無病毒苗的培育

1、LifeLife Science Science & Plant& Plant Tissue Culture Tissue Culture 一、病毒在植物上的危害 危害植物的病毒有幾百種， 且隨著生產(chǎn)栽培時間的延長，危害越來越甚， 種類越來越多。以種子進(jìn)行繁殖的種類，除豆類外， 可隨著世代的交替而去除病毒，即病毒只能危害一個世代；而行無性繁殖的種類， 由于病毒通過營養(yǎng)體進(jìn)行傳遞，在母株內(nèi)逐代積累，危害日趨嚴(yán)重。一些園藝植物以小規(guī)模集約栽培，造成連作危害問題，并加重土壤傳染性病毒的危害。 LifeLife Science Science & Plant& Plan

2、t Tissue Culture Tissue Culture 病毒的危害給作物生產(chǎn)帶來重大的損失。 如草莓病毒的危害，使草莓產(chǎn)量嚴(yán)重降低， 品質(zhì)大大退化。葡萄扇葉病毒使葡萄減產(chǎn)1018%，為害馬鈴薯有幾十種病毒， 給馬鈴薯生產(chǎn)帶來嚴(yán)重障礙。花卉上病毒的危害大大影響其觀賞價值，表現(xiàn)花少而小，產(chǎn)生畸形、變色等。LifeLife Science Science & Plant& Plant Tissue Culture Tissue Culture 為了提高作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，根除病毒和其它病為了提高作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，根除病毒和其它病原菌是非常必要的。原菌是非常必要的。 但現(xiàn)在還沒有

3、什么藥物可治愈受病毒侵染的植物。但現(xiàn)在還沒有什么藥物可治愈受病毒侵染的植物。若一個無性系的整個群體都已受到侵染，若一個無性系的整個群體都已受到侵染， 獲得無病獲得無病毒植株的唯一方法就是消除營養(yǎng)體的病原菌，毒植株的唯一方法就是消除營養(yǎng)體的病原菌， 并由并由這些組織中再生出完整的植株。一旦獲得了一個不帶這些組織中再生出完整的植株。一旦獲得了一個不帶病原菌的植株，病原菌的植株， 就可在不致受到重新侵染的條件下就可在不致受到重新侵染的條件下，對它進(jìn)行營養(yǎng)繁殖。用組織培養(yǎng)法消除病毒是唯一，對它進(jìn)行營養(yǎng)繁殖。用組織培養(yǎng)法消除病毒是唯一行之有效的方法。行之有效的方法。LifeLife Science Sc

4、ience & Plant& Plant Tissue Culture Tissue Culture 二、無病毒苗培育的意義二、無病毒苗培育的意義 采用生物、物理、化學(xué)等途徑防治病毒病收效甚微采用生物、物理、化學(xué)等途徑防治病毒病收效甚微，甚至毫無成效。自從，甚至毫無成效。自從50年代發(fā)現(xiàn)通過組織培養(yǎng)的方年代發(fā)現(xiàn)通過組織培養(yǎng)的方法可以脫除嚴(yán)重患病毒植物的病毒種類，提高產(chǎn)量、法可以脫除嚴(yán)重患病毒植物的病毒種類，提高產(chǎn)量、質(zhì)量后（如草莓可增產(chǎn)質(zhì)量后（如草莓可增產(chǎn)2050，植株結(jié)果多，單果，植株結(jié)果多，單果重增加，上等果比例提高。菊花切花品種的脫毒株，重增加，上等果比例提高。菊花切花品

5、種的脫毒株，表現(xiàn)出株高增加，切花數(shù)增多，花朵大，切花較重）表現(xiàn)出株高增加，切花數(shù)增多，花朵大，切花較重）。因此到。因此到60至至70年代組織培養(yǎng)的技術(shù)在花卉、蔬菜和年代組織培養(yǎng)的技術(shù)在花卉、蔬菜和果樹等得到廣泛的應(yīng)用。果樹等得到廣泛的應(yīng)用。LifeLife Science Science & Plant& Plant Tissue Culture Tissue Culture 一、莖尖培養(yǎng)脫毒一、莖尖培養(yǎng)脫毒 感染病毒植株的體內(nèi)病毒的分布并不均勻，感染病毒植株的體內(nèi)病毒的分布并不均勻， 病病毒的數(shù)量隨植株部位及年齡而異，越靠近莖頂端區(qū)域毒的數(shù)量隨植株部位及年齡而異，越靠近莖頂端

