分子生物學研究技術(理論)

1、分子生物學研究技術朱國輝一般認為一般認為1973年是基因工程誕生的元年。年是基因工程誕生的元年。上世紀上世紀40年代年代70年代初分子生物學領域年代初分子生物學領域理論理論上的三大發(fā)現上的三大發(fā)現和和技術上的三大發(fā)明技術上的三大發(fā)明對于基因工程對于基因工程的誕生起到了決定性的作的誕生起到了決定性的作。第一節(jié)第一節(jié) 基因工程的誕生基因工程的誕生1944年，年，Avery O.T.利用肺炎雙球菌轉化實驗利用肺炎雙球菌轉化實驗1、DNA是遺傳物質被證實是遺傳物質被證實理論上的三大發(fā)現理論上的三大發(fā)現40年代，證實年代，證實DNA是遺傳物質是遺傳物質 早在上世紀早在上世紀20年代，已經知道染色年代，已

2、經知道染色體由體由DNA和組蛋白構成，但組成蛋白和組蛋白構成，但組成蛋白的的氨基酸有氨基酸有20種種，而組成，而組成DNA的的核苷核苷酸只有酸只有4種種，什么是遺傳物質？，什么是遺傳物質？ 1928年，英國微生物學家年，英國微生物學家F. Griffith著名的肺炎雙球菌感染小白鼠著名的肺炎雙球菌感染小白鼠實驗。實驗。 （1）S型：注射小白鼠，死亡。型：注射小白鼠，死亡。 （2）S型，型，65 加熱：注射小白加熱：注射小白鼠，活。鼠，活。 （3）R型：注射小白鼠，活。型：注射小白鼠，活。 （4） 65 加熱加熱S型型+R型：注射小型：注射小白鼠，死亡。死鼠體內得到了白鼠，死亡。死鼠體內得到了S

3、型菌。型菌。 40年代，年代，DNA是遺傳物質被證實是遺傳物質被證實1944年，美國洛克菲勒研究所的年，美國洛克菲勒研究所的Oswald Avery等公等公開發(fā)表了改進的肺炎雙球菌實驗結果。開發(fā)表了改進的肺炎雙球菌實驗結果。 （1） S型菌無細胞提取物及其型菌無細胞提取物及其純化的純化的DNA都可都可使使R型菌轉變成型菌轉變成S型菌；型菌； （2）經）經DNase 處理的處理的S型菌無細胞提取物失去型菌無細胞提取物失去了轉化作用。了轉化作用。 （3）經）經胰蛋白酶胰蛋白酶處理的處理的S型菌無細胞提取物仍型菌無細胞提取物仍有轉化作用。有轉化作用。 不僅證實了不僅證實了DNA是遺傳物質，而且證明了

4、是遺傳物質，而且證明了DNA可以將一個細菌的性狀轉給另一個細菌，他的工作可以將一個細菌的性狀轉給另一個細菌，他的工作被稱為是被稱為是現代生物科學的革命性開端現代生物科學的革命性開端。Watson 和和Crick2、DNA雙螺旋模型的提出雙螺旋模型的提出50年代，年代，DNA的雙螺旋模型的提出的雙螺旋模型的提出和和DNA復制機理的闡明復制機理的闡明 DNA是遺傳物質已被證實，但是是遺傳物質已被證實，但是DNA是怎樣攜是怎樣攜帶并傳遞遺傳信息的？在細胞增殖過程中，帶并傳遞遺傳信息的？在細胞增殖過程中，DNA是是怎樣復制的？因此，對于怎樣復制的？因此，對于DNA結構的研究成為了當結構的研究成為了當時

5、生物學家研究的熱點。時生物學家研究的熱點。 1953年，年，Francis Crick和和James Watson搜集了搜集了力所能及的資料，提出了力所能及的資料，提出了DNA的雙螺旋模型。的雙螺旋模型。隨后，隨后，DNA的的半保留復制半保留復制和和半不連續(xù)半不連續(xù)復制機理也被闡明，復制機理也被闡明，為基因工程的誕生奠定了堅實的理論基礎。為基因工程的誕生奠定了堅實的理論基礎。 Nireberg等為代表的等為代表的一批科學家一批科學家3、“中心法則中心法則”的提出的提出60年代，確定了遺傳信息的傳遞方式年代，確定了遺傳信息的傳遞方式（中心法則）（中心法則） 既然，既然，DNA是遺傳信息的載體，那

