《飼料中腸桿菌科檢驗(yàn)》編制說明

1、中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)飼料中腸桿菌科檢驗(yàn)編制說明飼料中腸桿菌科檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)編制組二一八年九月1項(xiàng)目名稱： 飼料中腸桿菌科檢驗(yàn)國家標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目計(jì)劃編號：20111583-T-469承擔(dān)單位： 江蘇海企長城股份有限公司、淮安出入境檢驗(yàn)檢疫局、 江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局、淮陰師范學(xué)院編制組主要成員： 王遠(yuǎn)見、馮民、宦海霞、何健、劉堯、蔣原、任盈盈、柯家法、張揚(yáng)、張科、顏智勇、張敬友2目錄一、 標(biāo)準(zhǔn)制定背景及任務(wù)來源 .41.1制定背景 .41.2任務(wù)來源 .5二、 主要工作過程 .5三、 標(biāo)準(zhǔn)編制原則和主要技術(shù)內(nèi)容確定的依據(jù).63.1標(biāo)準(zhǔn)編制原則 .63.2標(biāo)準(zhǔn)的重要內(nèi)容和主要技術(shù)內(nèi)容介紹 .63.3確證試驗(yàn)

2、.73.3.1試驗(yàn)菌株的選擇 .83.3.2試驗(yàn)樣品的選擇 .103.4相對準(zhǔn)確度試驗(yàn) .103.4.1方法 .103.4.2結(jié)果和結(jié)論 .103.5靈敏度試驗(yàn) .143.5.1方法 .143.5.2結(jié)果和結(jié)論 .143.6特異性試驗(yàn) .173.6.1方法 .173.6.2結(jié)果和結(jié)論 .173.7驗(yàn)證試驗(yàn) .193.7.1方法特異性和敏感性 .193.7.2重復(fù)性 .19四、 采用國際標(biāo)準(zhǔn) .20五、 與有關(guān)現(xiàn)行法律、法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系.20六、 重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù).20七、 作為強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)或推薦性標(biāo)準(zhǔn)的意見.21八、 貫徹標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議 .21九、 廢止現(xiàn)行有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的建議

3、 .21十、 其他應(yīng)予說明的事項(xiàng) .213飼料中腸桿菌科檢驗(yàn)國家標(biāo)準(zhǔn)編制說明一、 標(biāo)準(zhǔn)制定背景及任務(wù)來源1.1 制定背景腸桿菌科作為食品衛(wèi)生指標(biāo)菌在歐洲已有多年歷史，歐盟于2002 年 10 月10 日正式實(shí)施的歐盟（ EC） No.1774/2002 號指令明確要求輸歐的非人類食用的動物產(chǎn)品的腸桿菌科計(jì)數(shù)限量。在（EC）No.2073/2005 食品微生物標(biāo)準(zhǔn)中正式采用以在分類學(xué)上準(zhǔn)確描述命名的腸桿菌科來代替分類學(xué)不明確的大腸菌群、 糞大腸菌群作為肉類、牛奶和乳制品、蛋制品、干的嬰兒制品、特殊醫(yī)學(xué)目的干食品、包裝后急凍前的胴體等的加工過程衛(wèi)生指標(biāo)。近年來，隨著對外貿(mào)易的發(fā)展，歐洲一些國家已對

4、我國出口的某些食品和動物飼料提出了檢測和限量要求，且將其作為國際間食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制、水平測試的必測項(xiàng)目之一。2007年，歐盟通報中開始出現(xiàn)了腸桿菌科超標(biāo)的通報，其中涉及到了法國的脂渣、 西班牙的熏鮭魚、波蘭的禽肉產(chǎn)品， 在對中國關(guān)于腸桿菌科的通報中， 主要集中在寵物食品。面對歐盟方面對腸桿菌科的要求， 急需選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)來應(yīng)對外貿(mào)發(fā)展的需要。在飼料產(chǎn)品中， 我國仍廣泛使用大腸菌群、沙門氏菌、志賀氏菌等作為指標(biāo)菌，很少使用腸桿菌科作為衛(wèi)生指標(biāo)菌， 但是歐盟等發(fā)達(dá)國家和地區(qū)對我國出口飼料產(chǎn)品有檢測腸桿菌的要求。 歐盟每五年對我國飼料企業(yè)的質(zhì)量管理體系進(jìn)行官方審查，曾明確提出過我國缺少腸桿

