細(xì)胞免疫染色及畸胎瘤切片的制作流程PPT學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1第1頁(yè)/共42頁(yè)第2頁(yè)/共42頁(yè)ES細(xì)胞或細(xì)胞或iPS細(xì)胞的密度要求細(xì)胞的密度要求無(wú)滋養(yǎng)層細(xì)胞較好無(wú)滋養(yǎng)層細(xì)胞較好n傳代后至克隆形態(tài)良好，密度適中。n通常傳至24孔板中。因?yàn)橛肏ochest染核對(duì)照也會(huì)將滋養(yǎng)層細(xì)胞的核同時(shí)染上，影響克隆定位。Oct4/DAPI第3頁(yè)/共42頁(yè)第4頁(yè)/共42頁(yè)材料材料流程流程把細(xì)胞固定在4PFA中，室溫放置30min 4多聚甲醛（4PFA, Paraformaldehyde）固定細(xì)胞之前，將培養(yǎng)基吸棄，用PBS涮2次 n0.1M的PBS配制（PH7.4），100mL PBS加4克多聚甲醛。n由于多聚甲醛難溶于水，需用磁力攪拌器加熱攪拌，溫度控制在60以下

2、。 第5頁(yè)/共42頁(yè)第6頁(yè)/共42頁(yè)材料材料流程流程n陽(yáng)性陽(yáng)性染色對(duì)照染色對(duì)照：染色呈陰性時(shí)，證實(shí)染色的有效性n陰性染色對(duì)照陰性染色對(duì)照：染色呈陽(yáng)性時(shí)，證實(shí)染色的特異性n一抗、二抗、一抗、二抗、Hoechst（DAPI）：分別發(fā)揮如下作用：識(shí)別特異抗原、特異一抗及細(xì)胞核n抗體稀釋液抗體稀釋液：稀釋抗體n封閉液封閉液：封閉非特異性反應(yīng)洗滌細(xì)胞洗滌細(xì)胞透膜（僅限染核抗體）透膜（僅限染核抗體）一抗孵育一抗孵育二抗孵育二抗孵育染核定位（染核定位（Hochest）第7頁(yè)/共42頁(yè)材料材料n陽(yáng)性陽(yáng)性染色對(duì)照染色對(duì)照：以多能干細(xì)胞標(biāo)記物染色為例，陽(yáng)性染色對(duì)照細(xì)胞是確定表達(dá)相應(yīng)抗體的細(xì)胞，如ES細(xì)胞或經(jīng)過(guò)驗(yàn)證

3、的iPS細(xì)胞n陰性染色對(duì)照陰性染色對(duì)照：是確定不表達(dá)相應(yīng)抗體的細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞等。n一抗一抗：要確保所購(gòu)買的一抗識(shí)別所染細(xì)胞的物種；要做預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定最適的抗體濃度n二抗二抗：要根據(jù)所染細(xì)胞自身所帶的熒光類型決定相應(yīng)的二抗的熒光類型，二者應(yīng)不同。nHoechst：英文名稱：bisBenzimide（Sigma B1155）；以PBS配制成1mg/ml 的母液，分裝后于-20保存；常用的可置于4 ，染色時(shí)以1XPBS 1000倍稀釋。 n抗體稀釋液抗體稀釋液：0.2%BSA和0.1%TritonX100溶于1XPBS； 4 保存；盡量現(xiàn)用現(xiàn)配，因含蛋白成分，容易變質(zhì)，長(zhǎng)菌。n封閉液封閉液：含1%

4、BSA+4% normal serum+0.4%TritonX100的1XPBS溶液；4 保存；盡量現(xiàn)用現(xiàn)配，因含蛋白成分，容易變質(zhì)，長(zhǎng)菌。第8頁(yè)/共42頁(yè)流程流程l所有洗滌，浸泡步驟都在搖床上進(jìn)行。目的是為了洗滌，浸泡充分均勻。l“洗滌”指將平板置于搖床上搖洗35分鐘 把細(xì)胞固定在4PFA中，室溫放置30min 1X PBS 洗滌2次 抗體稀釋液洗滌兩次 無(wú)水乙醇中浸泡兩次，每次20min（或3次，10min/次）(此步僅限于核蛋白染色，如Oct4，Nanog或Rex1等，不能用于膜蛋白) 1X PBS洗滌1次 封閉液封閉細(xì)胞，室溫，封閉液封閉細(xì)胞，室溫，1h 將一抗稀釋在抗體稀釋液中，加到