6、區(qū)域的病毒的感染深度越低，生長點(diǎn)（約的病毒的感染深度越低，生長點(diǎn)（約0.11.0mm區(qū)區(qū)域）則幾乎不含或含病毒很少。這是因?yàn)榉稚鷧^(qū)域內(nèi)域）則幾乎不含或含病毒很少。這是因?yàn)榉稚鷧^(qū)域內(nèi)無維管束，病毒只能通過胞間連絲傳遞，無維管束，病毒只能通過胞間連絲傳遞， 趕不上細(xì)趕不上細(xì)胞不斷分裂和活躍的生長速度。在切取莖尖時越小越胞不斷分裂和活躍的生長速度。在切取莖尖時越小越好，好， 但太小則不易成活，過大則不能保證完全除去但太小則不易成活，過大則不能保證完全除去病毒。病毒。 莖尖培養(yǎng)脫毒，莖尖培養(yǎng)脫毒， 由于其脫毒效果好，后代穩(wěn)定由于其脫毒效果好，后代穩(wěn)定，所以是目前培育無病毒苗的最廣泛最重要的一個途，所以

7、是目前培育無病毒苗的最廣泛最重要的一個途徑。徑。LifeLife Science Science & Plant& Plant Tissue Culture Tissue Culture 莖尖培養(yǎng)脫毒LifeLife Science Science & Plant& Plant Tissue Culture Tissue Culture 二、培養(yǎng)基二、培養(yǎng)基 一般以一般以White、 Morel和和MS培養(yǎng)基作為基培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，尤其是提高鉀鹽和銨鹽含量有利于莖本培養(yǎng)基，尤其是提高鉀鹽和銨鹽含量有利于莖尖的生長。尖的生長。 MS培養(yǎng)基對某些植物的莖尖培養(yǎng)培

8、養(yǎng)基對某些植物的莖尖培養(yǎng)時，其中有些離子濃度過高應(yīng)予以稀釋。時，其中有些離子濃度過高應(yīng)予以稀釋。 植物激素的種類與濃度對莖尖生長和發(fā)育具有植物激素的種類與濃度對莖尖生長和發(fā)育具有重要的作用。在雙子葉植物植物激素大概是在第重要的作用。在雙子葉植物植物激素大概是在第2對最年幼的葉原基中合成，對最年幼的葉原基中合成， 所以莖尖的圓錐組織所以莖尖的圓錐組織生長激素不能自給，必須提高適當(dāng)濃度的生長素生長激素不能自給，必須提高適當(dāng)濃度的生長素(0.10.5mg/L)與細(xì)胞分裂素，在生長素中應(yīng)避免與細(xì)胞分裂素，在生長素中應(yīng)避免使用易促進(jìn)愈傷組織化的使用易促進(jìn)愈傷組織化的2,4D，宜換用穩(wěn)定性較，宜換用穩(wěn)定性

9、較好的好的NAA或或IBA，細(xì)胞分裂素可用，細(xì)胞分裂素可用KT或或BA。GA3對某些植物莖尖培養(yǎng)是有用的。有時莖尖培養(yǎng)添加對某些植物莖尖培養(yǎng)是有用的。有時莖尖培養(yǎng)添加活性炭?；钚蕴?。 莖尖培養(yǎng)中，莖尖培養(yǎng)中， 由于操作方便，一般都由于操作方便，一般都使用瓊脂培養(yǎng)基。不過，在瓊脂培養(yǎng)基能誘使用瓊脂培養(yǎng)基。不過，在瓊脂培養(yǎng)基能誘導(dǎo)外植體愈傷組織化的情況下，最好還是用導(dǎo)外植體愈傷組織化的情況下，最好還是用液體培養(yǎng)基。在進(jìn)行液體培養(yǎng)時，須制作一液體培養(yǎng)基。在進(jìn)行液體培養(yǎng)時，須制作一個濾紙橋，把橋的兩臂浸入試管內(nèi)的培養(yǎng)基個濾紙橋，把橋的兩臂浸入試管內(nèi)的培養(yǎng)基中，橋面懸于培養(yǎng)基上，外植體放在橋面上中，橋面