5、菌科檢驗(yàn)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。 同時我國出口歐盟的飼料官方證書中需注明產(chǎn)品經(jīng)過腸桿菌科檢驗(yàn)合格。 而我國海關(guān)總署動植司也明確要求，需對進(jìn)口飼料的腸桿菌科項(xiàng)目進(jìn)行檢驗(yàn)。 目前我國沒有制定飼料中腸桿菌科檢測的標(biāo)準(zhǔn)， 很多實(shí)驗(yàn)室參照食品中腸桿菌科的檢測標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測， 受飼料的加工狀態(tài)、 樣品制備方法和檢測步驟不同等因素的影響， 以及各實(shí)驗(yàn)室間檢4測方法的不統(tǒng)一， 檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性受到影響。長此以往，甚至?xí)绊懳覈暳闲袠I(yè)的發(fā)展。本標(biāo)準(zhǔn)可以對國內(nèi)飼料產(chǎn)品腸桿菌科的檢測進(jìn)行統(tǒng)一化和標(biāo)準(zhǔn)化，促進(jìn)飼料產(chǎn)品行業(yè)健康發(fā)展。1.2 任務(wù)來源本標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)飼料工業(yè)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目；項(xiàng)目編號為：20111583-T-

6、469。本標(biāo)準(zhǔn)由江蘇海企長城股份有限公司、淮安出入境檢驗(yàn)檢疫局、 江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局、淮陰師范學(xué)院參與編制工作。主要編制人包括：王遠(yuǎn)見、馮民、宦海霞、何健、劉堯、蔣原、任盈盈、柯家法、張揚(yáng)、張科、顏智勇、張敬友。二、 主要工作過程1、2011 年，根據(jù)下達(dá)飼料工業(yè)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目標(biāo)準(zhǔn)制定任務(wù)的成立標(biāo)準(zhǔn)制定編寫組，由江蘇海企長城股份有限公司、淮安海關(guān)（原淮安出入境檢驗(yàn)檢疫局）、南京海關(guān)（原江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局）、淮陰師范學(xué)院等單位的 11 名專業(yè)技術(shù)人員組成。確定標(biāo)準(zhǔn)制定的基本原則，并進(jìn)行方法的研究工作，收集國內(nèi)外相關(guān)檢驗(yàn)方法。2、編寫組總結(jié)了國內(nèi)腸桿菌科檢驗(yàn)的技術(shù)現(xiàn)狀的基礎(chǔ)上，參

7、考了ISO21528-1、ISO 21528-2、SN/T 0738 和 GB 4789.41 標(biāo)準(zhǔn)中的有關(guān)內(nèi)容，結(jié)合目前的實(shí)際情況，初步確定了標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)方法，形成了標(biāo)準(zhǔn)草案。之后，工作組對標(biāo)準(zhǔn)草案進(jìn)行了多次討論研究，同時對標(biāo)準(zhǔn)中采用的試驗(yàn)方法進(jìn)行了對比驗(yàn)證工作，積累了檢驗(yàn)數(shù)據(jù)。 經(jīng)認(rèn)真研究分析和方法的試驗(yàn)比對，完成了標(biāo)準(zhǔn)文本及編制。3、組織方法驗(yàn)證， 2017 年 3 月，將制備的樣品送至重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心、 天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物與食品檢測中心和山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心， 對標(biāo)準(zhǔn)中的檢測方法和特異性、 敏感性進(jìn)行驗(yàn)證。54、發(fā)出征求意見稿征求意見，以發(fā)放郵

8、件、信函等形式，在全國范圍內(nèi)向國內(nèi)院校、檢測機(jī)構(gòu)、行業(yè)協(xié)會、飼料生產(chǎn)單位等有關(guān)部門、專家征求修訂意見，發(fā)出征求意見52 份，收到有效回復(fù)意見21 份；其中共計(jì)反饋意見97 條，采納 78 條，不采納 19 條。匯總專家意見，對標(biāo)準(zhǔn)文本進(jìn)行完善。5、組織專家進(jìn)行預(yù)審，在廣泛征求各方專家和意見和建議后，形成了飼料中腸桿菌科檢驗(yàn)的國家標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)審稿。2018 年 5 月 19 日，淮安海關(guān)（原淮安出入境檢驗(yàn)檢疫局）組織專家對該單位負(fù)責(zé)起草的國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了認(rèn)真的審查，專家組由李鳳琴、王安如、劉明、張鶴曉、曾靜、鄭文杰、張惠媛七位專家組成。與會專家一致同意國家標(biāo)準(zhǔn)飼料中腸桿菌科檢驗(yàn)（預(yù)審稿）按預(yù)審意見修改