6、么它是如何傳遞遺傳是遺傳信息的載體，那么它是如何傳遞遺傳信息的呢？遺傳信息又是如何控制生物的表型性狀的呢？信息的呢？遺傳信息又是如何控制生物的表型性狀的呢？以以Nireberg等為代表的一批科學家等為代表的一批科學家經過艱苦的努力，確定了經過艱苦的努力，確定了遺傳信息以密碼方式傳遞，每三個核苷酸組成一個密碼子，遺傳信息以密碼方式傳遞，每三個核苷酸組成一個密碼子，代表一個氨基酸，到代表一個氨基酸，到1966年，全部破譯了年，全部破譯了64個密碼子，個密碼子，并提并提出了遺傳信息傳遞的出了遺傳信息傳遞的“中心法則中心法則”。 Smith等分離并純化了限制性核酸內切酶等分離并純化了限制性核酸內切酶H

7、ind II， 1972年，年，Boyer等相繼發(fā)現了等相繼發(fā)現了coR I 一類重要的限制性內切酶。一類重要的限制性內切酶。 1、限制性核酸內切酶的發(fā)現和應用、限制性核酸內切酶的發(fā)現和應用技術上的三大發(fā)明技術上的三大發(fā)明1967年，世界上又五個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現年，世界上又五個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現DNA連接酶，特別是連接酶，特別是1970年年Khorana等發(fā)現的等發(fā)現的T4 DNA連接酶具有更高的連接活性。連接酶具有更高的連接活性。2、DNA連接酶的發(fā)現和應用連接酶的發(fā)現和應用1972年，美國年，美國Stanford大學的大學的P. Berg 等首次成功地實現了等首次成功地實現了DNA的體外

8、重組；的體外重組；3、載體的發(fā)現及其應用、載體的發(fā)現及其應用1973年，年，Stanford大學的大學的Cohen等成功地利用體外重組實等成功地利用體外重組實現了細菌間性狀的轉移?，F了細菌間性狀的轉移。這一年被定為基因工程誕生的元年。這一年被定為基因工程誕生的元年。3、載體的發(fā)現及其應用、載體的發(fā)現及其應用CohenCohen等的重組實驗示意圖等的重組實驗示意圖TcrNerEco RIEco RI連接酶連接酶TcrNer雙抗重組菌落雙抗重組菌落基因工程發(fā)展史上首次實現了重組基因工程發(fā)展史上首次實現了重組DNA的細菌轉化的細菌轉化基因工程研究的基本步驟基因工程研究的基本步驟1 1、從生物體中分離

9、得到目的基因（或、從生物體中分離得到目的基因（或DNADNA片段）片段）2 2、在體外，將目的基因插入能自我復制的載體中得到、在體外，將目的基因插入能自我復制的載體中得到 重組重組DNADNA分子。分子。3 3、將重組、將重組DNADNA分子導入受體細胞中，并進行繁殖。分子導入受體細胞中，并進行繁殖。4 4、選擇得到含有重組、選擇得到含有重組DNADNA分子的細胞克隆，并進行大量分子的細胞克隆，并進行大量 繁殖，從而使得目的基因得到擴增。繁殖，從而使得目的基因得到擴增。5 5、進一步對獲得的目的基因進行研究和利用。比如，、進一步對獲得的目的基因進行研究和利用。比如， 序列分析、表達載體構建、原

10、核表達以及轉基因研究序列分析、表達載體構建、原核表達以及轉基因研究 和利用等。和利用等?；蚬こ痰幕玖鞒袒蚬こ痰幕玖鞒袒蚍只蚍蛛x酶切離酶切載體酶切載體酶切基因和載基因和載體連接體連接導入細菌導入細菌重組質粒繁殖重組質粒繁殖重組克隆的選擇重組克隆的選擇序列分析和基序列分析和基因表達等研究因表達等研究導入導入植物植物細胞細胞第二章第二章 基因操作的工具酶基因操作的工具酶第一節(jié)第一節(jié) 限制性核酸內切酶及其應用限制性核酸內切酶及其應用第二節(jié)第二節(jié) DNA連接酶及其應用連接酶及其應用第三節(jié)第三節(jié) DNA聚合酶及其應用聚合酶及其應用Genetic engineering is largely a

