基于SRAP分子標(biāo)記的石斛蘭種質(zhì)資源遺傳多樣性分析.doc

1、基于SRAP分子標(biāo)記的石斛蘭種質(zhì)資遺傳多樣性分析p 【摘要】：p ：為合理利用石斛蘭種質(zhì)資，用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對48份石斛蘭種質(zhì)資的遺傳多樣性進(jìn)行分析p 。結(jié)果顯示：篩選得到的14對石斛蘭SRAP引物共擴(kuò)增出159個條帶，其中多態(tài)性條帶數(shù)為155個，各引物的多態(tài)性比率為90.00100.00，多態(tài)性信息含量為0.7180.903，表明石斛蘭SRAP的多態(tài)性信息含量較為豐富。聚類分析p 結(jié)果發(fā)現(xiàn)48個石斛蘭品種間的遺傳距離在0.150.97，在遺傳距離為0.83處可將48個石斛蘭品種分為7大聚類群，說明供試的石斛蘭品種間具有十分豐富的遺傳多樣性。【關(guān)鍵詞】：p ：石斛蘭；SRAP；多態(tài)性；遺

2、傳多樣性中圖分類號：S 682.31文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1008-0384（20_）05-469-05Abstract： SRAP molecular markers were used to access the geic diversity of 48 Dendrobium germplasms.Using 14 pairs of selected primers， 159 bands were lified.Of the bands， 155 were polymorphic.The polymorphism rate was 90-100 per primer， and the i

3、nformation content in the markers ranged abundantly from 0.718 to 0.903.Cluster analysis showed the geic distances among the 48 cultivars to be 0.15-0.97.At the distance of 0.83， the germplasms could be classified into 7 groups.The results showed a rich geic diversity among the germplasms.Key words：

4、 Dendrobium； SRAP； polymorphism； geic diversity石斛蘭Dendrobium，是蘭科石斛屬多年生草本植物。其花姿優(yōu)雅，花色鮮艷，花期長，觀賞價值極高，與卡特蘭、蝴蝶蘭、萬代蘭并列為觀賞蘭花的“四大天王”1。石斛蘭不僅是重要的切花和盆栽園藝品種，部分石斛蘭品種同時也是珍貴的中藥材2，其中金釵石斛、鐵皮石斛、馬鞭石斛及其近似種還被收錄在中國藥典中。在中藥及觀賞花卉產(chǎn)業(yè)，對品種準(zhǔn)確的鑒定顯得尤為必要，這是保證藥用石斛安全性和觀賞石斛新品種選育的重要前提3。但是由于石斛蘭的產(chǎn)地不同，用途廣泛，存在著同名異物和同物異名的現(xiàn)象，僅僅依靠形態(tài)學(xué)鑒定是不夠的，因此需

5、要借助更為準(zhǔn)確穩(wěn)定的方法對不同品種石斛蘭進(jìn)行有效的鑒定。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)因其方法相對簡便、多態(tài)性高且不受生長環(huán)境影響等眾多優(yōu)點(diǎn)，成為目前種質(zhì)資鑒定的高效技術(shù)手段之一4。序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性（Sequence-related lified polymorphism，SRAP）標(biāo)記是一種通過獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)對開放閱讀框（Open readings frames， ORFs）進(jìn)行擴(kuò)增的新型分子標(biāo)記，吸收了RFLP、RAPD、SSR和AFLP等分子標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，具有操作過程簡單、擴(kuò)增條帶清晰、結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性高等特點(diǎn)5，目前已廣泛應(yīng)用于國蘭6、雜交蘭7、甘薯8、紅花屬9、花椒10、蕓薹

6、屬11等多種植物種質(zhì)鑒定、重要性狀標(biāo)記、遺傳多樣性及遺傳圖譜構(gòu)建等研究中。在石斛屬植物中也有SRAP分子標(biāo)記被利用的研究報道，如鐵皮石斛及其相似種的鑒定分析p 12、經(jīng)輻射后的石斛蘭組培苗的檢測分析p 13、不同來地鐵皮石斛的遺傳變異和保護(hù)研究14，但有關(guān)該標(biāo)記應(yīng)用于石斛蘭種質(zhì)資多樣性的研究還相對較少。本研究利用SRAP分子標(biāo)記對包括藥用石斛和觀賞石斛在內(nèi)的48份品種資進(jìn)行分析p ，以期從分子水平確定石斛蘭種質(zhì)資親緣關(guān)系，為石斛蘭品種鑒定、品種保護(hù)及后期的雜交育種提供理論依據(jù)，從而推動石斛資更深層的開發(fā)利用。1材料與方法1.1試驗(yàn)材料供試的48份石斛蘭品種（表1）來于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所