5、樣品上，室溫將一抗稀釋在抗體稀釋液中，加到樣品上，室溫2h或或4 放置過(guò)夜放置過(guò)夜(以以24孔板為例，孔板為例，一抗的體積：一抗的體積：200ul/孔孔) 第9頁(yè)/共42頁(yè)流程流程吸棄一抗，用PBT（0.1%TritonX100 in PBS）洗滌細(xì)胞35次將二抗稀釋在抗體稀釋液中，并加到樣品孔里，室溫放置1h; (以24孔板為例，二抗的體積：200ul/孔) 用PBT洗滌3次，約5min/次 用PBS洗滌兩次，5min/次 再用4PFA室溫固定30min 最后再用PBS洗滌兩次，每次5min Hoechst染核, 室溫放置5min 第10頁(yè)/共42頁(yè)第11頁(yè)/共42頁(yè)iPS細(xì)胞染色實(shí)例細(xì)胞染

6、色實(shí)例n多能干細(xì)胞標(biāo)記物的常用抗體：n膜抗體：SSEA-1、 SSEA-3、 SSEA-4n胞漿抗體：Tra-1-60、 Tra-1-81n核抗體：Oct4、Nanog、Rex1h陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照陰性對(duì)照Rat-iPSCs第12頁(yè)/共42頁(yè)iPS細(xì)胞染色實(shí)例細(xì)胞染色實(shí)例陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照陰性對(duì)照hhESCsTra-1-60第13頁(yè)/共42頁(yè)iPS細(xì)胞染色實(shí)例細(xì)胞染色實(shí)例Pig-iPSCs第14頁(yè)/共42頁(yè)iPS細(xì)胞染色實(shí)例細(xì)胞染色實(shí)例Human-iPSCs EB 分化染色分化染色Sox17AFPNestin -actinSMATuj1內(nèi)胚層內(nèi)胚層中胚層中胚層外胚層外胚層第15頁(yè)/

7、共42頁(yè)第16頁(yè)/共42頁(yè)第17頁(yè)/共42頁(yè)ES細(xì)胞或細(xì)胞或iPS細(xì)胞的收集細(xì)胞的收集n細(xì)胞數(shù)量：一個(gè)細(xì)胞數(shù)量：一個(gè)T75長(zhǎng)到長(zhǎng)到80-90%滿時(shí)，細(xì)胞數(shù)大約為滿時(shí)，細(xì)胞數(shù)大約為1000萬(wàn)萬(wàn)個(gè)，可以打兩個(gè)點(diǎn)，即每個(gè)點(diǎn)約個(gè)，可以打兩個(gè)點(diǎn)，即每個(gè)點(diǎn)約300-500萬(wàn)個(gè)細(xì)胞；萬(wàn)個(gè)細(xì)胞；n細(xì)胞處理：細(xì)胞處理： 小鼠及大鼠小鼠及大鼠iPS細(xì)胞：將細(xì)胞消化成單細(xì)胞；細(xì)胞：將細(xì)胞消化成單細(xì)胞；1200rpm離心離心5min后棄上清；以小于后棄上清；以小于400ul的的10%DMEM重懸；重懸； 人人iPS細(xì)胞：將消化下來(lái)的細(xì)胞吹打成較小塊；靜置至細(xì)胞細(xì)胞：將消化下來(lái)的細(xì)胞吹打成較小塊；靜置至細(xì)胞團(tuán)塊沉底，并

