橡膠樹(shù)1981’IRRDB野生種質(zhì)及栽培品系ITS序列多態(tài)性及其進(jìn)化分析.doc

1、橡膠樹(shù)1981IRRDB野生種質(zhì)及栽培品系ITS序列多態(tài)性及其進(jìn)化分析p 摘 要 本研究采用核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）標(biāo)記分析p 37份橡膠樹(shù)1981IRRDB野生種質(zhì)以及7份栽培品系的遺傳多樣性及其進(jìn)化關(guān)系，擬在DNA序列水平上了解野生種質(zhì)及栽培品系的遺傳背景，為保護(hù)、發(fā)掘和利用現(xiàn)有橡膠樹(shù)種質(zhì)資提供遺傳理論依據(jù)。在44份材料中，9份資種質(zhì)及1份栽培品系出現(xiàn)ITS基因雜合子現(xiàn)象，ITS序列長(zhǎng)度在583588 bp之間，G+C含量65.5267.17，共有87個(gè)變異位點(diǎn)。ITS核苷酸多樣性Pi值為0.011 6，其中ITS2的Pi值（0

2、.014 33）明顯高于ITS1（0.010 10）及5.8S（0.010 31），表明ITS2序列具有更快的進(jìn)化速率，更合適于橡膠樹(shù)遺傳多樣性及系統(tǒng)學(xué)研究。在34個(gè)單倍型中，單倍型H8位于網(wǎng)絡(luò)圖的中心，為最古老的高頻單倍型，其遺傳背景主要來(lái)自朗多尼亞州。NJ分子系統(tǒng)樹(shù)顯示大部分栽培品系（熱研7-20-59，RRIM600，熱研7-33-97，熱墾628，熱研88-13）與朗多尼亞州（Rodonia）部分種質(zhì)具有相似的遺傳背景。此外，中性檢測(cè)及單倍型網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果暗示本研究材料曾經(jīng)經(jīng)歷一個(gè)擴(kuò)張的歷史事件?！娟P(guān)鍵詞】：p 橡膠樹(shù)；野生種質(zhì)；栽培品系；ITS序列；遺傳多樣性中圖分類號(hào) S794.1 文

3、獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 AGeic Diversity and Phylogeic Evolution Among 1981IRRDBWild Germplasm and Cultivars Using ITSMarkers in Rubber TreeLONG _iangyu1， HE Bin2， WANG Chuang2， HU Yanshi1，QIN Yun_ia1， FANG Yongjun1， TANG Chaorong1 _1 Rubber Research Institute， CATAS， Danzhou， Hainan 571737， China2 College of Agronomy，

4、 Hainan University， Haikou， Hainan 570228， ChinaAbstract Using internal transcribed spacer（ITS）mark technology， 44 rubber trees including 37 wild germplasm of 1981IRRDB and 7 cultivars were used to investigate the geic diversity and phylogeic evolution.Nine wild germplasms and one cultivar presented

5、 heterozygosis of ITS sequence.The sequence length was 583-588 bp， and the G+C content was 65.52-67.17.There were 87 variable sites in the ITS sequence， and the nucleotide diversity of ITS2（0.014 33）was higher than that of ITS1（0.010 10）and 5.8 S（0.010 31）， shog that ITS2 was a more suitable choice

6、for geic diversity and phylogeic evolution.Haplotype analysis showed that H8 was an older and more frequent haplotype， and located in the center of the work graph.Five cultivars and parts of the wild germplasms from Rodonia had similar geic background， and cultivars included Reyan7-20-59， RRIM600， R

7、eyan 7-33-97， Reken 628 and Reyan 88-13.In addition， neutral test and work of haplotype implied that the trees had gone through an event of population e_pansion.Key words Rubber tree； Wild germplasm； Cultivar； ITS sequence； Geic diversitydoi 10.3969/j.issn.1000-2561.20_.12.001巴西橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensi

