細胞遷移侵襲試驗操作步驟Transwell

1、遷移實驗（cell migration assay ）實驗介紹細胞遷移與侵襲實驗將 Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內稱上室，培養(yǎng)板內稱下室，上 下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔，將研究的細胞種在上室內，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內的細胞，應用不同孔徑和經過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進行共培養(yǎng)、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的研究。實驗步驟： 1材料準備： 可拍照顯微鏡,Transwell小室，孔徑8叩，沒包被膠的（Coster和Corning公司的也較常 用），Transwell遷移實驗的細胞培養(yǎng)板 24孔板。細胞培養(yǎng)板應當與購買的Transwell

2、小室相配套，BD公司的 Matrigel ,無血清 DMEM , （1%胎牛血清）DMEM 和1640培養(yǎng)基，DMEM 完全培養(yǎng)基，1640完全培養(yǎng)基（也可加到20%血清），無菌PBS，棉簽，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，結晶紫染液（0.1% （g/ml） PBS結晶紫）2步驟和流程2.1基質膠鋪板：用BD公司的Matrigel 1 : 8 （根據細胞產生 mmp的量來決定）稀釋，包被 Transwell小室 底部膜的上室面，置 37 C 30min使Matrigel聚合成凝膠。使用前進行基底膜水化。2.2制備細胞懸液 制備細胞懸液前可先讓細胞撤血清饑餓12 - 24h ,進一步去除血清的

3、影響。但這一步并不是必須的。 消化細胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，（用PBS洗1 2遍），用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調整細胞密度至5X 105/ml。2.3接種細胞 取細胞懸液100 l加入Transwell小室。 24孔板下室一般加入600 l含20%FBS的培養(yǎng)基，特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產生，一旦產生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進培養(yǎng)板。 培養(yǎng)細胞：常規(guī)培養(yǎng)12 48h （主要依癌細胞侵襲能力而定）。24h較常見，時間點的選擇除了要考慮到細胞細胞侵襲力外，處理因素對細胞數目的影響

4、也不可忽視。2.4結果統(tǒng)計直接計數法，貼壁”細胞計數，這里所謂的貼壁”是指細胞穿過膜后，可以附著在膜的下室側而不會掉到下室里面去，通過給細胞染色，可在鏡下計數細胞。取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用無鈣的PBS洗2遍，甲醇固定30分鐘，將小室適當風干。0.1%結晶紫染色20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，用 PBS洗3遍。 400倍顯微鏡下隨即五個視野觀察細胞，記數。實驗材料(1) Transwell chamber: 24-well, 8.0-m pore membranes (Corning)(2) 細胞培養(yǎng)相關試劑：無血活培養(yǎng)基，10%血活培養(yǎng)基，PBS 0.02 %

5、 EDTA(3) 固定液：甲醇(4) 染色液：Giemsa染液(5) 封片劑：中性樹膠(6) 其他：小鑲子，棉棒，載玻片，蓋玻片操作步驟(1) 所有細胞培養(yǎng)試劑和 Transwell chamber 放在37 C溫育；(2) 待測細胞培養(yǎng)至對數生長期，消化細胞，用PBSft無血活培養(yǎng)基先后洗滌一次，用無血活培養(yǎng)基懸浮細胞，計數，調整濃度為2X 105 /ml ;(3) 在下室(即24孔板底部)加入600- 800 l含10%血活的培養(yǎng)基，上室加入100150 l細胞懸液，繼續(xù)在孵箱培養(yǎng) 24小時；(4) 用鑲子小心取出chamber,吸十上室液體，移到預先加入約 800 l甲醇的 孔中，室溫固

6、定30分鐘；(5) 取出chamber,吸十上室固定液，移到預先加入約 800 l Giemsa染液的 孔中，室溫染色15-30分鐘；(6) 輕輕用活水沖洗浸泡數次，取出chamber,吸去上室液體，用濕棉棒小心 擦去上室底部膜表面上的細胞；(7) 用小鑲子小心揭下膜，底面朝上晾十，移至載玻片上用中性樹膠封片；(8) 顯微鏡下取9個隨機視野計數，統(tǒng)計結果。注意事項(1) 根據待測細胞體積大小選擇合適孔徑的chamber。常用的為8.0-m孔徑(如AGW田胞)，如果細胞體積較大可以考慮用10- 1 m孔徑；(2) 根據待測細胞的遷移能力強弱調整細胞數和遷移時間。常規(guī)24-wellchamber接