11、n exercise in carefully controlled enzymology. A variety of enzymes form the basic toolkit of the genetic engineer. 1、限制性核酸內切酶的分類合命名、限制性核酸內切酶的分類合命名2、II型限制性核酸內切酶的基本特性型限制性核酸內切酶的基本特性3、限制性核酸內切酶的消化反應、限制性核酸內切酶的消化反應第一節(jié)第一節(jié) 限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶的概念限制性核酸內切酶的概念已經從近已經從近300中微中微生物中分離出了生物中分離出了500余種限制性核酸內切酶。余種限制

12、性核酸內切酶。限制性核酸內切酶的分類限制性核酸內切酶的分類1. 限制修飾活性限制修飾活性2. 內切酶的蛋白內切酶的蛋白 質結構質結構3. 限制輔助因子限制輔助因子4. 切割位點切割位點5. 特異性切割特異性切割6. 基因克隆中基因克隆中 I 型型單一多功能的酶單一多功能的酶3種不同亞基種不同亞基ATP、Mg2+和和S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸距特異性位點距特異性位點1000bp不是不是無用無用 II 型型限制酶和修飾酶分開限制酶和修飾酶分開單一成分單一成分Mg2+特異性位點及其附近特異性位點及其附近是是非常有用非常有用 III 型型雙功能酶雙功能酶2種亞基種亞基ATP、Mg2+和和S-腺苷甲硫

13、氨酸腺苷甲硫氨酸特異性位點特異性位點3端端24-26bp處處是是有用有用限制性核酸內切酶的命名限制性核酸內切酶的命名1、寄主菌屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成寄主菌屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成3個斜體個斜體 字母的略語表示酶來源的菌種名稱，如大腸桿菌字母的略語表示酶來源的菌種名稱，如大腸桿菌Escherichia coli 表示為表示為Eco , 流感嗜血菌流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示為表示為 Hin；2、用一個正體字母表示菌株的類型，比如用一個正體字母表示菌株的類型，比如EcoR、Hind；3、如果一種特殊的寄主菌株具有幾個不同的限制修飾體系，

14、則如果一種特殊的寄主菌株具有幾個不同的限制修飾體系，則 用羅馬數字標出，比如用羅馬數字標出，比如Eco R I、 Hind III。IIII型限制性核酸內切酶的型限制性核酸內切酶的3 3大特點大特點1、識別位點的特異性、識別位點的特異性 每種酶都有其特定的每種酶都有其特定的DNA識別識別 位點，通常是由位點，通常是由4、5、6或或7個核苷酸組成的特定序個核苷酸組成的特定序 列（靶序列）。列（靶序列）。2、識別序列的對稱性、識別序列的對稱性 靶序列通常具有雙重旋轉對稱靶序列通常具有雙重旋轉對稱 的結構，即雙鏈的核苷酸順序呈回文結構。的結構，即雙鏈的核苷酸順序呈回文結構。3、切割位點的規(guī)范性、切割

15、位點的規(guī)范性 雙鏈雙鏈DNA被酶切后，分布在兩被酶切后，分布在兩 條鏈上的切割位點旋轉對稱（可形成粘性末端或平條鏈上的切割位點旋轉對稱（可形成粘性末端或平 末端的末端的DNA分子）。分子）。與與II型核酸內切酶有關的幾個概念型核酸內切酶有關的幾個概念粘性末端粘性末端 cohesive ends 因酶切位點在兩條因酶切位點在兩條DNADNA單單鏈上不同（對稱）酶切后形成的具有互補堿基的單鏈上不同（對稱）酶切后形成的具有互補堿基的單鏈末端結構，酶切產生的兩個粘性末端很鏈末端結構，酶切產生的兩個粘性末端很容易容易通過通過互補堿基的配對而重新互補堿基的配對而重新連接連接起來。起來。平平 末末 端端 B