7、蘭花種質(zhì)資圃。1.2試驗(yàn)方法1.2.1石斛蘭葉片DNA的提取選取各份供試材料的新鮮葉片約0.5 g，采用改良CTAB法15進(jìn)行總DNA的提取，提取完成后，利用分光光度計(jì)法檢測其濃度，1瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，產(chǎn)物于-20條件下保存?zhèn)溆谩?.2.2石斛蘭SRAP-PCR擴(kuò)增參考Budak等16的引物，由10條正向引物和10條反向引物，隨機(jī)組成100對引物組合。PCR反應(yīng)體系的總體積為25 L，其中含有100 ng·L-1的模板DNA 1.0 L，10 mol·L-1 的上、下游引物各1.0 L，含Mg2+的Buffer 2.5 L，2.5 mmol·L-1的dN

8、TPs 2.0 L， 5 U·L-1 的Taq 聚合酶 0.25 L，ddH2O 17.25 L。PCR 擴(kuò)增程序參照鐘淮欽等7的研究，采用變溫復(fù)性反應(yīng)程序。程序結(jié)束后，利用2.5瓊脂糖凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，觀察電泳圖譜并拍照保存。1.3數(shù)據(jù)分析p 根據(jù)電泳圖譜，利用人工方法進(jìn)行DNA條帶數(shù)的統(tǒng)計(jì)，在相同遷移位置上有擴(kuò)增條帶的標(biāo)記為1，無條帶的則記為0，并構(gòu)建原始數(shù)據(jù)矩陣。應(yīng)用NTSYS- pc2.10e軟件進(jìn)行聚類分析p ，獲得聚類圖；利用E_CEL軟件計(jì)算引物的多態(tài)性比率和多態(tài)性信息含量（PIC）。2結(jié)果與分析p 2.1石斛蘭SRAP標(biāo)記引物的篩選將提取獲得的48份石斛蘭品種DN

9、A稀釋至相同濃度備用，并隨機(jī)選擇其中的2份樣本進(jìn)行100對SRAP引物的初步篩選，篩選出32對能擴(kuò)增出明顯條帶的引物。而后，利用48份石斛蘭品種DNA樣本進(jìn)行SRAP引物的進(jìn)一步篩選，以明確初步篩選引物對其他石斛蘭品種的可用性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在32對初篩選引物中有14對引物的擴(kuò)增條帶清晰且多態(tài)性豐富。圖1為引物組合Me1+Em8的擴(kuò)增結(jié)果。2.2SRAP標(biāo)記的多態(tài)性分析p 對篩選出來的14對SRAP引物在48份石斛蘭種質(zhì)資中的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析p 發(fā)現(xiàn)（表2），在所有供試材料中共獲得159個條帶，平均每對引物擴(kuò)增11.4個條帶；獲得多態(tài)性條帶數(shù)為155個，引物組合Me1+Em8擴(kuò)增的多態(tài)性條帶數(shù)最多

10、，為15個，緊隨其后的是引物組合Me1+Em2的14個多態(tài)性條帶和引物組合Me3+Em4的13個多態(tài)性條帶，而引物組合Me3+Em6僅擴(kuò)增到7個多態(tài)性條帶，平均每對引物擴(kuò)增到11.1個多態(tài)性條帶。各引物的多態(tài)性比率分布為90.00100.00，除了引物組合Me4+Em2、Me7+Em2、Me10+Em2及Me10+Em8外，其他引物組合的多態(tài)性比率均為100.00。對14對SRAP引物的多態(tài)性信息含量分析p 結(jié)果顯示，其分布范圍為0.7180.903，每對引物平均多態(tài)性信息含量為0.828，引物組合Me6+Em10的多態(tài)性信息含量最高，而引物組合Me4+Em2的多態(tài)性信息含量最低（表2）。以上

11、結(jié)果表明石斛蘭SRAP的多態(tài)性信息含量較為豐富。2.348份石斛蘭品種資的聚類分析p 以E_CEL中記錄的0，1型數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，利用NTSYS- pc2.10e軟件，構(gòu)建48份石斛蘭品種資的聚類圖（圖2）。結(jié)果顯示，48份石斛蘭品種間的遺傳距離為0.150.97，其中，秋石斛D20_127品種和秋石斛D20_128品種的親緣關(guān)系最近。在遺傳距離為0.83處，48個石斛蘭品種分為7大聚類群：第類包括13個品種，有鼓槌石斛、流蘇石斛、鐵皮石斛、細(xì)莖石斛、金釵石斛、霍山石斛、晶帽石斛、腫節(jié)石斛、黃喉石斛、蜂腰石斛、玫瑰石斛、球花石斛及血喉石斛，這些品種中包括了幾種較為常見的藥用石斛；第類包括3個品種，

