體外診斷試劑膠乳比濁法學習

1、膠乳免疫比濁法相關知識很多公司開展了熒光膠乳免疫層析做定量分析及膠乳增強免疫比濁分析項目，關注膠乳標記技術的技術人員越來越多。本人總結了部分膠乳微球標記技術，并加以分類，以便朋友們查閱：膠乳微球物理吸附：反應微球帶磺酸基、羧基、醛基表面的都是疏水微球，都可以用來設計被動吸附蛋白?；撬峄⑶虮砻婧瑤в胸撾姾傻幕撬峄鶊F，pka大約為2,因此在酸性pH保持穩(wěn)定。醛基微球表面也帶有磺酸基團，但能和蛋白行程共價鍵。羧基微球表面含帶負電荷的羧基基團，在以上時保持穩(wěn)定。帶有疏水基團的蛋白的吸附和配位結合，是最簡單和直接的標記方法。這種方法中，微球溶液和含目標蛋白的溶液混合，反應后，未結合的游離蛋白通過清洗步

2、驟除去，從而獲得膠體蛋白復合物。疏水吸附方法只能用于疏水微球(硫酸鹽、羧基、醛基表面修飾的微球)。醛基表面修飾微球是一個特例，其疏水吸附結果取決于后來的共價結合。雖然物理吸附是不依賴pH的，但反應緩沖液的 pH對蛋白的結構有非常大的影響，從而影響蛋白吸附到微球上的反應效率。一般，在被吸附蛋白等電點附近pH時，物理吸附效率會很高。反應步驟：1. 用反應緩沖液系數(shù)蛋白到10mg/ml；2. 用反應緩沖液系數(shù)膠乳微球到1%；3. 將蛋白溶液加入到膠乳微球溶液中，10ml膠乳中加入1ml蛋白溶液。室溫攪拌孵育2hr；4. 離心或超濾，除去未結合蛋白；5. 將微球蛋白復合物用儲存緩沖液溶解。注意事項：1

3、. 最優(yōu)蛋白標記量影響因素1) 有效比表面積：粒徑減小時，比表面積/mg微球值得增加；2) 膠體穩(wěn)定性：蛋白對膠乳有穩(wěn)定和去穩(wěn)定作用；3) 免疫反應：最近標記量由免疫反應需要決定。2. 膠乳微球中加入蛋白后，快速攪拌混合，利于反應均衡。反應體積是1ml 時，可用移液器吸取蛋白加入微球中，并吹打數(shù)次。如果反應體積較大時，用燒杯，邊攪拌邊加入蛋白，3. 儲存緩沖液和反應緩沖液不同時，抗體有脫落的可能；4. 表面活性劑能使得抗體從膠乳中脫落，所以應避免加入。微球共價結合抗體方法：一、一步法1. 準備 50mM pH 的 reaction buffer ，醋酸或MES buffer 更合適2. 用 r

4、eaction buffer 溶解抗體，使其濃度為1mg/mL。3. 用 reaction buffer 懸浮微球，使其濃度為1% w/v4. 邊攪拌邊將一倍體積的抗體溶液加入到10 倍體積的微球懸液中，室溫下持續(xù)攪拌20 分鐘5. 準備濃度為10mg/ml (52umol/mL)的EDC§液，用前準備，現(xiàn)配現(xiàn)用。6. 將計算需求量的EDC溶液加入到上述微球懸液中。(Note 6).7. 室溫下，立即調節(jié)pH (Note 7).8. 移除未結合的蛋白，并將包被微球用storage buffer 重懸。 (Note 3 and 4)B. 兩步法為了避免EDC各相鄰微球之間的蛋白偶聯(lián)導致

5、微球聚集或者蛋白之間交流，兩步法偶聯(lián)抗體更合適。兩步法中，在蛋白加入之前，多余的EDC被移除。兩步法中，蛋白也可以使用更高pH的buffer來溶解，從蛋白的穩(wěn)定性方面和加速蛋白和活化微球之間的交聯(lián)速度方便考慮，是非常有利的。B1 簡單一步法：1. 準備50mM pH的活化buffer ,醋酸或MES buffer更合適；用活化 buffer 懸浮微球，使其濃度為1% w/v2. 每ml微球懸yO口入20mg的EDC室溫孵育20分鐘，然后再次加入 20mg/mL的EDC繼續(xù)室溫孵育20 分鐘。 (Note 7).3. 離心或超濾，用等體積的包被緩沖液清洗兩次微球，最后懸浮在包被緩沖液中。(Not