8、s），屬大戟科，橡膠樹(shù)屬高大喬木，是一種在世界經(jīng)濟(jì)和軍事發(fā)展中均扮演重要角色的熱帶樹(shù)種，其生產(chǎn)的天然橡膠是一種重要的工業(yè)原料和戰(zhàn)略物資。目前，中國(guó)天然橡膠的消費(fèi)量逐年增加，而中國(guó)天然橡膠的產(chǎn)量不及消費(fèi)量的1/5，需求缺口逐年加大1。中國(guó)適宜種植橡膠的面積有限，實(shí)際種植面積已達(dá)極限，已經(jīng)沒(méi)有擴(kuò)大種植面積來(lái)增加產(chǎn)量的空間，大幅度提高橡膠樹(shù)單位面積產(chǎn)量是一條適合中國(guó)橡膠事業(yè)發(fā)展和緩解天然橡膠供需矛盾壓力的可行性途徑。雜交育種一直是橡膠樹(shù)產(chǎn)量育種的常規(guī)方法，然而種質(zhì)資的匱乏，特別是狹窄的遺傳基礎(chǔ)勢(shì)必制約橡膠樹(shù)良種培育和產(chǎn)業(yè)發(fā)展，因此，世界各植膠國(guó)均認(rèn)識(shí)到橡膠樹(shù)種質(zhì)資材料的收集及評(píng)價(jià)的重要意義2-3。評(píng)

9、價(jià)種質(zhì)資材料遺傳多樣性有助于種質(zhì)資的保存及利用。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于橡膠樹(shù)遺傳多樣性分析p 和種質(zhì)資鑒定等研究4，如RAPD5，EST-SSR6-7，RFLP8，AFLP9，SNP等10。在眾多分子標(biāo)記中，核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer， ITS）是位于核糖體DNA（rDNA）上18 S和28 S之間的區(qū)域片段，主要包括內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1（ITS1）、5.8S rDNA、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2）。ITS1和ITS2作為非編碼區(qū)，承受的進(jìn)化選擇壓力較小，相對(duì)變化較大，可以提供豐富的信息位點(diǎn)，目前被廣泛應(yīng)用于植物進(jìn)化與系統(tǒng)

10、分析p 11-15，而ITS標(biāo)記在橡膠樹(shù)中的應(yīng)用未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用ITS序列分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)37份1981IRRDB種質(zhì)，以及7份栽培品系，共44份橡膠樹(shù)材料的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析p ，擬在DNA序列水平上探討種質(zhì)資以及栽培材料之間的進(jìn)化關(guān)系和遺傳背景，為橡膠樹(shù)種質(zhì)資的保護(hù)與利用及橡膠樹(shù)遺傳育種提供理論依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料44份供試橡膠樹(shù)材料收集于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所國(guó)家橡膠樹(shù)種質(zhì)資圃，其中包括37份1981IRRDB種質(zhì)，種質(zhì)主要來(lái)于巴西亞馬遜河流區(qū)域阿克里州（Acre），馬托格羅索州（Mato Grosso）和朗多尼亞州（Rodonia）3個(gè)州，以及7份栽培品

11、種（RRIM600，PR107，熱墾628，熱研7-33-97，熱研88-13，熱研7-20-59，93-114）（表1）。20_年6月，采集幼嫩葉片液氮凍存帶回實(shí)驗(yàn)室備用。1.2 方法1.2.1 DNA提取及質(zhì)量檢測(cè) 取冷凍保存的植物葉片，采用新型植物基因組提取試劑盒（天根生化科技有限公司，DP320）提取葉片DNA，并利用0.8的瓊脂糖凝膠電泳及微量紫外分光光度計(jì)（Thermo Scientific，Nanodrop 20_）檢測(cè)DNA濃度與純度，-20 保存?zhèn)溆谩?.2.2 ITS區(qū)PCR擴(kuò)增 根據(jù)EBI（European Bioinformatics Institute）橡膠樹(shù)基因組數(shù)