9、后形成送審稿。6、組織專家進(jìn)行送審。 2018 年 9 月 29 日，全國飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會組織專家對國家標(biāo)準(zhǔn)飼料中腸桿菌科檢驗(yàn)（送審稿）進(jìn)行了認(rèn)真的審查，提出了修改意見， 認(rèn)為標(biāo)準(zhǔn)起草單位按照上述意見修改形成送審稿，送全國飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會秘書處，再次審查。三、 標(biāo)準(zhǔn)編制原則和主要技術(shù)內(nèi)容確定的依據(jù)3.1 標(biāo)準(zhǔn)編制原則在標(biāo)準(zhǔn)編寫時， 以飼料產(chǎn)品安全為出發(fā)點(diǎn)， 參考 ISO21528-1 Microbiology offood and animal feeding stuffs Horizontal methods for the detection and enumeration

10、of Enterobacteriaceae- Part 1: Detection and enumeration byMPN technique withpre-enrichment、 ISO21528-2 Microbiologyof food and animal feeding stuffs Horizontal methods for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae Part2Colony-count method、SN/T 0738 出口食品中腸桿菌科檢驗(yàn)方法和 GB4789.41食品微生物學(xué)檢驗(yàn)?zāi)c桿菌科檢驗(yàn)。在

11、充分參考國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合我國飼料生產(chǎn)工藝現(xiàn)狀，進(jìn)行編寫。在標(biāo)準(zhǔn)制定中充分考慮飼料產(chǎn)品的特性， 對樣品制備方法和結(jié)果描述等方面作了適宜的變動修改，并按照 GB/T 1.12009 給出的規(guī)則起草標(biāo)準(zhǔn)。63.2 標(biāo)準(zhǔn)的重要內(nèi)容和主要技術(shù)內(nèi)容介紹本標(biāo)準(zhǔn)與 ISO 21528-1、 ISO 21528-2 相比，修改和增加了：1、增加了均質(zhì)袋進(jìn)行拍打的樣品處理方法；2、增加了革蘭氏染色，增強(qiáng)了確認(rèn)結(jié)果的準(zhǔn)確性；3、將培養(yǎng)溫度 37± 1修改為 36± 1；4、增加了平板計(jì)數(shù)法的計(jì)算公式。1、增加了均質(zhì)袋進(jìn)行拍打的樣品處理方法在本標(biāo)準(zhǔn)制定過程中，考慮到飼料產(chǎn)品中的寵物食品（皮制品

12、、雞胸肉、狗咬膠等），尤其是咬膠類寵物食品又大又硬的特性，其難以在無菌狀態(tài)下均質(zhì)粉碎的事實(shí)，本標(biāo)準(zhǔn)增加采用均質(zhì)袋進(jìn)行拍打的樣品處理方法。取 25g 以上的單個或多個樣品，裝于均質(zhì)袋中，按照1:9 比例加入適量 BPW，于拍打式均質(zhì)器中均質(zhì) 12min，制成 1:10 的樣品勻液。2、增加了革蘭氏染色本標(biāo)準(zhǔn)采用了氧化酶陰性， 葡萄糖瓊脂發(fā)酵為變黃， 產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣作為判定標(biāo)準(zhǔn)。并增加了革蘭氏染色，來增強(qiáng)確認(rèn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。3、將培養(yǎng)溫度 37± 1修改為 36± 1伯杰細(xì)菌鑒定手冊第八版記載，腸桿菌科十二個屬的細(xì)菌中除歐文氏菌外，最適培養(yǎng)溫度均在 35 37 。試驗(yàn)結(jié)果表明 36

13、 ± 1 和 37 ± 1 條件下培養(yǎng)， 其它屬的細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果沒有明顯的差異。 本標(biāo)準(zhǔn)中的腸桿菌科是作為污染指示菌， 同時為與國內(nèi)其他微生物學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)一致， 避免實(shí)驗(yàn)室設(shè)置不同的培養(yǎng)溫度，本標(biāo)準(zhǔn)中采用了 36 ± 1 作為腸桿菌科的培養(yǎng)溫度。4、增加了平板計(jì)數(shù)法的計(jì)算公式ISO21528-1 中沒有平板計(jì)數(shù)法的計(jì)算公式， ISO 標(biāo)準(zhǔn)中將菌落計(jì)算公式統(tǒng)一編寫于 ISO7218 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Generalrequirements and guidance for microbiol

