基因工程的基本步驟PPT學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1基因工程的基本步驟基因工程的基本步驟基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序目標(biāo)引領(lǐng)目標(biāo)引領(lǐng)：1 1、能說出基因工程基本操作程序的四個步驟、能說出基因工程基本操作程序的四個步驟2 2、能準(zhǔn)確描述獲取目的基因的方法、能準(zhǔn)確描述獲取目的基因的方法3 3、能說出基因表達載體的具體元件、能說出基因表達載體的具體元件第1頁/共30頁2 2、何為目的基因，獲取目的基因的方法有那幾種？、何為目的基因，獲取目的基因的方法有那幾種？3 3、何為基因文庫，有幾種類型，如何構(gòu)建？它們、何為基因文庫，有幾種類型，如何構(gòu)建？它們之之 間有何區(qū)別？間有何區(qū)別？4 4、PCRPCR技術(shù)的具體過程包括幾步，需要哪

2、些條件？技術(shù)的具體過程包括幾步，需要哪些條件？6 6、基因表達載體構(gòu)建的目的是什么？應(yīng)包括那些、基因表達載體構(gòu)建的目的是什么？應(yīng)包括那些具具 體元件？體元件？5 5、人工合成目的基因如何進行？、人工合成目的基因如何進行？第2頁/共30頁1 1、為什么要構(gòu)建基因文庫？直接從含有目的基因的生、為什么要構(gòu)建基因文庫？直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取行嗎？物體內(nèi)提取行嗎？2 2、為什么、為什么cDNAcDNA文庫中的基因不含有啟動子和內(nèi)含子？文庫中的基因不含有啟動子和內(nèi)含子？為什么基因組文庫中的基因只有部分能進行物種間基為什么基因組文庫中的基因只有部分能進行物種間基因交流？因交流？3 3、PCRPCR

3、技術(shù)擴增目的基因的方法應(yīng)具備什么條件？技術(shù)擴增目的基因的方法應(yīng)具備什么條件？4 4、如何構(gòu)建基因表達載體？、如何構(gòu)建基因表達載體？5 5、基因表達載體各元件分別有那些、基因表達載體各元件分別有那些具體作用具體作用第3頁/共30頁基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 第二課時第二課時目標(biāo)引領(lǐng)目標(biāo)引領(lǐng)：1 1、能說出目的基因?qū)胧荏w細胞的基本方法、能說出目的基因?qū)胧荏w細胞的基本方法2 2、能準(zhǔn)確描述目的基因檢測與鑒定的方法和步驟、能準(zhǔn)確描述目的基因檢測與鑒定的方法和步驟第4頁/共30頁2 2、如何確定、如何確定轉(zhuǎn)化成功轉(zhuǎn)化成功？需要確認(rèn)那些信息？用什？需要確認(rèn)那些信息？用什么么 具體的方

4、法？具體的方法？第5頁/共30頁1 1、農(nóng)桿菌有何特點，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的、農(nóng)桿菌有何特點，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的原理是什么原理是什么？用？用 文字和箭頭寫出具體過程文字和箭頭寫出具體過程2 2、根據(jù)農(nóng)桿菌可以將目的基因?qū)腚p子葉植物的機理、根據(jù)農(nóng)桿菌可以將目的基因?qū)腚p子葉植物的機理，你能否設(shè)計一個方案將一個抗病基因?qū)雴巫尤~植，你能否設(shè)計一個方案將一個抗病基因?qū)雴巫尤~植物中？物中？3 3、請用文字和箭頭寫出顯微注射法的、請用文字和箭頭寫出顯微注射法的具體過程具體過程4 4、作為受體生物原核生物有何優(yōu)點？請用文字和箭、作為受體生物原核生物有何優(yōu)點？請用文字和箭頭寫出目的基因?qū)朐思毎念^寫出目的基因