12、有紅蜻蜓石斛、金果石斛和紅燈籠石斛；第類有4個品種，為檀香石斛、麝香石斛、叉唇石斛、本斯石斛；第類含4個品種，其中有黃橙石斛、曲軸石斛、澳洲石斛、董黑毛石斛；第類有15個品種，秋石斛D46、長蘇石斛、秋石斛D20_129、秋石斛D20_123、秋石斛-三亞陽光、秋石斛-水晶、秋石斛-出水芙蓉、秋石斛-畫眉、秋石斛-櫻桃紅、秋石斛-紅粉佳人、秋石斛D20_121、秋石斛D20_114、秋石斛-TretesMoon、秋石斛D20_127、秋石斛D20_128、黃貝殼石斛、秋石斛D20_117及亮葉石斛；第類為報春石斛、兜唇石斛和重唇石斛；第類為密花石斛、扭瓣石斛和劍葉石斛。3討論與結(jié)論遺傳多樣性是

13、生物多樣性的核心內(nèi)容，是生命進(jìn)化和物種分化的基礎(chǔ)，為研究物種的遺傳基礎(chǔ)、品種鑒定、親本優(yōu)選等提供理論依據(jù)。石斛蘭除了具有觀賞價值外，部分品種還兼具高藥用價值和經(jīng)濟(jì)價值，了解該種質(zhì)資的遺傳多樣性，不僅能夠緩解目前交易市場中商品石斛品種混亂的現(xiàn)象，還能推動石斛資更深層的開發(fā)利用和保護(hù)，具有現(xiàn)實(shí)的指導(dǎo)意義。分子標(biāo)記由于能夠直接反映基因組DNA間的差異，且不受環(huán)境的限制，具有多態(tài)性高、共顯性等特點(diǎn)，從而在石斛屬植物中得到廣泛應(yīng)用。徐蕾等17利用SSR標(biāo)記對36份來自不同產(chǎn)地的鐵皮石斛進(jìn)行遺傳多樣性分析p ，結(jié)果表明SSR標(biāo)記的多態(tài)位點(diǎn)百分率為97.19，中國鐵皮石斛品種具有較高的遺傳多樣性。宋爽等18

14、利用ISSR和AFLP兩種分子標(biāo)記對51個藥用石斛材料進(jìn)行遺傳多樣性研究，其中ISSR標(biāo)記的多態(tài)條帶比率高達(dá)100，AFLP標(biāo)記的多態(tài)性比率達(dá)99.52，二者均能有效地將研究材料分開，均適用于石斛植物的遺傳多樣性研究。張楊等19的研究表明RAPD分子標(biāo)記的多態(tài)性比率為93.81，且該技術(shù)能夠較好地從分子水平方面反映金釵石斛、鐵皮石斛和齒瓣石斛這3種石斛屬植物的遺傳背景和親緣關(guān)系。周麗等20采用SRAP標(biāo)記分析p 了包括黔西南州野生鐵皮石斛在內(nèi)的23種相關(guān)種類石斛的遺傳多樣性，結(jié)果顯示多態(tài)性位點(diǎn)占比97.32，且聚類分析p 結(jié)果與植物學(xué)形態(tài)分類結(jié)果統(tǒng)一。樊洪泓等21將SRAP技術(shù)應(yīng)用于藥用石斛的

15、遺傳多樣性及親緣關(guān)系的研究中，證明了其有效性。本研究利用SRAP分子標(biāo)記對48份石斛蘭品種資的遺傳多樣性進(jìn)行分析p ，結(jié)果顯示，篩選得到的14對引物共擴(kuò)增出159個條帶，其中多態(tài)性條帶為155個，多態(tài)性比率為97.5，平均每對引物擴(kuò)增到11.1個多態(tài)性條帶，平均引物多態(tài)性信息含量為0.828。由此可見，在石斛蘭的遺傳多樣性研究中，SRAP標(biāo)記具有較為豐富的多態(tài)性信息含量。此外，聚類分析p 結(jié)果顯示，48份石斛蘭品種間的遺傳距離變化范圍在0.150.97，說明供試的石斛蘭品種間具有十分豐富的遺傳多樣性，也表明利用SRAP標(biāo)記進(jìn)行石斛蘭種質(zhì)資遺傳多樣性的分析p 是完全可行的。本研究結(jié)果還表明，SR

