PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析ppt課件

1、PCR PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的分析擴(kuò)增產(chǎn)物的分析 Gel electrophoresis Restriction endonuclease Molecular hybridization Nucleic acid sequencePCRPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳常用于臨床檢測(cè)定性）常用于臨床檢測(cè)定性）聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中可用于科研及檢測(cè)分析可用于科研及檢測(cè)分析瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡(jiǎn)便、快速、最常瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡(jiǎn)便、快速、最常用的分離純化和鑒定核酸

2、的方法用的分離純化和鑒定核酸的方法 瓊脂糖是從海藻中提取的一種線狀高聚物瓊脂糖是從海藻中提取的一種線狀高聚物 根據(jù)瓊?cè)芙鉁囟?，把瓊脂糖分為一般瓊脂糖和根?jù)瓊?cè)芙鉁囟?，把瓊脂糖分為一般瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖低熔點(diǎn)瓊脂糖 低熔點(diǎn)瓊脂糖熔點(diǎn)為低熔點(diǎn)瓊脂糖熔點(diǎn)為6265，溶解后在，溶解后在37下維持液體狀態(tài)約數(shù)小時(shí)，主要用于下維持液體狀態(tài)約數(shù)小時(shí)，主要用于DNA片段片段的回收，質(zhì)粒與外源性的回收，質(zhì)粒與外源性DNA的快速連接等的快速連接等凝膠濃度選擇瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度(%)線型線型DNA分子的分離范圍分子的分離范圍(Kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50.2

3、312.00.12瓊脂糖凝膠的濃度與瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分離范圍分離范圍電泳緩沖液電泳緩沖液 常用三種緩沖液常用三種緩沖液 Tris-硼酸硼酸TBE） Tris-乙酸乙酸TAE） Tris-磷酸磷酸TPE） TBE與與TPE：緩沖容量高，：緩沖容量高，DNA分離效果分離效果好，但好，但TPE在在DNA片段回收時(shí)含磷酸鹽濃片段回收時(shí)含磷酸鹽濃度高，容易使度高，容易使DNA沉淀沉淀 TAE：緩沖容量低，但價(jià)格較便宜，因而：緩沖容量低，但價(jià)格較便宜，因而推薦選用推薦選用TAE。緩沖液中的。緩沖液中的 EDTA 可螯合可螯合二價(jià)陽離子，從而抑制二價(jià)陽離子，從而抑制DNA酶的活性，防酶的活性，防止止

4、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物降解擴(kuò)增產(chǎn)物降解1010TBETBE緩沖液的配制緩沖液的配制 配方配方 Tris 108克克 EDTA 9.3克克 硼酸硼酸 55克克 H2O至至 1000ml pH應(yīng)為應(yīng)為8.08.2 臨用時(shí)用水稀至臨用時(shí)用水稀至0.5TBE20倍稀釋）倍稀釋）核酸電泳的指示劑核酸電泳的指示劑 指示劑：指示劑： 溴酚蘭溴酚蘭 二甲苯青二甲苯青 溴酚蘭：在堿性液體中呈紫蘭色溴酚蘭：在堿性液體中呈紫蘭色 電泳中，溴酚蘭的遷移率與雙鏈線性電泳中，溴酚蘭的遷移率與雙鏈線性DNA片段片段瓊脂糖凝瓊脂糖凝膠濃度膠濃度0.6%1%1.4%2%遷移率遷移率1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb核酸電泳的指示劑

5、核酸電泳的指示劑 二甲苯青：水溶液呈蘭色，二甲苯青：水溶液呈蘭色， 電泳時(shí)，其遷移速率與雙鏈線性電泳時(shí)，其遷移速率與雙鏈線性DNA大大致相當(dāng)致相當(dāng)瓊脂糖凝膠濃度瓊脂糖凝膠濃度1%1.4%遷移率遷移率2Kb1.6Kb載樣緩沖液載樣緩沖液 指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液組成載樣緩沖液 作用：作用： 增加樣品密度，使其比重增加，增加樣品密度，使其比重增加，以確保以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)均勻沉入加樣孔內(nèi) 在電泳中形成肉眼可見的指在電泳中形成肉眼可見的指示帶，可預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位示帶，可預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位置置 使樣品呈色，使加樣操作更方便使樣