16、lunt end Blunt end 因酶切位點在兩條因酶切位點在兩條DNADNA單鏈單鏈上相同，酶切后形成的平齊的末端結構，這種末端上相同，酶切后形成的平齊的末端結構，這種末端不易不易重新重新連接連接起來。起來。幾種幾種IIII型限制性核酸內切酶的酶切位點型限制性核酸內切酶的酶切位點Pst IProvindencia stuartii 164 CTGCAGGACGTCHaemophilus influenzae Rd 一個酶單位一個酶單位（U）指：指：在理想的反應條件（適宜的在理想的反應條件（適宜的緩沖液和反應溫度，通常為緩沖液和反應溫度，通常為37）下，）下，50 L反應體系反應體系中完全

17、降解中完全降解1 g DNA所需要的酶量。所需要的酶量。影響酶活性的因素很多，最重要的有：影響酶活性的因素很多，最重要的有：A. DNA的純度和甲基化程度的純度和甲基化程度B. 甘油的含量（不超過甘油的含量（不超過5%）C. 反應體系中的離子強度反應體系中的離子強度D. 反應體系的反應體系的pH值值F. 反應的溫度條件反應的溫度條件 （通常為（通常為37 ）酶單位的定義和影響酶活性的因素酶單位的定義和影響酶活性的因素Buffer (10X) 2.0 LWater 16.5 LDNA 1.0 LEnzyme 0.5 LVolume 20.0 L 酶酶 切切 反反 應應 的的 基基 本本 步步 驟

18、驟電泳紫外分析37 1h加反應液CKMBuffer (10X) 2.0 LWater 16.5 LDNA 1.0 LEnzyme 0.5 LVolume 20.0 L 1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT1、DNA連接酶作用的特點連接酶作用的特點2、DNA連接酶的反應條件連接酶的反應條件第二節(jié)第二節(jié) DNA連接酶及其應用連接酶及其應用DNA連接酶作用的特點連接酶作用的特點A. A. 連接的兩條鏈必須分別具有連接的兩條鏈必須分別具有 33端自由羥基（端自由羥基（-OH-OH） 和和5 5 端磷酸基團（端磷酸基團（-P-P），），而且只有這兩個基團彼而且只有這兩個基團彼 此

19、相鄰時才能進行連接反應；此相鄰時才能進行連接反應；B. B. 在羥基和磷酸基團間形成磷酸二酯鍵是一種耗能過在羥基和磷酸基團間形成磷酸二酯鍵是一種耗能過 程，因此連接反應必須有能量分子的參與，通常有程，因此連接反應必須有能量分子的參與，通常有 兩種能量分子，即兩種能量分子，即ATPATP和和NAD+NAD+。OKNODNA連接反應的條件連接反應的條件 連接反應最佳溫度為連接反應最佳溫度為3737，但是此時粘性末端間氫鍵結合不，但是此時粘性末端間氫鍵結合不夠穩(wěn)定，而且酶活性也會迅速降低夠穩(wěn)定，而且酶活性也會迅速降低。比如，比如，EcoRIEcoRI 粘性末端連接粘性末端連接部位只有部位只有4 4個

20、堿基對，很容易斷開。所以個堿基對，很容易斷開。所以通常在通常在4-164-16連接。連接。影響連接效率的因素有：影響連接效率的因素有：A. A. 溫度（最主要的因素）溫度（最主要的因素）B. ATPB. ATP的濃度的濃度( 10 M - 1 M )C. C. 連接酶濃度（平末端較粘性末端要求高）連接酶濃度（平末端較粘性末端要求高）D. D. 反應時間（通常連接過夜）反應時間（通常連接過夜）E. E. 插入片段和載體片段插入片段和載體片段 的摩爾比的摩爾比轉化4 過夜加反應液CK-重組菌落重組菌落CK+粘性末端粘性末端DNA片段的連接片段的連接NickNick1、大腸桿菌、大腸桿菌DNA聚合酶

21、聚合酶I2、Klenow片段片段第第三節(jié)三節(jié) DNA聚合酶及其應用聚合酶及其應用 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I （E。Coli DNA pol I）是）是Kornberg A. 1956年首先從大腸桿菌年首先從大腸桿菌E。Coli 細胞中分離出來的。它是一細胞中分離出來的。它是一種多功能性的酶，包括種多功能性的酶，包括 3 3種不同的酶活力：種不同的酶活力：A. 5- 3聚合酶活性聚合酶活性 以雙鏈以雙鏈DNA為模板，催化單核苷酸結合到引為模板，催化單核苷酸結合到引物的物的3末端，并不斷延伸。末端，并不斷延伸。B. 5- 3外切酶活性外切酶活性 將雙鏈將雙鏈DNA中中游離的游離的5末端