6、e 3).4. 用包被緩沖液溶解抗體到1mg/mL包被緩沖液pH79,濃度為50mM100mM(Note 1)5. 將抗體快速加入的攪拌中的微球懸液中，持續(xù)攪拌，室溫孵育25 小時。 (Note 2).6. 每 ml 反應溶液中加入的乙醇胺，持續(xù)攪拌并室溫孵育10 分鐘。 (Note 9).7. 離心或超濾，用儲存緩沖液懸浮，重復兩次，移除未結合的抗體和乙醇胺。(Note 3 and 4)B2. NHS 中間活化酯兩步法在此方法中，在EDA僅在下，NHSS過與微球上的竣基反應形成中間活化酯?；罨ケ菶DC更穩(wěn)定，不易水解。1. 每 ml 反應混合物加入以下成分：加入DI皿 定容最終體積為1ml

7、;10X 的 MES buffer , (10X 的 buffer 通常用)；10%的微球( 終濃度為1%)；NHS 水溶液(50mg/mL) ;一定體積的ml(100mM)的EDACK溶液；2. 室溫下攪拌反應1530min；(Note7)3. 清洗：MES buffer 或 DIW清洗兩次；(Note3);4. 用DIW沖懸浮微球到濃度為1%5. 同時，用包被buffer溶解稀釋抗體。buffer 一般為ph79, 50mM100mM最終的蛋白濃度 1mg/mL;6. 清洗完微球后，立即加入一定體積的抗體溶液。(Note 2 )。(注意：此處給出的例子，微球濃度和蛋白濃度和buffer 分

8、別為%( w/v)，mL， 2550mM) ;7. 室溫下攪拌孵育2hr；8. 每 ml 反應液中加入乙醇胺，室溫攪拌孵育1030min；9. 清洗： storage buffer 清洗兩次。(Note 3/4 )NOTES:1. reaction buffer 的組成根據(jù)蛋白種類的不同而改變，常用buffer 有醋酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、MES緩沖液。蛋白在等電點附近更易于吸附到微球上，因為在等電點附近，蛋白表面會有更多的疏水位點暴露出來。在這種情況下，抗體也更緊密，因此需要更多的抗體用于標記到微球上。然而，最終 reaction buffer 的選擇，需要考慮最終抗體微球復合

9、物的生物活性，因此，幾個不同濃度的抗體和不同pH的反應buffer應該進行優(yōu)化選擇。起始實驗，反應 buffer的離子強度應該在 2550mM2. 蛋白溶液應該在快速的攪拌下，快速加入到微球懸液中。小體積的話，可以進行斡旋混合。當大體積時，應該在燒瓶或燒杯里攪拌劇烈些，蛋白溶液快速加入到漩渦中間。3. 移除未結合的化合物或蛋白，如果顆粒直徑大于，可以通過離心的方法，微球可以重新懸浮，然后攪拌，接著溫和的超聲分散。離心力不宜過大，這樣會導致微球不易分散。也可以用超濾或透析來純化。當用超濾時，濾膜孔徑應該足夠大，使得游離的蛋白能自由的通過濾膜。用于清洗微球的buffer 應該和storage bu

10、ffer 一樣。用于清洗的 buffer的任何緩沖液成分及 pH的改變，都會引起蛋白的脫落。4. 微球包被抗體后，加入表面活性劑或者去污活性成分，可能會導致抗體脫落。如果是共價結合到微球上，共價結合的抗體就不會有脫落現(xiàn)象發(fā)生。封閉蛋白，像BSA， casein 或 gelatin 可以用來封阻任何空余的疏水性位點，防止微球發(fā)生非特異性凝集。但是表面活性劑可以將那些共價結合不牢固的抗體洗脫下來。5. 此試劑和水反應，因此，溶解后應立刻使用掉。6. EDC的用量，根據(jù)微球表面竣基濃度來計算。根據(jù)計算所需量，每mol的竣基應該再多加23mol的EDC但是，根據(jù)功能性檢測結果，還需要進一步的優(yōu)化。7.