14、ogical examinations中，并已通用公式的形式出現(xiàn)。為方便標(biāo)準(zhǔn)使用， 將腸桿菌科菌落計(jì)算公式編寫在本標(biāo)準(zhǔn)中，并根據(jù)腸桿菌科的特性做出相應(yīng)的修改和示例說明。73.3 確證試驗(yàn)本研究以 ISO 21528-1、ISO 21528-2 為參照方法， 分四個階段研究了本方法的準(zhǔn)確性、敏感性和特異性。1、首先對人工污染樣品（分低、中、高污染濃度）及自然樣品采用本法與ISO 法進(jìn)行對比檢測， 采用成對 t 檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析， 以驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性。2、選取自然條件下和人工污染的飼料產(chǎn)品的樣品，采用本方法與ISO 法同時檢測，以驗(yàn)證本方法的靈敏度。3、選用標(biāo)準(zhǔn)腸桿菌科菌株及非腸桿菌科進(jìn)行本方

15、法與ISO 法的定性檢測，以驗(yàn)證該方法的特異性。4、制備人工污染的陽性飼料樣品和陰性飼料樣品，送至其他單位進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。腸桿菌科作為衛(wèi)生指示菌達(dá)到一定數(shù)量才表明食品衛(wèi)生狀況， 飼料中檢測出的腸桿菌科數(shù)量如果很低并沒有多少實(shí)際意義， 因此并沒有做該方法的檢出限研究。試驗(yàn)菌株的選擇該標(biāo)準(zhǔn)改進(jìn)了 ISO 21528-1、ISO 21528-2 中采用的平板計(jì)數(shù)法和 MPN 對腸桿菌科的計(jì)數(shù)。依據(jù)伯杰細(xì)菌鑒定手冊第八版， 腸桿菌科的分類， 對腸桿菌科中 12 個屬中的 16 種標(biāo)準(zhǔn)菌株（包括福氏志賀氏菌、大腸埃希氏菌、阪崎克羅諾桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、變形桿菌、肺炎克雷伯氏菌

16、、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、蜂房哈夫尼菌、歐文氏菌屬、弗氏檸檬酸桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、遲鈍愛德華氏菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌）、5 種分離菌株（肺炎克雷伯氏菌、沙門氏菌、大腸桿菌）和及其它對照菌株（金黃色葡萄球菌金黃亞種、單增李斯特氏菌、 糞腸球菌、 副溶血性弧菌、 銅綠假單胞菌、 乳酸桿菌），共 27 株進(jìn)行了本標(biāo)準(zhǔn)方法的檢驗(yàn)（見表 1），確定了腸桿菌科檢驗(yàn)的平板計(jì)數(shù)法及 MPN 法。表 1 選擇的試驗(yàn)菌株腸桿菌科名稱菌株學(xué)名編號8福氏志賀氏菌志賀氏菌屬痢疾志賀氏菌大腸埃希氏菌埃希氏菌屬阪崎克羅諾桿菌鼠傷寒沙門氏菌沙門氏菌屬腸炎沙門氏菌變形菌屬變形桿菌克雷伯氏菌屬肺炎克雷伯氏菌耶爾森氏菌屬小腸結(jié)腸

17、炎耶爾森氏菌哈夫尼氏菌屬蜂房哈夫尼菌歐文氏菌屬歐文氏菌屬檸檬酸細(xì)菌屬弗氏檸檬酸桿菌沙雷氏菌屬粘質(zhì)沙雷氏菌愛德華氏菌屬遲鈍愛德華氏菌陰溝腸桿菌腸桿菌屬產(chǎn)氣腸桿菌肺炎克雷伯氏菌大腸桿菌沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株Shigella flexneriATCC12022Shigella dysenteriaeFSCC219003Escherichia coliATCC25922CronobactersakazakiiATCC29544SalmonellatyphimuriumATCC50115Salmonella enteritidisFSCC215004Proteus mirabilisFSCC204002Kle

18、bsiellapneumoniae subsp.FSCC167002pneumoniaeYersiniaFSCC234002enterocoliticaHafnia M llerCICC10188ErwiniaCICC237 80Citrobacter freundiiFSCC135002Serratia marcescensGIM1.218Edwardsiella tardaATCC 15947Enterobacter closcaeATCC13047EnterobacterATCC13048aerogenes分離菌株Klebsiellapneumoniae subsp.9NVBpneumo