10、懸于培養(yǎng)基上，外植體放在橋面上。LifeLife Science Science & Plant& Plant Tissue Culture Tissue Culture 三、莖尖培養(yǎng)方法三、莖尖培養(yǎng)方法 進(jìn)行脫毒培養(yǎng)時，進(jìn)行脫毒培養(yǎng)時， 由于微小的莖尖組織很難靠由于微小的莖尖組織很難靠肉眼操作，因而需要一臺帶有適當(dāng)光源的簡單的解剖肉眼操作，因而需要一臺帶有適當(dāng)光源的簡單的解剖鏡鏡(840X)。除了在進(jìn)行植物組織無菌培養(yǎng)一般工具。除了在進(jìn)行植物組織無菌培養(yǎng)一般工具外，外， 還需要一套解剖刀。剝離莖尖時，應(yīng)盡快接種還需要一套解剖刀。剝離莖尖時，應(yīng)盡快接種，莖尖暴露的時間應(yīng)當(dāng)越短越

11、好，莖尖暴露的時間應(yīng)當(dāng)越短越好， 以防莖尖變干。以防莖尖變干?？稍谝粋€襯有無菌濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行操作，有助可在一個襯有無菌濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行操作，有助于防止莖尖變干。于防止莖尖變干。 一般來說，莖尖分生組織由和其它器官的培養(yǎng)一般來說，莖尖分生組織由和其它器官的培養(yǎng)一樣，一樣， 在進(jìn)行莖尖培養(yǎng)時，首要一步是獲得表面在進(jìn)行莖尖培養(yǎng)時，首要一步是獲得表面不帶病原菌的外植體。不帶病原菌的外植體。 一般來說，莖尖分生組織一般來說，莖尖分生組織由于有彼此重疊的葉原基的嚴(yán)密保護(hù)，只要仔細(xì)解由于有彼此重疊的葉原基的嚴(yán)密保護(hù)，只要仔細(xì)解剖，無須表面消毒就應(yīng)當(dāng)能得到無菌的外植體。剖，無須表面消毒就應(yīng)當(dāng)能得到無

12、菌的外植體。 有時消毒處理僅會增加培養(yǎng)物的污染率。選取莖尖有時消毒處理僅會增加培養(yǎng)物的污染率。選取莖尖前，可把供試植株種在無菌的盆土中，前，可把供試植株種在無菌的盆土中， 放在溫室放在溫室中進(jìn)行栽培。澆水時要直接澆在土壤中而不要澆在中進(jìn)行栽培。澆水時要直接澆在土壤中而不要澆在葉片上。葉片上。 另外，最好還要給植株定期噴施內(nèi)吸殺另外，最好還要給植株定期噴施內(nèi)吸殺菌劑，可用多菌靈菌劑，可用多菌靈(0.1%) 和抗生素（如和抗生素（如0.1%鏈霉鏈霉素）。對于某些田間種植的材料，可以切取插條插素）。對于某些田間種植的材料，可以切取插條插入入Knop溶液中令其長大，溶液中令其長大， 由這些插條的腋芽長

13、由這些插條的腋芽長成的枝條，要比由田間植株上直接取來的枝條污染成的枝條，要比由田間植株上直接取來的枝條污染小得多。小得多。 于有彼此重疊的葉原基的嚴(yán)密保護(hù)，只要仔細(xì)于有彼此重疊的葉原基的嚴(yán)密保護(hù)，只要仔細(xì)解剖，無須表面消毒就應(yīng)當(dāng)能得到無菌的外植體。解剖，無須表面消毒就應(yīng)當(dāng)能得到無菌的外植體。 有時消毒處理僅會增加培養(yǎng)物的污染率。選取莖有時消毒處理僅會增加培養(yǎng)物的污染率。選取莖尖前，可把供試植株種在無菌的盆土中，尖前，可把供試植株種在無菌的盆土中， 放在溫放在溫室中進(jìn)行栽培。澆水時要直接澆在土壤中而不要澆室中進(jìn)行栽培。澆水時要直接澆在土壤中而不要澆在葉片上。在葉片上。 另外，最好還要給植株定期噴

14、施內(nèi)吸另外，最好還要給植株定期噴施內(nèi)吸殺菌劑，可用多菌靈殺菌劑，可用多菌靈(0.1%) 和抗生素（如和抗生素（如0.1%鏈鏈霉素）。對于某些田間種植的材料，可以切取插條霉素）。對于某些田間種植的材料，可以切取插條插入插入Knop溶液中令其長大，溶液中令其長大， 由這些插條的腋芽由這些插條的腋芽長成的枝條，要比由田間植株上直接取來的枝條污長成的枝條，要比由田間植株上直接取來的枝條污染小得多。染小得多。 LifeLife Science Science & Plant& Plant Tissue Culture Tissue Culture 為了保險起見，在切取外植體之前一般仍須對