5、導(dǎo)入原核細胞的具體過程具體過程5 5、請具體描述各種檢測和鑒定方法的、請具體描述各種檢測和鑒定方法的具體操作過程具體操作過程第6頁/共30頁u鑒定：抗蟲性、抗病性等鑒定：抗蟲性、抗病性等目標(biāo)升華目標(biāo)升華第7頁/共30頁1 1、目的基因的獲取、目的基因的獲取2 2、基因表達載體的構(gòu)建、基因表達載體的構(gòu)建3 3、將目的基因?qū)胧荏w細胞、將目的基因?qū)胧荏w細胞4 4、目的基因的檢測與鑒定、目的基因的檢測與鑒定有了目的基因，我們才有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細胞使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并可進行中穩(wěn)定存在，并可進

6、行遺傳、表達和發(fā)揮作用遺傳、表達和發(fā)揮作用 載體進入受體細胞穩(wěn)定載體進入受體細胞穩(wěn)定表達，才能實現(xiàn)一種生表達，才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。中的轉(zhuǎn)化。 才能確定目的基因是否才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩(wěn)定真正在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達。遺傳和正確表達。第8頁/共30頁一、目的基因的獲取一、目的基因的獲?。ㄒ唬⒛康幕蛑饕牵ㄒ唬?、目的基因主要是_編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些? ?1 1、從基因文庫中獲取、從基因文庫中獲取2 2、利用、利用PCRPCR技術(shù)擴增技術(shù)擴

7、增3 3、人工合成、人工合成第9頁/共30頁1、從基因文庫中直接獲取、從基因文庫中直接獲取（1 1）基因文庫：）基因文庫：概念見概念見P9P9（2 2）基因文庫的分類）基因文庫的分類: :按外源按外源DNADNA片段的來源分類片段的來源分類種種類類基因組基因組DNA文庫：文庫：含有一種生物的含有一種生物的全部全部基因基因部分基因文庫：部分基因文庫：只包含了一種生物的只包含了一種生物的部分部分基因，基因， 如：如：cDNA文庫文庫第10頁/共30頁提取某種生物的全部提取某種生物的全部DNADNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖杏眠m當(dāng)?shù)南拗泼盖幸欢ù笮〉囊欢ù笮〉腄NADNA片段片段將將DNADNA片段與載體連接

8、片段與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲存導(dǎo)入受體菌中儲存基因組文庫基因組文庫（3 3）基因文庫的構(gòu)建方法）基因文庫的構(gòu)建方法1 1、直接分離法、直接分離法( (鳥槍法鳥槍法) )第11頁/共30頁某種生物的單鏈某種生物的單鏈mRNAmRNA單鏈互補單鏈互補DNADNA雙鏈雙鏈cDNAcDNA片段片段導(dǎo)入受體菌中儲存導(dǎo)入受體菌中儲存與載體連接與載體連接cDNAcDNA文庫文庫反（逆）轉(zhuǎn)錄酶反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNADNA聚合酶聚合酶2 2、反轉(zhuǎn)錄法：、反轉(zhuǎn)錄法：cDNAcDNA的合成流程圖解的合成流程圖解（4 4）兩種基因文庫的區(qū)別）兩種基因文庫的區(qū)別第12頁/共30頁 過程過程高溫變性（高溫變性（解旋為單鏈解

9、旋為單鏈）低溫退火（低溫退火（引物與單鏈互補結(jié)合引物與單鏈互補結(jié)合）適溫延伸（適溫延伸（在在TaqTaq酶的作用下合成酶的作用下合成 與模板互補的與模板互補的DNADNA雙鏈雙鏈）重復(fù)循環(huán)重復(fù)循環(huán)預(yù)變性（預(yù)變性（增加增加DNADNA變性的概率變性的概率）2 2、利用、利用PCRPCR技術(shù)擴增目的基因技術(shù)擴增目的基因第13頁/共30頁四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸(dNTP)(dNTP) 引物：引物：熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）模板模板DNA( DNA( 需含有目的基因需含有目的基因 ) ) 緩沖溶液緩沖溶液寡核苷酸序列：與目的基因的起寡核苷酸序列：與目的基因的起始

10、段互補始段互補第14頁/共30頁3 3、人工合成的目的基因、人工合成的目的基因第15頁/共30頁二、基因表達載體的構(gòu)建二、基因表達載體的構(gòu)建 基因工程的核心基因工程的核心1、目的：、目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。基因能夠表達和發(fā)揮作用。第16頁/共30頁2 2、基因表達載體的組成：、基因表達載體的組成：復(fù)制原點復(fù)制原點+ +目的基因目的基因+ +啟動子啟動子+ +終止子終止子+ +標(biāo)記基因標(biāo)記基因第17頁/共30頁啟動子：啟動子：位于基因的首端的位于基因的首端的一段特