22、逐個切去。末端逐個切去。C. 3 - 5外切酶活性外切酶活性 將游離的雙鏈或單鏈將游離的雙鏈或單鏈DNA的的3端降解。不過端降解。不過對于雙鏈的降解可被對于雙鏈的降解可被5-3的多聚活性所抑制。的多聚活性所抑制。CCGGGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPol I + Mg2+ATAGCCTCCGATAGCCTGGCTATCGGACCGATAGCCTGGCTACCGATAGCCTGGCTATCGGAPol I + Mg2+CCGATAGCCTGGCTAPol I + Mg2+T1、大腸桿菌、大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I2、Klenow片段片段第第三節(jié)三節(jié) DNA聚合酶及其應用聚合酶及

23、其應用 Klenow片段的主要用途片段的主要用途KlenowKlenow片段片段大腸桿菌聚合酶大腸桿菌聚合酶 I I 全酶經枯草桿菌蛋白酶處理后產生全酶經枯草桿菌蛋白酶處理后產生的大片段酶分子，它仍然有的大片段酶分子，它仍然有5353的聚合酶活性和的聚合酶活性和3 3 5 5 的核的核酸外切酶活性，但失去了酸外切酶活性，但失去了5353的外切酶活性。的外切酶活性。KlenowKlenow片段的主要用途片段的主要用途A.A. 修補限制性酶消化修補限制性酶消化DNADNA形成的形成的33隱蔽末端隱蔽末端B.B. 標記標記DNADNA片段的末端片段的末端C.C. cDNAcDNA克隆中第二鏈克隆中第

24、二鏈cDNAcDNA的合成的合成D.D. DNADNA序列的測定序列的測定GAACTTAA第三章第三章 基因克隆的載體基因克隆的載體引引 言（言（introduction）第一節(jié)第一節(jié) 質粒載體（質粒載體（plasimid vectors）第二節(jié)第二節(jié) 噬菌體載體（噬菌體載體（phage vectors）第三節(jié)第三節(jié) 柯斯質粒載體（柯斯質粒載體（cosmid vectors） 第四節(jié)第四節(jié) 人工染色體載體（人工染色體載體（B/Y/HAC）引引 言言基因克隆的本質基因克隆的本質是使目的基因在特定的條件下得到是使目的基因在特定的條件下得到擴擴增和表達增和表達，而目的基因本身無法進行復制，所以，而目

25、的基因本身無法進行復制，所以就必須借助于就必須借助于“載體載體”及其及其“寄主細胞寄主細胞”來實現。來實現。作為基因克隆的載體必須具備以下特性：作為基因克隆的載體必須具備以下特性：A. 能在寄主細胞中進行獨立的復制和表達；能在寄主細胞中進行獨立的復制和表達；B. 具有具有1-2個選擇標記基因，如對抗生素的抗性基因等；個選擇標記基因，如對抗生素的抗性基因等；C. 具備多克隆位點（具備多克隆位點（MCS），），而且可攜帶外源而且可攜帶外源DNA片段的長片段的長度范圍較寬。度范圍較寬。D. 自身分子量較小，在寄主細胞中的拷貝數高，易于操作和自身分子量較小，在寄主細胞中的拷貝數高，易于操作和DNA的制

26、備。的制備。Characteristics of vectors for gene Characteristics of vectors for gene cloningcloningMCSMarkerForeign gene第三章第三章 基因克隆的載體基因克隆的載體引引 言（言（introduction）第一節(jié)第一節(jié) 質粒載體（質粒載體（plasimid vectors）第二節(jié)第二節(jié) 噬菌體載體（噬菌體載體（phage vectors）第三節(jié)第三節(jié) 柯斯質粒載體（柯斯質粒載體（cosmid vectors） 第四節(jié)第四節(jié) 人工染色體載體（人工染色體載體（B/Y/HAC）第一節(jié)第一節(jié) 質粒載體