12、據(jù)庫(kù)提供的ITS序列設(shè)計(jì)2對(duì)擴(kuò)增引物，分別為ITSa（ITSaF： 5-ACG TCG CGA GAA GTC CAT TGA ACC TT-3，ITSaR： 5-CCG ATT CTC AAG CTG GGC TCT TCC C-3）和ITSb（ITSbF： 5-GAG GAA GGA GAA GTC GTA ACA AAG TTT CCG T-3，ITSbR 5-GCT GAG GAC GCT TCT CCA GAC TAC AAT-3），2對(duì)引物擴(kuò)增相同ITS序列，引物由上海英俊生物工程技術(shù)有限公司合成。以44份材料DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25，2.5 L 10×

13、HiFi Buffer I（含Mg2+），2.5 mmol dNTPs 2 L，1 U HiFi DNA polymerase（北京全式金生物技術(shù)有限公司，Trans Tap TM DNA Polymerase High Fidelity），0.5 mol引物和50 ng模板DNA。反應(yīng)程序?yàn)?4 預(yù)變性4 min；94 變性30 s，68 退火延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 延伸10 min。采用2的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，利用ChemiDoc_RS+（Bio-Rad）成像系統(tǒng)觀察和拍照記錄。1.2.3 PCR產(chǎn)物的純化、克隆與測(cè)序 PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒（美國(guó)OMEGA）純化

14、回收后，連接pMD18-T載體（TaKaRa公司）并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)JM109（本實(shí)驗(yàn)室保存），LB培養(yǎng)基37 培養(yǎng)過(guò)夜，經(jīng)菌斑檢測(cè)后，每份材料選取5個(gè)陽(yáng)性克隆送至上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。1.3 數(shù)據(jù)分析p 采用DNAMAN 6.0.3.99軟件分析p 測(cè)序結(jié)果，確定ITS序列范圍，除去兩端非ITS序列部分。利用DnaSP 5.10.00軟件分析p 個(gè)體G+C含量，變異位點(diǎn)數(shù)（Variable，Vs），單倍型數(shù)目（Number of haplotypes，h），單倍型多樣性（Haplotype diversity，Hd），核苷酸多樣性（Nucleotide diversity，Pi），單

15、倍型多樣性方差（Variance of haplotype divversity，Vh），單倍型多樣性標(biāo)準(zhǔn)差（Standard deviation of haplotype diversity，Sh）以及中性檢測(cè)（Tajima"s D和Fu"s Fs）等遺傳多樣性指標(biāo)進(jìn)行計(jì)算。采用Mega 5.05軟件分析p 個(gè)體間的遺傳距離，并通過(guò)自展分析p （bootstrap）做置信度檢測(cè)，自展數(shù)據(jù)集為1 000次，鄰接法（Neighbor-joining）獲得系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。運(yùn)用Work ver 4.6.1.2軟件中介鄰接網(wǎng)絡(luò)（Median-Joinging work， MJ）算法構(gòu)建

16、ITS單倍型間關(guān)聯(lián)圖。2 結(jié)果與分析p 2.1 供試橡膠樹(shù)材料的ITS序列特征本研究利用ITS引物對(duì)37份橡膠樹(shù)種質(zhì)資材料及7份栽培材料rDNA-ITS區(qū)（包括部分18 S rDNA、ITS1、5.8 S rDNA、ITS2和部分26 S rDNA）進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序，去除18 S rDNA及26 S rDNA序列，最終得到54條ITS序列。在44份材料中，9份種質(zhì)資材料（80、84、92、93、94、104、109和122）以及1份栽培材料（熱研7-33-97）出現(xiàn)了ITS基因雜合子現(xiàn)象（a，b代表2個(gè)雜合子）。DnaSP軟件分析p 表明，ITS序列長(zhǎng)度在583588 bp之間，G+C含量6

17、5.5267.17（ITS1：長(zhǎng)度223228 bp，G+C含量65.1869.64；5.8 S：長(zhǎng)度162165 bp，G+C含量54.2757.93；ITS2：長(zhǎng)度194198 bp，G+C含量71.2874.87）（表2）。其中材料94的ITS序列最長(zhǎng)（588 bp），其次為熱研7-33-97（586 bp），G+C含量最高的材料為88（67.18），G+C含量最低的材料為122（65.52）。2.2 供試橡膠樹(shù)材料的ITS核苷酸多樣性和單倍型信息進(jìn)一步分析p 供試材料ITS序列，該序列存在87個(gè)變異位點(diǎn)（單變異位點(diǎn)57個(gè)），其中ITS1存在30個(gè)變異位點(diǎn)（單變異位點(diǎn)23個(gè)），ITS2存