11、殊的一段特殊的DNADNA片斷，它是片斷，它是RNARNA聚合酶識別和結(jié)合的部聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出錄出mRNAmRNA，最終獲得蛋白質(zhì)，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：終止子：位于基因的尾端的位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片斷，片斷，能終能終止止mRNAmRNA的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因標(biāo)記基因的作用是的作用是為了為了鑒別鑒別受體細胞中是否含有目的基受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細因，從而將有目的基因的細胞篩選出來胞篩選出來第18頁/共30頁載體載體與與表達載體表達載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原

12、點兩部分和復(fù)制原點兩部分DNADNA片段。表達載體在載體片段。表達載體在載體基礎(chǔ)上增加了基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子目的基因、啟動子、終止子三部三部分結(jié)構(gòu)分結(jié)構(gòu)用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又既用到限制酶切割載體，又用到用到DNADNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵啟動子、終止子啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少對于目的基因表達必不可少目的基因不能單獨進入受體細胞，目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表必需以表達載體的方式攜帶進去。達載體的方式攜帶進去。注意注意第19頁/共

13、30頁三、將目的基因?qū)胧荏w細胞三、將目的基因?qū)胧荏w細胞（一）轉(zhuǎn)化（一）轉(zhuǎn)化： （二）方法（二）方法將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胫参锛毎参锛毎麑⒛康幕驅(qū)雽⒛康幕驅(qū)雱游锛毎麆游锛毎麑⒛康幕驅(qū)雽⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎⑸锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法顯微注射法感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞目的基因進入目的基因進入_內(nèi)，并且在內(nèi)，并且在 受體細胞內(nèi)維持受體細胞內(nèi)維持_和和_的過程的過程受體細胞受體細胞穩(wěn)定穩(wěn)定表達表達第20頁/共30頁檢測檢測鑒定鑒定檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的

14、基因檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子雜交分子雜交分子雜交（注意與上不同之處）分子雜交（注意與上不同之處）抗原抗體雜交抗原抗體雜交四、目的基因的檢測與鑒定四、目的基因的檢測與鑒定檢查是否成功檢查是否成功第21頁/共30頁1 1、將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ǎ?、將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ǎ海?）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點：農(nóng)桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多

15、數(shù)單子葉植物沒有感染能力數(shù)單子葉植物沒有感染能力原理：原理：Ti質(zhì)粒上的質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)可以轉(zhuǎn)移到受體細胞，并整合到受體細胞染移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的色體的DNA上。上。第22頁/共30頁過程：過程：優(yōu)點優(yōu)點第23頁/共30頁目的基因表達載體提純目的基因表達載體提純 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 顯微注射顯微注射 受精卵受精卵 新性狀動新性狀動物物第24頁/共30頁3 3、將目的基因?qū)胛⑸锛毎?、將目的基因?qū)胛⑸锛毎松锾攸c：繁殖快、單細胞、遺傳物質(zhì)原核生物特點：繁殖快、單細胞、遺傳物質(zhì)少少方法：方法：用用Ca2+處理細胞處理細胞 感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞 表表達載

16、體與感受態(tài)細胞混合達載體與感受態(tài)細胞混合 感受態(tài)感受態(tài)細胞吸收細胞吸收DNA分子分子第25頁/共30頁（一）、檢測（一）、檢測1 1、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNADNA上是否插上是否插入了目的基因入了目的基因 ( (關(guān)鍵步驟關(guān)鍵步驟) ).首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA.將含目的基因的將含目的基因的DNA片段用放射性同位片段用放射性同位素等作標(biāo)記素等作標(biāo)記,以此做探針以此做探針.使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯若顯示出雜交帶示出雜交帶,表明目的基因已插入染色體表明目的基因已插入染色體DNA中中（1）方法方法: :DNADNA分子雜交分子雜交（2）過程）過程:第26頁/共30頁第27頁/共30頁（二）、鑒定