19、niaeEscherichia coliATCC2580salmonellaSL13349大腸桿菌Escherichia coliE058大腸桿菌Escherichia coliE526其它對照菌株金黃色葡萄球菌金黃亞Staphylococcus種aureus subsp. aureusATCC6538Rosenbach單增李斯特氏菌ListeriamonocytogenesATCC10890糞腸球菌EnterococcusfaecalisATCC29212副溶血性弧菌VibrioATCC17802parahaemolyticus銅綠假單胞菌PseudomonasATCC27853aerugi

20、nosa乳酸桿菌LactobacillusATCC33222試驗(yàn)樣品的選擇腸桿菌科作為指標(biāo)菌尚未在全球范圍內(nèi)通用，僅限于歐盟。根據(jù)進(jìn)出口飼料和飼料添加劑檢驗(yàn)檢疫監(jiān)督管理辦法 （國家質(zhì)檢總局第 118 號令）和飼料和飼料添加劑管理?xiàng)l例 （國務(wù)院令第 266 號令）中對飼料的定義，歐盟對我國飼料產(chǎn)品腸桿菌科超標(biāo)通報情況， 本標(biāo)準(zhǔn)方法的檢驗(yàn)選取了配合飼料、 寵物食品及咬膠等作為檢驗(yàn)樣品。3.4 相對準(zhǔn)確度試驗(yàn)方法本研究分別選取配合飼料、寵物食品及咬膠等飼料產(chǎn)品，每種選取10 個樣品，對樣品進(jìn)行人工污染，按照低、中、高水平接種（平板計(jì)數(shù)法接種水平為102CFU/g、104CFU/g、 106CFU/g

21、，MPN 法接種水平為 10CFU/g、 102CFU/g、10103CFU/g）為分別進(jìn)行本法與ISO 法的對比檢測。結(jié)果和結(jié)論平板計(jì)數(shù)法 （以大腸埃希氏菌為例）選取配合飼料，將大腸埃希氏菌按照102CFU/g、104 CFU/g、106CFU/g 三個水平進(jìn)行人工污染接種，采用平板計(jì)數(shù)法，分別進(jìn)行本法與ISO 法的對比檢測，對檢測結(jié)果進(jìn)行成對t 檢驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，分析結(jié)果見表2。表 2 本法與 ISO 法進(jìn)行平板計(jì)數(shù)法檢測結(jié)果成對t 檢驗(yàn)分析（大腸埃希氏菌）從表可以分析，在大腸埃希氏菌接種水平為102CFU/g 時，本法與 ISO 法兩兩相減的差值平均數(shù)、 標(biāo)準(zhǔn)差、差值平均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差分別為-

22、0.300、3.622、1.146，95%置信區(qū)間為 -2.891 到 2.291。配對檢驗(yàn)結(jié)果表明t 為-0.262，自由度為 9，兩尾檢驗(yàn)差異顯著水平為0.799，因?yàn)?Sig0.05，故沒有顯著差異，在大腸埃希氏菌接種水平為 102CFU/g 時，可以認(rèn)為本法與ISO 法進(jìn)行平板計(jì)數(shù)法檢測時無顯著性差異；在接種水平為104CFU/g 時，本法與 ISO 法兩兩相減的差值平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差、差值平均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差分別為-140.000、 1073.106、339.346， 95%置信區(qū)間為 -907.653 到 627.653。配對檢驗(yàn)結(jié)果表明t 為-0.413，自由度為 9，兩尾檢驗(yàn)差異顯著水

23、平為0.690，因?yàn)?Sig0.05，故沒有顯著差異，在大腸埃希氏菌接種水平為 104CFU/g 時，可以認(rèn)為本法與ISO 法進(jìn)行平板計(jì)數(shù)法檢測時無顯著性差異；在接種水平為106CFU/g 時，本法與 ISO 法兩兩相減的差值平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差、差值平均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差分別為9.00*103、86467.720、 27343.494， 95%置信11區(qū)間為 -52855.281 到 70855.281。配對檢驗(yàn)結(jié)果表明t 為 0.329，自由度為 9，兩尾檢驗(yàn)差異顯著水平為0.750，因?yàn)?Sig0.05，故沒有顯著差異，在大腸埃希氏菌接種水平為 106CFU/g 時，可以認(rèn)為本法與ISO 法進(jìn)行平板

