘤活 性3o本文s180和ct-26腫瘤在體動物模型研究實驗表明，寨卡有 效部位提取物(zaf)對小鼠s180和ct-26實體瘤的生長有明顯的抑 制作用，并隨著給藥濃度的增加，小鼠瘤重明顯減小，表現(xiàn)出一定的 量-效關(guān)系，說明硫代葡萄糖昔在小鼠胃腸道酶的作用下發(fā)生了降解, 其降解產(chǎn)物是異硫氧酸酯類物質(zhì)。另外，從實驗數(shù)據(jù)中也可看出，zaf 比同劑量的芥子昔純品具有更好的抗腫瘤活性，可能與提取物為多種 硫代葡萄糖昔混合物，存在協(xié)同抗癌作用有關(guān)。本實驗鑒定了其抗腫 瘤有效部位，并通過兩種荷瘤動物模型驗證，為藏藥寨卡有效部位的 提取分離提供了途徑，為寨卡的抗腫瘤藥效研究提供了直接依據(jù)，將 為開發(fā)研制抗腫瘤單味藏藥打下堅實的工作基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I】1 季宇彬，武曉丹，鄒祥硫代葡萄糖昔的研究j 哈 爾濱商業(yè)大學學報(自然科學版)，2005, 21 (5)： 551.2 ba