11、 此步驟，微球的凝集經(jīng)常能觀察到。因為接下來的步驟中，EDC會將相鄰兩個微球上的抗體連接起來從而引起微球凝集或者中和微球表面的竣基或者兩者情況都發(fā)生。調節(jié)pH到或超過，優(yōu)化共價反應，對微球的分散有幫助。如果反應結束后微球凝集現(xiàn)象仍然發(fā)生，用新鮮的buffer清洗除去多余的EDCW游離的蛋白，一般會使得凝集顆粒再分散。如果在最終的產(chǎn)品中凝集依然發(fā)生，嘗試稀釋微球，一開始可以稀 釋到原來的50%濃度。如果稀釋后凝集依然發(fā)生，可以嘗試在所有reaction buffer 中加入 Tween20 或Tergitol NP9 等非離子型表面活性劑。這些表面活性劑不會干擾顆粒的活性或共價結合，但是需要注意

12、的 是，要確保在這種去污劑存在下微球共價結合的抗體的穩(wěn)定。9. 加入乙醇胺，可以和加入蛋白反應后多余的羧基位基團反應。 膠乳標記過程中常見問題： 1）問題：蛋白無法吸附到微球上。解決方法：加入更多的蛋白；去除微球中的表面活性劑，釋放其占據(jù)的蛋白結合位點；引入中間物，將微 球與蛋白相連；改變緩沖液。 2）問題：標記時加入了大量的蛋白，但是仍然無活性。 解決方法：改變蛋白加入量，從而改變蛋白與微球結合的空間構象；使用表位稀釋物，占據(jù)微球上的部分 蛋白結合位點，防止蛋白靠的太近。 3）問題：清洗去除未吸附蛋白后，微球聚集。 解決方法：增加蛋白標記量或封閉劑的用量，防止有空余位點； 4）問題：標記后開

13、始活性很好，儲存一段時間后，活性降低。解決方法：降低儲存溫度到28 度；降低儲存液中的封閉劑濃度，防止抗體被替換；確認儲存液中無能與抗體競爭的雜質，防止長時間取代抗體。5） PS微球與蛋白（抗體）交聯(lián)后，當時沒發(fā)現(xiàn)有凝集，但隔夜后發(fā)現(xiàn)有凝集 是偶聯(lián)效率低的原因。當體系蛋白不足或是其它原因，使微球表面在交聯(lián)后還空出許多反應基團時，由于這些基團又可以與相連微球上的蛋白反應，結果是把球又拉在一起了，所以有聚集。可以加一些blockeragents解決，常見的是BSA另外，也可提高微球的交聯(lián)率。 但為什么是過一段時間后才出現(xiàn)凝集呢，這是因為微球偶聯(lián)上蛋白后，相互之間由于攜帶同種電荷的關系，比較穩(wěn)定（所

14、以能以膠體樣存在），只有當偶爾相互碰撞，遇上彼此的反應基團時才能結合。6）抗體偶聯(lián)至竣基 PS球，即時檢測效果很好，但置于 37度2天后，抗體活性似乎下降很大?？赡芄矁r結合未成功，如果是這樣，那么最主要的原因是EDAC質量差或過期了。 EDAC長期放在空氣中會吸潮，水汽會降低EDAO性。另一個可能原因是凝集。觀察膠乳是否有凝集產(chǎn)生。 還有，交聯(lián)蛋白前有沒有清洗我們提供的膠乳緩沖液中含有表面活性劑，可能干擾抗體的結合。如果未發(fā) 生凝集，而且用前已經(jīng)清洗，那么我們建議換新的EDAC。7） EDCM化竣基乳膠微球后，加蛋白（抗體）即時有沉淀出現(xiàn)，是什么原因 很多因素可以導致蛋白加入后，微球聚集成塊。

15、通常，蛋白偶聯(lián)前的聚集與緩沖液（電解質）有關?？赡苁强⒒鶝]有活化好。EDC質量出現(xiàn)問題了，請換質量好的再嘗試。如果沒有好的 EDC可以適當調低活 化緩沖液的pH 值。對非修飾微球，那么可以從以下方面著手解決： 絕大多的微球制備過程中，加有脂肪酸乳化劑。在聚合時，它起乳化作用，在聚合后，它起穩(wěn)定劑作用， 使微球以膠體樣分布。在堿性pH下，微球表面的COOH脂肪酸分子上的 COO以及聚苯乙烯多聚鏈末端的硫酸*g （ SO42-）使微球表面帶負電荷，親水性增強，從而能形成穩(wěn)定的膠體。由緩沖液導致的聚集可以通過加蛋白，陰離子乳化劑，非離子乳化劑（如Triton X-100 和 Tween-20）。下列方法供參考：a) 加入蛋白前，加少量的乳化劑。具體量可以自己摸索掌握，太多