24、計(jì)數(shù)法檢測時無顯著性差異。因此，在低中高各種不同的接種水平下，可以認(rèn)為本法與 ISO 法進(jìn)行平板計(jì)數(shù)法檢測時無顯著性差異。MPN 法（以大腸埃希氏菌為例）選取配合飼料，將大腸埃希氏菌按照10CFU/g、 102CFU/g、103 CFU/g 三個水平進(jìn)行人工污染接種，采用MPN 法，分別進(jìn)行本法與ISO 法的對比檢測，對兩種檢測方法的檢測結(jié)果進(jìn)行成對t 檢驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，分析結(jié)果見表3。表 3 本法與 ISO 法進(jìn)行 MPN 法檢測結(jié)果成對t 檢驗(yàn)分析表（大腸埃希氏菌）從表可以分析，在大腸埃希氏菌接種水平為10CFU/g 時，本法與 ISO 法兩兩相減的差值平均數(shù)、 標(biāo)準(zhǔn)差、差值平均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差分

25、別為0.100、0.738、0.233，95%置信區(qū)間為 -0.428 到 0.628。配對檢驗(yàn)結(jié)果表明t 為 0.429，自由度為 9，兩尾檢驗(yàn)差異顯著水平為0.678，因?yàn)?Sig0.05，故沒有顯著差異，在大腸埃希氏菌接種水平為10CFU/g 時，可以認(rèn)為本法與ISO 法進(jìn)行平板計(jì)數(shù)法檢測時無顯著性差異；在接種水平為102CFU/g 時，本法與 ISO 法兩兩相減的差值平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差、差值平均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差分別為1.000、7.379、2.333，95%置信區(qū)間為 -4.278到 6.278。配對檢驗(yàn)結(jié)果表明t 為 0.429，自由度為 9，兩尾檢驗(yàn)差異顯著水平為0.678，因?yàn)?Sig0

26、.05，故沒有顯著差異，在大腸埃希氏菌接種水平為103CFU/g12時，可以認(rèn)為本法與ISO 法進(jìn)行平板計(jì)數(shù)法檢測時無顯著性差異；在接種水平為103CFU/g 時，本法與 ISO 法兩兩相減的差值平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差、差值平均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差分別為 30.000、67.495、21.344，95%置信區(qū)間為 -18.283 到 78.283。配對檢驗(yàn)結(jié)果表明 t 為 1.406，自由度為 9，兩尾檢驗(yàn)差異顯著水平為 0.193，因?yàn)?Sig 0.05，故沒有顯著差異，在大腸埃希氏菌接種水平為 103CFU/g 時，可以認(rèn)為本法與 ISO 法進(jìn)行平板計(jì)數(shù)法檢測時無顯著性差異。因此，在低中高各種不同的接種水

27、平下，可以認(rèn)為本法與ISO 法進(jìn)行 MPN法檢測時無顯著性差異。限于篇幅，相對準(zhǔn)確度試驗(yàn)部分僅將大腸埃希氏菌接種到配合飼料的試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析放到本編制說明中， 本研究還分別將福氏志賀氏菌、 大腸埃希氏菌阪崎克羅諾桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、變形桿菌、肺炎克雷伯氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、蜂房哈夫尼菌、歐文氏菌屬、弗氏檸檬酸桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、遲鈍愛德華氏菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌等接種到配合飼料、寵物食品及咬膠等中進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表4、表 5，表中結(jié)果都與前面舉例所示 Sig 0.05 沒有顯著差異，可以認(rèn)為，各種接種水平下， 本法與 ISO法進(jìn)行平板計(jì)數(shù)法和MPN

28、法進(jìn)行飼料產(chǎn)品中腸桿菌科檢驗(yàn)檢測時無顯著性差異。表 4本法與 ISO 法進(jìn)行平板計(jì)數(shù)法檢測結(jié)果成對t 檢驗(yàn)分析表配合飼料咬膠（咀嚼物）試驗(yàn)菌株低中高試驗(yàn)菌株低中高福氏志賀氏菌0.2120.3180.389腸炎沙門氏菌0.780.9350.306大腸埃希氏菌0.7990.690.75痢疾志賀氏菌0.5910.1680.081阪崎克羅諾桿菌0.1380.2440.158變形桿菌0.8111.0000.628鼠傷寒沙門氏菌0.3430.8850.895肺炎克雷伯氏菌0.5910.9090.595寵物日糧其他試驗(yàn)菌株低中高試驗(yàn)菌株低中高小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌0.8740.8380.070粘質(zhì)沙雷氏菌0.