27、質粒載體（plasimid vectors）1、質粒載體的生物學特性、質粒載體的生物學特性2、質粒載體相關知識介紹、質粒載體相關知識介紹1.1.質粒載體的生物學特性質粒載體的生物學特性（1）質粒質粒是是一種廣泛從在于細菌細胞中一種廣泛從在于細菌細胞中染色體以染色體以 外外的能的能自主的復制自主的復制的裸露的的裸露的環(huán)狀雙鏈環(huán)狀雙鏈DNADNA分子，比病毒更分子，比病毒更簡單。在霉菌、藍簡單。在霉菌、藍藻、酵母和一些動藻、酵母和一些動植物細胞中也發(fā)現植物細胞中也發(fā)現了質粒，目前對細了質粒，目前對細菌的質粒研究得比菌的質粒研究得比較深入，特別是大較深入，特別是大腸桿菌的質粒。腸桿菌的質粒。1.1.

28、質粒載體的生物學特性質粒載體的生物學特性（2）質粒的大小質粒的大小差異很大差異很大，最小的只有，最小的只有1kb,1kb,只能只能 編碼中等大小的編碼中等大小的2-32-3種蛋白質分子，最大的達到種蛋白質分子，最大的達到 200kb200kb。（3）質粒的生存質粒的生存在寄主細胞中在寄主細胞中“友好友好”地地“借借居居”，離開了寄主它本身無法復制，它可以賦，離開了寄主它本身無法復制，它可以賦予予 寄主一些非染色體控制的遺傳性狀，以寄主一些非染色體控制的遺傳性狀，以利于寄利于寄 主的生存。比如，對抗菌素的抗性，對重金屬主的生存。比如，對抗菌素的抗性，對重金屬 的抗性等。的抗性等。1.1.質粒載體

29、的生物學特性質粒載體的生物學特性（4）質粒的復制類型質粒的復制類型一種質粒在宿主細胞中存一種質粒在宿主細胞中存在的數目稱為該質粒的在的數目稱為該質粒的拷貝數拷貝數。據拷貝數將質粒分為。據拷貝數將質粒分為兩種復制型：兩種復制型：“嚴緊型嚴緊型”質粒質粒（stigentstigent plasmid plasmid）, ,拷貝數為拷貝數為1-31-3；“松弛型松弛型”質粒（質粒（relaxed plasmidrelaxed plasmid）, ,拷貝數為拷貝數為10-6010-60。不過，即使是同一質粒，其拷貝數在。不過，即使是同一質粒，其拷貝數在不同的寄主細胞間也可能有很大的變化。不同的寄主細胞

30、間也可能有很大的變化。（5）質粒的不親和性質粒的不親和性兩種親緣關系密切的不同兩種親緣關系密切的不同質粒不能在同一宿主細胞中穩(wěn)定共存。質粒不能在同一宿主細胞中穩(wěn)定共存。1.1.質粒載體的生物學特性質粒載體的生物學特性（6）質粒的存在形式質粒的存在形式有超螺旋、開環(huán)雙螺旋和有超螺旋、開環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋三種，線狀雙螺旋三種，雙螺旋共價閉合雙螺旋共價閉合環(huán)（超螺旋）環(huán)（超螺旋）開環(huán)雙螺旋開環(huán)雙螺旋（一個裂口）（一個裂口）線狀雙螺旋線狀雙螺旋（兩個裂口）（兩個裂口）第一節(jié)第一節(jié) 質粒載體質粒載體（plasimid vectors）1、質粒載體的生物學特性、質粒載體的生物學特性2、質粒載體相關知識介

31、紹、質粒載體相關知識介紹質粒：質粒：是一種裸露的雙鏈閉環(huán)是一種裸露的雙鏈閉環(huán)DNA分子，它們在寄主細胞中分子，它們在寄主細胞中能夠獨立地自我復制從而得到不斷的繁殖。作為基因工程載體，能夠獨立地自我復制從而得到不斷的繁殖。作為基因工程載體，質粒至少應該具備質粒至少應該具備復制的起始區(qū)、選擇標記基因區(qū)、多克隆位復制的起始區(qū)、選擇標記基因區(qū)、多克隆位點點等部分。等部分。多克隆位點多克隆位點：克隆載體中的一段用于插入外源克隆載體中的一段用于插入外源DNA片段的片段的特定區(qū)域，由一系列的緊密相連的限制性內切酶位點組成，而特定區(qū)域，由一系列的緊密相連的限制性內切酶位點組成，而且每個限制性內切酶位點應該在整