6、品呈色，使加樣操作更方便核酸電泳的染色劑核酸電泳的染色劑 最常用的染色劑最常用的染色劑 溴化乙錠溴化乙錠 銀染色銀染色核酸電泳的染色劑核酸電泳的染色劑 溴化乙錠溴化乙錠ethidium bromide，EB） 是一種熒光染料，是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒堿基對(duì)之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光光 可在凝膠電泳液中加入終濃度為可在凝膠電泳液中加入終濃度為0.5ug/ml的的EB，有時(shí)亦可在電泳后，將凝膠浸入該濃度，有時(shí)亦可在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色的溶液中染色1015min 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠EB染色，肉眼可見核

7、酸電泳帶，染色，肉眼可見核酸電泳帶，其其DNA量一般量一般5ng 溴化乙錠太多，凝膠染色過深，核酸電泳帶溴化乙錠太多，凝膠染色過深，核酸電泳帶看不清時(shí)，可將凝膠放入蒸餾水浸泡看不清時(shí)，可將凝膠放入蒸餾水浸泡30min后再觀察后再觀察核酸電泳的染色劑核酸電泳的染色劑 銀染色：銀染色液中的銀離子銀染色：銀染色液中的銀離子(Ag+)可與核可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛使使Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色黑褐色 主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色，也用于主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色，也用于瓊脂糖凝膠染色瓊脂糖

8、凝膠染色 靈敏度比靈敏度比EB高高200倍，但銀染色后，倍，但銀染色后，DNA不不宜回收宜回收電泳電泳 電泳裝置電泳裝置 電泳儀電泳儀 電泳槽電泳槽 灌膠模具等灌膠模具等電泳儀電泳儀 普通電泳儀普通電泳儀 高壓電泳儀高壓電泳儀電泳槽電泳槽 水平平板水平平板 垂直平板垂直平板電泳方法電泳方法 用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈，放在用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈，放在水平桌面上，并架好梳子水平桌面上，并架好梳子 根據(jù)核酸分子量的大小配制不同濃度的瓊根據(jù)核酸分子量的大小配制不同濃度的瓊脂糖凝膠，普通脂糖凝膠，普通 200400 bp 的的DNA片段片段可配制可配制1.21.7%）電泳方法電泳方法配制瓊

9、脂糖凝膠及倒膠配制瓊脂糖凝膠及倒膠 0.5TBE電泳緩沖液電泳緩沖液100ml于三角燒瓶中，于三角燒瓶中，稱取一定量的瓊脂糖粉放入后沸水鍋或微稱取一定量的瓊脂糖粉放入后沸水鍋或微波爐內(nèi)加熱熔化，冷卻至波爐內(nèi)加熱熔化，冷卻至60(需要時(shí)可加需要時(shí)可加入入EB)，倒入電泳槽中，待凝固，倒入電泳槽中，待凝固 向電泳槽中倒入向電泳槽中倒入0.5 TBE，其量以沒過膠，其量以沒過膠面面2mm為宜，小心移去梳子如樣品孔內(nèi)為宜，小心移去梳子如樣品孔內(nèi)有氣泡，應(yīng)除去）有氣泡，應(yīng)除去）電泳方法電泳方法上樣與通電上樣與通電 在在DNA樣品中加入樣品中加入0.2體積的載樣緩沖液，混體積的載樣緩沖液，混勻后，加入樣品

10、孔內(nèi)勻后，加入樣品孔內(nèi) 接通電源，一般紅色為正極黑色為負(fù)極，切接通電源，一般紅色為正極黑色為負(fù)極，切記記DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng)靠近加樣孔樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng)靠近加樣孔的一端為負(fù)），電壓為的一端為負(fù)），電壓為1 5V/cm長(zhǎng)度以長(zhǎng)度以兩個(gè)電極之間的距離計(jì)算）兩個(gè)電極之間的距離計(jì)算） 根據(jù)指示劑泳動(dòng)的位置，判斷是否終止電泳，根據(jù)指示劑泳動(dòng)的位置，判斷是否終止電泳，普通普通 200400bp 的的PCR產(chǎn)物產(chǎn)物50V電壓，電泳電壓，電泳2040min電泳方法電泳方法結(jié)果觀察結(jié)果觀察 紫外儀上觀察電泳帶及其位置紫外儀上觀察電泳帶及其位置 并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)比較被擴(kuò)增產(chǎn)物的大小并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)比較