15、莖芽進(jìn)行表為了保險起見，在切取外植體之前一般仍須對莖芽進(jìn)行表面消毒。葉片包被嚴(yán)緊的芽，如菊花，蘭花，只須在面消毒。葉片包被嚴(yán)緊的芽，如菊花，蘭花，只須在75%酒精酒精中浸蘸一下，而葉片包被松散的芽，如香石竹，蒜和馬鈴薯等中浸蘸一下，而葉片包被松散的芽，如香石竹，蒜和馬鈴薯等，則要用，則要用0.1%次氯酸鈉表面消毒次氯酸鈉表面消毒10分鐘。對于這些消毒方法分鐘。對于這些消毒方法，在工作中應(yīng)靈活運(yùn)用，如在大蒜莖尖培養(yǎng)時，可將小鱗莖在，在工作中應(yīng)靈活運(yùn)用，如在大蒜莖尖培養(yǎng)時，可將小鱗莖在75%酒精中浸蘸一下，再用燈火燒掉酒精，然后解剖出無菌莖酒精中浸蘸一下，再用燈火燒掉酒精，然后解剖出無菌莖芽。芽。

16、 在剖取莖尖時，把莖芽置于解剖鏡下，一手用細(xì)鑷子將在剖取莖尖時，把莖芽置于解剖鏡下，一手用細(xì)鑷子將其按住，另一手用解剖針將葉片和葉原基剝掉，解剖針要常其按住，另一手用解剖針將葉片和葉原基剝掉，解剖針要常常蘸入常蘸入90%酒精，并用火焰灼燒以進(jìn)行消毒。但要注意解剖酒精，并用火焰灼燒以進(jìn)行消毒。但要注意解剖針的冷卻，可蘸入無菌水進(jìn)行冷卻。當(dāng)一個閃亮半圓球的頂針的冷卻，可蘸入無菌水進(jìn)行冷卻。當(dāng)一個閃亮半圓球的頂端分生組織充分暴露出來之后，用解剖刀片將分生組織切下端分生組織充分暴露出來之后，用解剖刀片將分生組織切下來，為了提高成活率，可帶來，為了提高成活率，可帶12枚幼葉，然后將其接到培養(yǎng)枚幼葉，然后

17、將其接到培養(yǎng)基上?；稀?接種時確保微莖尖不與其他物體接觸，只用解剖針接種時確保微莖尖不與其他物體接觸，只用解剖針接種即可。接種即可。將接處好的莖尖置于將接處好的莖尖置于22左右的溫度。每天左右的溫度。每天16小時小時20003000Lx的光照條件下培養(yǎng)。由于在低溫和短日照下，莖尖的光照條件下培養(yǎng)。由于在低溫和短日照下，莖尖有可能進(jìn)入休眠；所以較高的溫度和充足的日照時間必須保有可能進(jìn)入休眠；所以較高的溫度和充足的日照時間必須保證。微莖尖需數(shù)月培養(yǎng)才能成功。證。微莖尖需數(shù)月培養(yǎng)才能成功。LifeLife Science Science & Plant& Plant Tissue

18、Culture Tissue Culture 四、影響微莖尖培養(yǎng)的因素四、影響微莖尖培養(yǎng)的因素外植體大小外植體大小 在最適培養(yǎng)條件下，外植體的大小決定莖尖的存活率，外在最適培養(yǎng)條件下，外植體的大小決定莖尖的存活率，外植體越大，產(chǎn)生再生植株的機(jī)會也就越多，而外植體越小脫毒植體越大，產(chǎn)生再生植株的機(jī)會也就越多，而外植體越小脫毒效果越好。除了外植體的大小之外，葉原基的存在與否也影響效果越好。除了外植體的大小之外，葉原基的存在與否也影響分生組織形成植株的能力，一般認(rèn)為，葉原基能向分生組織提分生組織形成植株的能力，一般認(rèn)為，葉原基能向分生組織提供生長和分化所必需的生長素和細(xì)胞分裂素。在含有必要的生供生長和分化所必需的生長素和細(xì)胞分裂素。在含有必要的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基中，離體頂端分生組織能在組織重建過程長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基中，離體頂端分生組織能在組織重建過程中迅速形成雙極性兩端。中迅速形成雙極性兩端。 LifeLife Science Science & Plant& Plant Tissue Culture Tissue Culture 培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件 在莖尖培養(yǎng)中，照光培養(yǎng)的效果通常比暗培養(yǎng)好