18、在34個(gè)變異位點(diǎn)（單變異位點(diǎn)19個(gè)），5.8 S存在23個(gè)變異位點(diǎn)（單變異位點(diǎn)15個(gè)）。除此之外，在ITS區(qū)檢測(cè)到插入缺失位點(diǎn)共9個(gè)，其中ITS1存在6個(gè)插入缺失位點(diǎn)，ITS2區(qū)存在3個(gè)插入缺失位點(diǎn)，5.8 S區(qū)沒(méi)有檢測(cè)到插入缺失位點(diǎn)（表3）。ITS核苷酸多樣性Pi值為0.011 60，Theta值為0.034 30，其中ITS1的Pi值為0.010 10，Theta值為0.030 20，ITS2的Pi值為0.014 33，Theta值為0.040 93，5.8 S的Pi值為0.010 31，Theta值為0.032 11。Pi值結(jié)果顯示，變異位點(diǎn)分布相對(duì)均勻，ITS2發(fā)生變異略高于ITS1和

19、5.8S（表2）。根據(jù)ITS核苷酸變異位點(diǎn)，最終確定34個(gè)單倍型，其中單倍型H8在供試材料中分布最廣，共8個(gè)材料（82、87、109、121、熱墾628、熱研88-13、熱研7-33-97），其次為單倍型14，共6個(gè)材料（89、92、95、96、106、123），其余單倍型只分布在少數(shù)個(gè)體中，單倍型多樣性Hd為0.964，多樣性方差Vh為0.000 20，多樣性標(biāo)準(zhǔn)差Sh為0.014（表1和表3）。ITS1存在17個(gè)單倍型，其單倍型多樣性Hd為0.744（Vh=0.002 50，Sh=0.050）；ITS2存在18個(gè)單倍型，其單倍型多樣性Hd為0.752（Vh=0.002 55，Sh=0.05

20、1）；5.8 S存在10個(gè)單倍型，其單倍型多樣性Hd為0.581（Vh=0.005 21，Sh=0.072）。ITS1與ITS2單倍型多樣性Hd相近，略高于5.8 S單倍型多樣性Hd（表3）。ITS中性檢驗(yàn)分析p 結(jié)果Tajima"s D和Fu"s Fs均為負(fù)值，且達(dá)到顯著水平，分別為-2.327（p另外，本研究以54條橡膠樹(shù)ITS序列構(gòu)建NJ分子系統(tǒng)樹(shù)（圖1），在5大分支中，分支包含材料最多，主體單倍型H8和H14均在此分支，主要包含了朗多尼亞州的部分材料，以及5份栽培品系。熱研7-20-59，熱研7-33-97及熱研88-13擁有共同的親本RRIM600，因此共同屬于分

21、支，進(jìn)一步說(shuō)明它們的遺傳背景主要來(lái)自朗多尼亞州16。1994年，RFLP標(biāo)記結(jié)果顯示橡膠樹(shù)野生種多態(tài)性高于栽培種，朗多尼亞州和馬托格羅索州種質(zhì)多態(tài)性高于阿克里州24。另外2個(gè)栽培品系PR107和93-114與馬托格羅索州的103材料遺傳距離最近，推測(cè)其遺傳背景主要來(lái)自馬托格羅索州。致 謝 本研究所用橡膠樹(shù)種質(zhì)及栽培材料均由國(guó)家農(nóng)作物種質(zhì)資平臺(tái)-國(guó)家橡膠樹(shù)種質(zhì)資子平臺(tái)提供。【參考文獻(xiàn)】：p 1 曾 霞， 鄭服叢， 黃茂芳， 等.世界天然橡膠技術(shù)現(xiàn)狀與展望J.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)， 20_（1）： 31-36.2 方家林， 龍青姨， 華玉偉， 等.橡膠樹(shù)魏克漢種質(zhì)群體結(jié)構(gòu)分析p J.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，

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