11、被擴(kuò)增產(chǎn)物的大小聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 適宜分離鑒定低分子量蛋白質(zhì)、小于適宜分離鑒定低分子量蛋白質(zhì)、小于1Kb的的DNA片段和片段和DNA序列分析序列分析 其裝載的樣品量大，回收其裝載的樣品量大，回收DNA純度高，長(zhǎng)純度高，長(zhǎng)度僅相差度僅相差0.2%（即（即500bp中的中的1bp的核苷的核苷酸分子即能分離酸分子即能分離聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 由丙烯酰胺單體，在催化劑由丙烯酰胺單體，在催化劑TEMEDN，N，N，N一四甲基乙二胺和過硫酸銨的一四甲基乙二胺和過硫酸銨的作用下，丙烯酰胺聚合形成長(zhǎng)鏈，聚丙烯作用下，丙烯酰胺聚合形成長(zhǎng)鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯(lián)劑，酰胺鏈在交聯(lián)劑，N，N

12、一亞甲雙丙烯酰胺一亞甲雙丙烯酰胺參與下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而參與下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形成凝膠形成凝膠 聚丙烯酰胺凝膠孔徑的大小是由丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠孔徑的大小是由丙烯酰胺的濃度決定的的濃度決定的不同濃度丙烯酰胺和不同濃度丙烯酰胺和DNADNA有效分離范圍有效分離范圍 丙烯酰胺丙烯酰胺（%）有效分離范圍有效分離范圍（bp）溴酚蘭溴酚蘭*二甲苯青二甲苯青*3.510020001004605.080500652608.0604004516012.040200307015.025150156020.0101001245資料資料 電泳儀器：電泳儀器： 電泳儀電泳儀 垂直電泳槽及其

13、附件垂直電泳槽及其附件. 30%丙烯酰胺丙烯酰胺 丙烯酰胺，丙烯酰胺，29克克 N，N一亞甲基雙丙烯酰胺，一亞甲基雙丙烯酰胺，1克克 H2O，加至，加至100ml裝于棕色瓶?jī)?nèi)，裝于棕色瓶?jī)?nèi)，4可保存二個(gè)月可保存二個(gè)月資料資料 10%過硫酸銨過硫酸銨 過硫酰銨，過硫酰銨，1克，加水至克，加水至 10 ml4可保存一周，可保存一周，-20可保存一個(gè)月可保存一個(gè)月 1TBE電泳緩沖液電泳緩沖液 TEMED四甲基乙烯基二胺）四甲基乙烯基二胺）聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳 配膠：根據(jù)分離配膠：根據(jù)分離DNA片段的大小及需凝膠片段的大小及需凝膠的容積，配制聚丙烯酰胺凝膠的容積，配制

14、聚丙烯酰胺凝膠 按要求裝配好垂直電泳板，兩塊玻璃板的兩按要求裝配好垂直電泳板，兩塊玻璃板的兩側(cè)及底部用側(cè)及底部用1%的瓊脂糖封邊，防止封閉不的瓊脂糖封邊，防止封閉不嚴(yán)而使聚丙烯酰胺液漏出嚴(yán)而使聚丙烯酰胺液漏出 將裝好的玻璃電泳板傾斜成將裝好的玻璃電泳板傾斜成4560角角 按表按表3配制所需配制所需%濃度凝膠的毫升數(shù)濃度凝膠的毫升數(shù) 加入加入TEMED后，立即混勻，緩緩倒入兩玻后，立即混勻，緩緩倒入兩玻璃板間的膠床中，直到液體接近溢出時(shí)為止璃板間的膠床中，直到液體接近溢出時(shí)為止聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳 立即插入適當(dāng)?shù)氖嶙?，密切注意防止梳齒立即插入適當(dāng)?shù)氖嶙樱芮凶⒁夥?/p>

15、止梳齒下產(chǎn)生氣泡，用一有力下產(chǎn)生氣泡，用一有力的夾將梳子夾在一邊的玻璃板上，然后將的夾將梳子夾在一邊的玻璃板上，然后將玻璃板斜靠在物體上，使成玻璃板斜靠在物體上，使成10角，可減少角，可減少液體泄漏的機(jī)會(huì)液體泄漏的機(jī)會(huì) 室溫聚合一小時(shí)后，將玻璃板插入電泳槽室溫聚合一小時(shí)后，將玻璃板插入電泳槽中，上緊，倒入中，上緊，倒入0.1TBE緩沖液緩沖液聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳 小心取出梳子，立即用緩沖液沖洗加樣孔，小心取出梳子，立即用緩沖液沖洗加樣孔，因?yàn)槭嶙尤〕龊?，梳子上吸附的及凝膠頂部因?yàn)槭嶙尤〕龊?，梳子上吸附的及凝膠頂部未聚合的丙烯酰胺會(huì)流入加樣孔內(nèi)聚合，產(chǎn)未聚合的丙烯