29、7000.8730.73813蜂房哈夫尼菌0.7350.1480.307遲鈍愛德華氏菌0.6230.7210.713歐文氏菌屬0.3220.3430.106陰溝腸桿菌0.6780.3130.688弗氏檸檬酸桿菌0.6420.6650.201產(chǎn)氣腸桿菌1.0000.9320.357表 5 本法與 ISO 法進(jìn)行 MPN 法檢測結(jié)果成對t 檢驗(yàn)分析表配合飼料咬膠（咀嚼物）試驗(yàn)菌株低中高試驗(yàn)菌株低中高福氏志賀氏菌0.6570.3490.410腸炎沙門氏菌0.1380.1680.591大腸埃希氏菌0.6780.6780.193痢疾志賀氏菌0.3930.3210.295阪崎克羅諾桿菌0.2980.394

30、0.591變形桿菌1.0000.5910.177鼠傷寒沙門氏菌0.3430.3520.423肺炎克雷伯氏菌0.7800.4430.242寵物日糧其他試驗(yàn)菌株低中高試驗(yàn)菌株低中高小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌0.3100.0810.707粘質(zhì)沙雷氏菌0.1680.0960.343蜂房哈夫尼菌0.3150.3130.171遲鈍愛德華氏菌0.1680.0950.193歐文氏菌屬0.3310.5370.475陰溝腸桿菌0.4960.0150.193弗氏檸檬酸桿菌1.0000.1400.407產(chǎn)氣腸桿菌0.2440.3190.3433.5 靈敏度試驗(yàn)方法選取飼料廠、銷售門店、電商等不同渠道的自然樣品和人工污染的樣

31、品500份，采用本方法與ISO 法同時檢測，以驗(yàn)證本方法的靈敏度。14結(jié)果和結(jié)論平板計(jì)數(shù)法對 500 份樣品采用本方法與 ISO 法同時檢測，其中 365 份樣品沒有獲得確切的檢測結(jié)果，這些樣品的檢測結(jié)果不參與計(jì)算，其余的 135 份樣品本方法與 ISO法同時取得了結(jié)果。全部數(shù)據(jù)分析和圖表分析都需先將檢測結(jié)果轉(zhuǎn)化成以10 為底的對數(shù)再進(jìn)行， ISO 法結(jié)果為橫坐標(biāo)，本方法的結(jié)果為縱坐標(biāo)，將135 個檢測結(jié)果用 SPSS實(shí)現(xiàn)一元線性回歸分析， 用成對 t 檢驗(yàn)來判定相對準(zhǔn)確性。 用 Excel 在散點(diǎn)圖上添加趨勢線，進(jìn)行一元線性回歸分析，判定是否線性關(guān)系顯著。結(jié)果135 份樣品的檢測結(jié)果分析見表

32、6、圖 1。表 6 135 份樣品兩種方法平板計(jì)數(shù)法檢測結(jié)果分析表15圖 1 147 份樣品兩種方法平板計(jì)數(shù)法檢測結(jié)果的線性關(guān)系線性回歸的方程式為y = 0.9873x + 0.0734R2 = 0.9929，其中 x 為 ISO 法檢測結(jié)果的對數(shù)值， y 為本法檢測結(jié)果的對數(shù)值, 模型精確，回歸效果顯著。由表可知， Sig0.05，故沒有顯著差異，因此可以認(rèn)為本法與ISO 法進(jìn)行平板計(jì)數(shù)法檢測時無顯著性差異。法對 500 份樣品采用本方法與ISO 法同時檢測，其中 340 份樣品沒有獲得確切的檢測結(jié)果，這些樣品的檢測結(jié)果不參與計(jì)算，其余的160 份樣品本方法與ISO法同時取得了結(jié)果。全部數(shù)據(jù)

33、分析和圖表分析都需先將檢測結(jié)果轉(zhuǎn)化成以10 為底的對數(shù)再進(jìn)行， ISO 法結(jié)果為橫坐標(biāo)，本方法的結(jié)果為縱坐標(biāo)，將160 個檢測結(jié)果用 SPSS實(shí)現(xiàn)一元線性回歸分析， 用成對 t 檢驗(yàn)來判定相對準(zhǔn)確性。 用 Excel 在散點(diǎn)圖上添加趨勢線，進(jìn)行一元線性回歸分析，判定是否線性關(guān)系顯著。結(jié)果160 份樣品的檢測結(jié)果分析見表7、圖 2。表 7 160 份樣品兩種方法MPN 法檢測結(jié)果分析表16圖 2 160 份樣品兩種方法MPN 法檢測結(jié)果的線性關(guān)系線性回歸的方程式為 y = 0.9993x R2 = 0.9947，其中 x 為 ISO 法檢測結(jié)果的對數(shù)值， y 為本法檢測結(jié)果的對數(shù)值，模型精確，回