7、種細胞數約為25X 104/well，遷移時間1236小時；(3) 由于Corning公司的24-Transwell內含12個獨立的chamber,為了避免 操作污染，每次實驗可預先另準備一塊 24孔普通培養(yǎng)板(Corning )；(4) 如果細胞遷移能力較弱，下室液體可用3T3細胞無血活培養(yǎng)24小時獲得的 上活加50 g/ml FN (Fibronectin ),具體可查閱相關文獻；(5) 細胞懸:液加入膜中央，盡量保證液面水平；(6) 固定染色擦洗時動作小心，避免擦去膜底面的細胞。但一定要充分擦凈膜 表面上未遷移的細胞，以免影響讀數。尤其是膜周邊上可用細牙簽或小鑲 子纏上濕棉花擦洗，但要小

8、心避免將膜戳破；(7) Chamber膜上都無法標記，操作時應小心避免混淆實驗組和對照組；(8) 充分晾干，避免殘留水分導致鏡下聚焦不一致。細胞侵襲實驗(cell invasion assay )實驗材料(1) Matrigel (BD 5mg/ml) , -20 C 保存(2) 其余材料同遷移實驗操作步驟(1) Matrigel在4 C過夜融化；(2) 用4C預冷的無血活培養(yǎng)基稀釋 Matrigel至終濃度1mg/ml,冰上操作；(3) 在chamber±室底部中央垂直加入100 l稀釋后的Matrigel , 37C溫育45小時使其干成膠狀；(4) 后續(xù)步驟同遷移實驗(1-8 )

9、。注意事項(1) Matrigel在過高或過低的溫度均易凝固，因此操作所需槍頭和離心管應提 前在4C預冷；(2) 鋪膠時保證液面水平，膠的厚度均勻一致，切勿產生氣泡；(3) 其他注意事項同遷移試驗。其他Transwell做腫瘤侵襲實驗的具體步驟 基質膠準備：將凍存于一80度冰箱的BD matrigel 4度過夜(24h ),變成液態(tài)；(2) 取300ul無血清培養(yǎng)基，加入60ul (或50ug/每室)Matrigel ，混勻，(4C操作， 最好在冰浴上)，加入上室各100ul (3個室)；放入37C培養(yǎng)箱中，孵育4-5h (>5h); 此間經常觀察，當出現(xiàn) 白色層”時，說明已經變?yōu)楣虘B(tài)。

10、注釋：無血清培養(yǎng)基和基質膠按1 : 5稀釋，每孔加50ul,在37 C培養(yǎng)箱中1-2h。(3) 消化細胞，無血清培養(yǎng)基洗 3次，計數，配成細胞懸液；(4) 用無血清培養(yǎng)基洗 Matrigel洗1次；每孔加入100ul細胞懸液；(5) 下腔室中加入 500ul含有20%FBS條件培養(yǎng)基；(6) 37 C培養(yǎng)箱中，孵育 20-24h ;(7) 取出transwell用PBS洗2遍，5%戊二醛固定，4C；(8) 加入結晶紫(0.1%)染色或 Giemsa染色(5 10min ),室溫0.5h , PBS洗2遍， 用棉球擦去上表面細胞，顯微鏡下觀察。遷移實驗transwell在24孔板中浸泡1小時；消

11、化細胞，無血清培養(yǎng)基 洗2次，計數，配成 細 胞懸液，每孔加入100ul細胞懸液；加藥刺激；下腔室中加入條件培養(yǎng)基或其他刺激因 子；37C培養(yǎng)箱中，孵育 20-24h ;取出transwell用PBS洗2遍，5% 戊二醛固定， 4C； PBS洗2遍，加入結晶紫（0.1%）染色，室溫0.5h , PBS洗2遍，用棉球擦 去上表面細胞，顯微鏡下觀察計數10照相，記錄。侵襲實驗取300ul無血清培養(yǎng)基，加入30ul （或50ug/每室）Matrigel ,混勻，（4 C操 作，最好在冰浴上），加入上室各100ul （ 3個室）；放入37 C培養(yǎng)箱中，孵育4-5h （5h ）;消化細胞，無血清培養(yǎng)基洗3次，計數，配成 細胞懸液；用無血清培養(yǎng)基洗Matrigel洗1次；每孔加入 100ul細胞懸液；下腔室中加入 600ul無血清條 件培養(yǎng)基；37 C 培養(yǎng)箱中，孵育20-24h ;取出transwell用PBS洗2遍，5%戊 二醛固定，4 C ；