16、酰胺會(huì)流入加樣孔內(nèi)聚合，產(chǎn)生不規(guī)則的表面，將導(dǎo)致以后生不規(guī)則的表面，將導(dǎo)致以后DNA電泳帶型電泳帶型不規(guī)則不規(guī)則 將將DNA樣品與適量的載樣緩沖液混勻后，加樣品與適量的載樣緩沖液混勻后，加到樣品孔內(nèi)，加樣時(shí)不要產(chǎn)生氣泡到樣品孔內(nèi)，加樣時(shí)不要產(chǎn)生氣泡聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳 接好電極，電壓為接好電極，電壓為1-8V/cm，進(jìn)行電泳，進(jìn)行電泳 電泳畢，切斷電源，取出膠床板，小心移去電泳畢，切斷電源，取出膠床板，小心移去一塊玻璃板，讓凝膠吸附在另一塊玻璃板上，一塊玻璃板，讓凝膠吸附在另一塊玻璃板上，浸入含浸入含0.5ug/ml的溴化乙錠溶液中，的溴化乙錠溶液中，1530m

17、in后取出水洗，紫外儀下觀察結(jié)果后取出水洗，紫外儀下觀察結(jié)果 聚丙烯酰胺凝膠電泳只能檢出聚丙烯酰胺凝膠電泳只能檢出10ng以上量以上量的的DNA條帶要求更高的靈敏度，可用銀條帶要求更高的靈敏度，可用銀染）染）電泳結(jié)果分析電泳結(jié)果分析 DNA Marker DNA 人工片段人工片段 100 bp ladder酶切分析酶切分析 根據(jù)根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，用相應(yīng)的酶進(jìn)行酶切用相應(yīng)的酶進(jìn)行酶切 酶切產(chǎn)物電泳分離后，獲得符合理論的酶切產(chǎn)物電泳分離后，獲得符合理論的片段片段 此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對(duì)靶基此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對(duì)靶基因分型，還能進(jìn)行變異性研

18、究因分型，還能進(jìn)行變異性研究分子雜交分子雜交 檢測(cè)檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)產(chǎn)物特異性的有力證據(jù) 檢測(cè)檢測(cè)PCR 產(chǎn)物堿基突變的有效方法產(chǎn)物堿基突變的有效方法 主要的雜交主要的雜交 Southern印跡雜交印跡雜交 斑點(diǎn)雜交斑點(diǎn)雜交SouthernSouthern印跡雜交：印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈并作標(biāo)記探針）并作標(biāo)記探針） 與與 PCR 產(chǎn)物雜交產(chǎn)物雜交 此法既可作特異性鑒定，又可以提高此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測(cè)檢測(cè) PCR產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。子量及條帶形狀，主要用于科

19、研。斑點(diǎn)雜交：斑點(diǎn)雜交： 將將PCR 產(chǎn)物點(diǎn)在硝酸纖維素膜或尼產(chǎn)物點(diǎn)在硝酸纖維素膜或尼龍膜薄膜上龍膜薄膜上 寡核苷酸探針雜交寡核苷酸探針雜交 觀察有無著色斑點(diǎn)觀察有無著色斑點(diǎn) 主要用于主要用于 PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析異分析RDB檢測(cè)檢測(cè) -地中海貧血突變基因地中海貧血突變基因-29AG）-28（ AG）17（ AT，AAG TAG）E （CD26 GAG AAG）IVS-I-1（ GT ）IVS-I-5（ GC）27-28（+C）41-42（-CTTT）43（ GT ）71-72（+A或或+T）654（ CT）微孔板夾心雜交法微孔板夾心雜交法 通過一固定于微孔板的捕獲

20、探針與通過一固定于微孔板的捕獲探針與PCR產(chǎn)物產(chǎn)物的某一區(qū)域特異性雜交，使的某一區(qū)域特異性雜交，使PCR產(chǎn)物間接地產(chǎn)物間接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素等非固定于微孔板上，然后，再用一生物素等非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的檢測(cè)探針與產(chǎn)物的另一放射性標(biāo)記物標(biāo)記的檢測(cè)探針與產(chǎn)物的另一區(qū)域特異性雜交，漂洗后顯色即可判斷結(jié)果區(qū)域特異性雜交，漂洗后顯色即可判斷結(jié)果 該法使用了兩個(gè)雜交過程來檢測(cè)一個(gè)產(chǎn)物，該法使用了兩個(gè)雜交過程來檢測(cè)一個(gè)產(chǎn)物，其特異性較一次雜交的檢測(cè)法高其特異性較一次雜交的檢測(cè)法高：NOS11014/cm2） N-羥化琥珀酰亞胺酯 -CCCCCCCapture Probe:：NH2Detect