34、歸效果顯著。由表可知， Sig17 0.05，故沒有顯著差異，因此可以認(rèn)為本法與ISO 法進(jìn)行 MPN 法檢測時無顯著性差異。3.6 特異性試驗(yàn)方法選取 21 株腸桿菌科菌株和6 株非腸桿菌科菌株， 這 27 株菌分別接種到經(jīng)過滅菌處理的 27 份配合飼料（平板計(jì)數(shù)法為104CFU/g，MPN 法接種水平為102CFU/g），分別用本法和ISO 法進(jìn)行定性分析，試驗(yàn)結(jié)果見表8。結(jié)果和結(jié)論表 8特異性試驗(yàn)表平板計(jì)數(shù)法MPN法菌株名菌株號ISO 法ISO 法本法本法福氏志賀氏菌ATCC12022陽性陽性陽性陽性大腸埃希氏菌ATCC25922陽性陽性陽性陽性阪崎克羅諾桿菌ATCC29544陽性陽性陽

35、性陽性鼠傷寒沙門氏菌ATCC50115陽性陽性陽性陽性腸炎沙門氏菌FSCC215004陽性陽性陽性陽性痢疾志賀氏菌FSCC219003陽性陽性陽性陽性變形桿菌FSCC204002陽性陽性陽性陽性肺炎克雷伯氏菌FSCC167002陽性陽性陽性陽性小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌FSCC234002陽性陽性陽性陽性蜂房哈夫尼菌CICC10188陽性陽性陽性陽性歐文氏菌屬CICC23780陽性陽性陽性陽性弗氏檸檬酸桿菌FSCC135002陽性陽性陽性陽性粘質(zhì)沙雷氏菌GIM1.218陽性陽性陽性陽性遲鈍愛德華氏菌ATCC15947陽性陽性陽性陽性陰溝腸桿菌ATCC13047陽性陽性陽性陽性18產(chǎn)氣腸桿菌ATCC1

36、3048陽性陽性陽性陽性肺炎克雷伯氏菌9NVB陽性陽性陽性陽性大腸桿菌ATCC2580陽性陽性陽性陽性沙門氏菌SL1334陽性陽性陽性陽性大腸桿菌E058陽性陽性陽性陽性大腸桿菌E526陽性陽性陽性陽性金黃色葡萄球菌金黃亞種ATCC6538陰性陰性陰性陰性單增李斯特氏菌ATCC10890陰性陰性陰性陰性糞腸球菌ATCC29212陰性陰性陰性陰性副溶血性弧菌ATCC17802陰性陰性陰性陰性銅綠假單胞菌ATCC27853陰性陰性陰性陰性乳酸桿菌ATCC33222陰性陰性陰性陰性經(jīng)試驗(yàn)， 21 腸桿菌科的株菌用本法和ISO 法定性檢測，結(jié)果均為陽性，6株非腸桿菌科的株菌用本法和ISO 法定性檢測，

37、結(jié)果均為陰性。具體結(jié)果見表 9。表 9 特異性試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算表平板計(jì)數(shù)法MPN法定性結(jié)果本法ISO 法本法ISO 法陽性21212121陰性6666總計(jì)27272727靈敏度 p+（平板計(jì)數(shù)法） =21/21=100%靈敏度 p+（MPN ）=21/21=100%特異性 p-（平板計(jì)數(shù)法） =6/6=100%特異性 p-（ MPN） =6/6=100%根據(jù)表中結(jié)果， 本法用平板計(jì)數(shù)法檢測腸桿菌科的靈敏度 p+為 100%，特異性為 100%；本法用 MPN 法檢測腸桿菌科的靈敏度 p+為 100%，特異性為 100%。3.7 驗(yàn)證試驗(yàn)2017 年 3 月，我單位制備編號為1#5#的人工污染的陽性配合飼料樣品，編號為 6#10#的陰性飼料樣品，均勻分成3 份，分別送至重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局19檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心、 天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物與食品檢測中心和山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心進(jìn)行驗(yàn)證。陰性樣品是將配合飼料放在90烘箱滅菌 4 小時，用復(fù)壯的金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株菌液均勻浸染， 后自然無菌晾干； 陽性樣品是將經(jīng)過90烘箱