16、AP標(biāo)記能夠較好地將供試的48份石斛資區(qū)分開。48份樣品聚類分析p 結(jié)果顯示，晶帽石斛與腫節(jié)石斛的親緣關(guān)系較近，銅皮石斛與金釵石斛的親緣關(guān)系較近，報春石斛與兜唇石斛的親緣關(guān)系較近，這與中國植物志中的分類結(jié)果相吻合。在遺傳距離為0.83處，48個石斛蘭品種可以分為7大聚類群。在第聚類群中，相較于鐵皮石斛，霍山石斛與金釵石斛和銅皮石斛的親緣關(guān)系更近，這一結(jié)論與樊洪泓等21的研究結(jié)果一致；第聚類群中包含了供試材料中的大部分秋石斛品種，秋石斛是花期在秋天的熱帶洋蘭的統(tǒng)稱，大部分品種是以蝴蝶石斛為親本育成的雜交品種，與其他石斛的遺傳距離較遠(yuǎn)，說明SRAP的分類結(jié)果與種質(zhì)資的遺傳背景有一定的相關(guān)性。第聚類

17、群中，檀香石斛和麝香石斛均有紫紅色花和濃郁香氣；第聚類群中的黃橙石斛、曲軸石斛和董黑毛石斛的花瓣分別為金黃色、橘黃色和淡黃色，為黃色系；第聚類群中報春石斛、兜唇石斛和重唇石斛的花瓣分別為淡玫瑰色、淡紫紅色以及淡粉紅色，為紅色系；說明SRAP的分類結(jié)果與種質(zhì)資的花色、花香等特性相關(guān)。上述結(jié)果說明SRAP可以較準(zhǔn)確地從分子水平反映出48份石斛蘭種質(zhì)資的遺傳差異，表明將SRAP標(biāo)記應(yīng)用于石斛蘭種質(zhì)遺傳多樣性分析p 效果良好?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】：p ：1吳高杰.石斛蘭離體培養(yǎng)條件優(yōu)化及其離體培養(yǎng)物的microRNA研究D.福州：福建農(nóng)林大學(xué)， 20_.2陳慧玲， 劉宗坤， 楊彥伶， 等.基于層次分析p 法的

18、藥用石斛種質(zhì)資評價J.西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報， 20_， 37（1）：82-87.3李杰， 章金輝， 朱根發(fā)， 等.石斛屬植物種質(zhì)資鑒定及指紋圖譜應(yīng)用研究進(jìn)展J.中國農(nóng)學(xué)通報， 20_， 29（16）：63-68.4林榕燕， 鐘淮欽， 黃敏玲， 等.文心蘭EST- SSR標(biāo)記的開發(fā)及其在遺傳多樣性分析p 中的應(yīng)用J.分子植物育種， 20_， 14（11）：3113-3119.5王志清， 劉繼永， 李昌禹， 等.利用ISSR和SRAP標(biāo)記分析p 細(xì)辛資遺傳多樣性與親緣關(guān)系J.植物遺傳資學(xué)報，20_，16（5）：1035-1044.6唐江， 曹雯靜， 吳坤林.基于SRAP標(biāo)記的國蘭種質(zhì)資遺傳多樣性分析p

19、 及分子身份證構(gòu)建J.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 20_， 48（9）：1795-1806.7鐘淮欽， 林榕燕， 黃敏玲， 等.雜交蘭種質(zhì)資遺傳多樣性的SRAP分析p J.福建農(nóng)業(yè)學(xué)報， 20_， 31（11）：1193-1197.8劉中華， 林志堅(jiān)， 李華偉， 等.甘薯蔓割病抗性相關(guān)SRAP標(biāo)記的獲得J.福建農(nóng)業(yè)學(xué)報， 20_， 32（6）：639-644.9MOKHTARI N， RAHIMMALEK M， TALEBI MAJID， et al.Assessment of geic diversity among and within Carthamus species using sequence

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21、p Evolution， 20_， 62（8）：1193-1204.11ZHANG _ J， CHEN H Y， CHANNA S A， et al.Geic diversity in Chinese and e_otic Brassica rapa L.accessions revealed by SSR and SRAP markersJ.Brazilian Journal of Botany， 20_， 40（4）：973-982.12李杰， 王再花.人工栽培鐵皮石斛與其相似種的SRAP分子標(biāo)記分析p J.中國農(nóng)學(xué)通報， 20_， 32（25）：79-83.13任羽， 潘丙成， 陸順教， 等.60Co-輻射石斛蘭組培苗的SRAP分析p J.中國農(nóng)學(xué)通報， 20_， 32（31）：85-89.14DING G， ZHANG D Z， DING _ Y， et al.VGeic variation and conservation of the endangered Chinese endemic herb Dendrobium officinale based on SRAP analysisJ.Plant Systematics and Evolution， 2021， 276（3-4）：149-156.15POREBSKI S， BAILEY G， BAUM B