21、ion Probe:：Biotin：NH2標(biāo)記的探針：Biotin標(biāo)記的探針標(biāo)記的探針Avidin-HRP 顯色系統(tǒng)顯色系統(tǒng)：NOS基團(tuán)基團(tuán)微孔板夾心雜交法微孔板夾心雜交法 方法學(xué)評(píng)價(jià)方法學(xué)評(píng)價(jià) 敏感度：該法檢測(cè)敏感度：該法檢測(cè)HBV，敏感度達(dá)，敏感度達(dá)5個(gè)個(gè)HBV DNA分子分子 敏感性和特異性與敏感性和特異性與 PCR 32P 探針的探針的Southern雜交法相當(dāng)雜交法相當(dāng) PCR微孔板夾心雜交法：操作簡(jiǎn)便、快速、微孔板夾心雜交法：操作簡(jiǎn)便、快速、避免了同位素標(biāo)記探針的危害，顯色反應(yīng)類避免了同位素標(biāo)記探針的危害，顯色反應(yīng)類似于臨床常規(guī)應(yīng)用的似于臨床常規(guī)應(yīng)用的ELISA微孔板直接雜交微孔板

22、直接雜交 不是采用夾心法，而是直接將特異的探不是采用夾心法，而是直接將特異的探針固定于微孔板上，然后用生物素標(biāo)記針固定于微孔板上，然后用生物素標(biāo)記的的PCR產(chǎn)物與之雜交產(chǎn)物與之雜交 只進(jìn)行一次雜交，方法簡(jiǎn)單，但特異性只進(jìn)行一次雜交，方法簡(jiǎn)單，但特異性不高不高微孔板雜交的基本過程 DNA的固定的固定 探針的雜交探針的雜交 酶聯(lián)顯色酶聯(lián)顯色DNADNA的固定的固定 在一定鹽濃度條件下，在一定鹽濃度條件下，DNA單鏈的一端可單鏈的一端可固定在微孔板上固定在微孔板上 不同來源的微孔板固定不同來源的微孔板固定DNA時(shí)所需鹽濃度時(shí)所需鹽濃度不同。因此，必須用一系列的鹽濃度不同。因此，必須用一系列的鹽濃度（

23、0.153.0mol/L NaCl來固定加熱變性來固定加熱變性的核酸，然后，用固定濃度的標(biāo)記探針雜的核酸，然后，用固定濃度的標(biāo)記探針雜交。顯色后，判斷合適的固定鹽濃度交。顯色后，判斷合適的固定鹽濃度DNADNA的固定的固定 固定方法的選擇必須使固定方法的選擇必須使DNA最大量的固定，最大量的固定，且不影響雜交且不影響雜交 用合適濃度的用合適濃度的 NaCl 或或NH42SO4 可達(dá)可達(dá)到此目的。硫氰酸鈉則無固定作用。到此目的。硫氰酸鈉則無固定作用。 鹽濃度合適時(shí)，鹽濃度合適時(shí)，DNA應(yīng)為一端固定到微孔應(yīng)為一端固定到微孔板上，而太低或太高濃度的鹽可能使板上，而太低或太高濃度的鹽可能使DNA “平

24、躺固定在孔內(nèi)而影響雜交平躺固定在孔內(nèi)而影響雜交DNADNA的固定的固定 Mg2+雖有促進(jìn)雖有促進(jìn)DNA固定的作用，但它固定的作用，但它可激活可激活Dnase，所以，一般不用，所以，一般不用 被固定的被固定的DNA應(yīng)大于應(yīng)大于300bp，否則影響，否則影響雜交結(jié)果。每孔可固定高達(dá)雜交結(jié)果。每孔可固定高達(dá) 200ng624bp的的DNA 鹽濃度和固定量確定后，按下法固定鹽濃度和固定量確定后，按下法固定DNADNADNA的固定的固定 待固定待固定DNA 100加熱加熱 5min 變性，并立變性，并立即冷卻，與合適的固定液混合后，加入微即冷卻，與合適的固定液混合后，加入微孔板的孔內(nèi)孔板的孔內(nèi) 固定液：