32、個載體中是唯一的。且每個限制性內切酶位點應該在整個載體中是唯一的。選擇標記基因：選擇標記基因：在基在基因工程中的一類用于選擇因工程中的一類用于選擇轉化細胞（菌）的抗性基轉化細胞（菌）的抗性基因，通常是一些抗生素抗因，通常是一些抗生素抗性基因，比如對氨芐青霉性基因，比如對氨芐青霉素、四環(huán)素、氯霉素、卡素、四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素以及潮霉素等具有那霉素以及潮霉素等具有抗性的基因。這樣，通過抗性的基因。這樣，通過在培養(yǎng)基中加入特定的抗在培養(yǎng)基中加入特定的抗生素就可以選自得到轉化生素就可以選自得到轉化的細胞（菌）。的細胞（菌）。（1） -互補互補 (alpha-complementation) 大腸桿

33、菌大腸桿菌 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 可以和其底物可以和其底物X-Gal 相互作相互作用并且釋放出一種藍色物質，當該酶的用并且釋放出一種藍色物質，當該酶的 -片段片段和和 -片片段段分開時就失去了這種顯色的功能。通常將編碼該酶分開時就失去了這種顯色的功能。通常將編碼該酶 -片段片段的的LacZ 基因插入到載體的多克隆位點的側翼序基因插入到載體的多克隆位點的側翼序列中，而在一些人工構建的大腸桿菌株系中卻只能編列中，而在一些人工構建的大腸桿菌株系中卻只能編碼產生該酶的碼產生該酶的 片段片段。這樣一來，含有功能性完整的。這樣一來，含有功能性完整的LacZ 基因的載體導入到這類寄主細胞中時，載體編碼基因

34、的載體導入到這類寄主細胞中時，載體編碼的的 -片段片段就能和寄主編碼的就能和寄主編碼的 片段片段發(fā)生互補并具有了發(fā)生互補并具有了對底物對底物X-gal的作用功能（發(fā)生顯色反應），這種現象的作用功能（發(fā)生顯色反應），這種現象被成為是被成為是 alpha-complementation.2. 質粒載體相關知識介紹質粒載體相關知識介紹 所以含有這類載體的菌落就很容易在含有底物所以含有這類載體的菌落就很容易在含有底物X-Gal和誘導物和誘導物IPTG的平板上分辨出來。因為這類菌落中的平板上分辨出來。因為這類菌落中釋 放 出 的釋 放 出 的 藍藍色 物 質 可 以色 物 質 可 以將 整 個 菌 落將

35、 整 個 菌 落染 成 藍 色 ，染 成 藍 色 ，非 常 容 易 辨非 常 容 易 辨別。別。2. 質粒載體相關知識介紹質粒載體相關知識介紹（2）PBR322 This is one of the earliest general purpose cloning vectors to be developed. It is a 4363 bp plasmid with two antibiotic resistance genes, for ampicillin and tetracycline. There are several unique restriction sites. pBR

36、322 generally does not give such a high yield of plasmid DNA as modern vectors such as pUC, pGEM and pBluescript2. 質粒載體相關知識介紹質粒載體相關知識介紹pBR3224363連接加反應液Tet or AmpTet + AmpCK+2. 質粒載體相關知識介紹質粒載體相關知識介紹思考題1.什么是限制性核酸內切酶，它們是怎樣命名什么是限制性核酸內切酶，它們是怎樣命名的？的？2.II型限制性核酸內切酶的基本特性有哪些？型限制性核酸內切酶的基本特性有哪些？3.什么是粘性末端、平末端？什么是粘性末端、平末端？4.酶的單位是怎樣定義的，影響酶活性的因素酶的單位是怎樣定義的，影響酶活性的因素有哪些？有哪些？5.DNA連接酶的作用特點有哪些？連接酶的作用特點有哪些？6.大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I 有哪些不同的酶活力有哪些不同的酶活力特性，各有何利用價值。特性，各有何利用價值。7.Klenow片段和大腸桿菌片段和大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I有何異有何異同？同？8.基因克隆的載體必須具備哪些特性？基因克隆的載體必須具備哪些特性？9.質粒載體的生物學特性有哪些？質粒載體的生物學特性有哪些？PCR技