25、固定液：10mmol/L磷酸鈉磷酸鈉-10mmol/L EDTA，pH7.0，合適濃度的，合適濃度的NaCl與與DNA變性混合后，終濃度為最適固定濃度）變性混合后，終濃度為最適固定濃度） 用膠布封好，浸于用膠布封好，浸于37水浴水浴2h 用用PBS-0.05%Tween20 漂洗漂洗3次次立即用于雜交，或封閉于塑料袋內(nèi)保存立即用于雜交，或封閉于塑料袋內(nèi)保存雜交與顯色雜交與顯色 雜交雜交 可采用標(biāo)準(zhǔn)的雜交系統(tǒng)雜交可采用標(biāo)準(zhǔn)的雜交系統(tǒng)雜交 夾心雜交時(shí)，是將變性的夾心雜交時(shí)，是將變性的PCR產(chǎn)物與檢測(cè)產(chǎn)物與檢測(cè)探針一并加入探針一并加入 雜交與漂洗時(shí)間均較一般膜雜交短雜交與漂洗時(shí)間均較一般膜雜交短 顯

26、色顯色 根據(jù)不同酶標(biāo)，檢測(cè)分子的不同來選擇不根據(jù)不同酶標(biāo)，檢測(cè)分子的不同來選擇不同的底物、終止劑和測(cè)定波長(zhǎng)同的底物、終止劑和測(cè)定波長(zhǎng) 顏色互補(bǔ)分析法A） 利用三原色原理，當(dāng)不同利用三原色原理，當(dāng)不同DNA片段片段A和和B同時(shí)擴(kuò)同時(shí)擴(kuò)增時(shí)，用引物增時(shí)，用引物5端修飾技術(shù)將不同引物用不同顏色熒端修飾技術(shù)將不同引物用不同顏色熒光素標(biāo)記光素標(biāo)記A片段引物標(biāo)記綠色的熒光素，片段引物標(biāo)記綠色的熒光素，B標(biāo)記紅標(biāo)記紅色的羅丹明）色的羅丹明） 如果僅有一條片段被擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物激發(fā)后，只有如果僅有一條片段被擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物激發(fā)后，只有一種顏色紅色或綠色）一種顏色紅色或綠色） 如果兩條不同大小的片段均被擴(kuò)增，可通過

27、電泳分如果兩條不同大小的片段均被擴(kuò)增，可通過電泳分離，紫外激發(fā)后可觀察到不同顏色的兩條帶離，紫外激發(fā)后可觀察到不同顏色的兩條帶 如果兩條被擴(kuò)增片段大小相同，電泳后可見一條紅如果兩條被擴(kuò)增片段大小相同，電泳后可見一條紅綠互補(bǔ)色綠互補(bǔ)色-黃色帶黃色帶 如果不用電泳法分離擴(kuò)增片段，通過一定手段除未如果不用電泳法分離擴(kuò)增片段，通過一定手段除未摻入引物，亦可觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物的顏色。此時(shí)，擴(kuò)摻入引物，亦可觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物的顏色。此時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物無論大小，只要均被擴(kuò)增，就可見一條紅綠增產(chǎn)物無論大小，只要均被擴(kuò)增，就可見一條紅綠互補(bǔ)的黃色條帶互補(bǔ)的黃色條帶顏色互補(bǔ)分析法顏色互補(bǔ)分析法 方法學(xué)評(píng)價(jià)方法學(xué)評(píng)價(jià) 該法簡(jiǎn)便、易于自動(dòng)化該法簡(jiǎn)便、易于自動(dòng)化 可用于檢測(cè)基因缺失、染色體轉(zhuǎn)可用于檢測(cè)基因缺失、染色體轉(zhuǎn)位和病原微生物位和病原微生物 只判斷產(chǎn)物的有無只判斷產(chǎn)物的有無 在檢測(cè)多種基因?qū)嵶?、多種病原菌在檢測(cè)多種基因?qū)嵶儭⒍喾N病原菌和和HLA分型時(shí)，可用復(fù)合分型時(shí)，可用復(fù)合PCR。此。此時(shí)，不同引物可用不同熒光素標(biāo)記時(shí)，不同引物可用不同熒光素標(biāo)記如綠色的如綠色的ROX；藍(lán)色的；藍(lán)色的COUM等）等）PCR-ELISAP