8、棄上清；以小于團(tuán)塊沉底，并棄上清；以小于400ul的的hES培基重懸；培基重懸；n收集細(xì)胞到收集細(xì)胞到1ml注射器內(nèi)并注射。注射器內(nèi)并注射。第18頁(yè)/共42頁(yè)ES細(xì)胞或細(xì)胞或iPS細(xì)胞的注射細(xì)胞的注射n材料：多重免疫缺陷小鼠（ NODSCID小鼠）n注射部位：后腿內(nèi)側(cè)肌肉注射第19頁(yè)/共42頁(yè)畸胎瘤的生長(zhǎng)和摘取畸胎瘤的生長(zhǎng)和摘取n通常注射30-40天之后，畸胎瘤就長(zhǎng)成直徑大概1-2cm左右的球體n當(dāng)畸胎瘤長(zhǎng)到一定體積時(shí)，手術(shù)摘除畸胎瘤n通?；チ龆际菍?shí)質(zhì)性的，也有個(gè)別呈空泡狀。約約1-2cm第20頁(yè)/共42頁(yè)第21頁(yè)/共42頁(yè)流程流程固定包埋切片切片材料材料n4%PFA：固定畸胎瘤組織用n石蠟

9、石蠟（熔點(diǎn)約50-60度）：包埋組織n石蠟包埋機(jī)石蠟包埋機(jī)（非必須）：包埋組織，還需要包埋盒、包埋底n石蠟切片機(jī)石蠟切片機(jī)（必須）：切半薄“Semi-thick”石蠟切片n染色缸、染色架、載玻片、蓋玻片染色缸、染色架、載玻片、蓋玻片n溶液溶液：n載玻片：載玻片：防脫片；也可以自制“蛋白膠”涂在切片上晾干乙醇（EtOH）、二甲苯（Xylene）、氯仿（Chloroform）HE染色液（H：Hematoxyline蘇木精、E：Eosin 伊紅）封片樹(shù)脂染色架染色缸撈片、展片撈片、展片染色第22頁(yè)/共42頁(yè)流程流程固定在4%PFA中固定，4 （浸泡）過(guò)夜換成新鮮的 4%PFA ，再次4浸泡過(guò)夜（過(guò)長(zhǎng)

10、時(shí)間浸在固定液中會(huì)降低樣品的抗原性，影響后續(xù)的免疫染色）l4固定是為了更好的保持標(biāo)本的抗原性，室溫也可以第23頁(yè)/共42頁(yè)流程流程固定包埋之脫水、透明70 EtOH 1h80 EtOH 1h90 EtOH 1h95 EtOH 1h100EtOH 1hFresh 100EtOH 1h Fresh 100EtOH overnight氯仿氯仿 1h新鮮氯仿新鮮氯仿 1h新鮮氯仿新鮮氯仿 overnight 脫水脫水透明透明第24頁(yè)/共42頁(yè)流程流程包埋包埋石蠟包埋盒經(jīng)透明經(jīng)透明處理的處理的樣品樣品溶解溶解石蠟石蠟1h2h溶解溶解石蠟石蠟50-60，取決于石蠟的融點(diǎn)，取決于石蠟的融點(diǎn)固定包埋之包埋第2

11、5頁(yè)/共42頁(yè)流程流程固定包埋 之 包埋n如果沒(méi)有石蠟包埋機(jī)，可以用60 烘箱代替；n利用酒精燈加熱鑷子可代替高溫鑷子；n將樣品快速放到石蠟包埋底內(nèi)，蓋上包埋盒的底座，直至石蠟全部凝結(jié)；n修整蠟塊形狀、備用。溶解蠟存放槽出蠟口冷凍臺(tái)高溫鑷子石蠟包埋盒和包埋底存放槽各種規(guī)格的石蠟包埋底第26頁(yè)/共42頁(yè)n用單面刀片修整蠟塊，并達(dá)到以下要求：n（1）蠟塊呈正方形或長(zhǎng)方形，蠟塊各面要平直，樣品位于蠟塊正中央；n（2）樣品邊緣與蠟塊邊緣的距離約3mm。 流程流程固定包埋 之 修整蠟塊樣品與蠟樣品與蠟塊邊緣有塊邊緣有一定距離，一定距離，以便切片以便切片能夠連成能夠連成蠟帶蠟帶平行平行第27頁(yè)/共42頁(yè)流

12、程流程固定包埋切片切片蠟塊固定座刀片切片厚度微調(diào)旋鈕手動(dòng)切片轉(zhuǎn)輪切片厚度：切片厚度：5微米微米蠟帶毛筆第28頁(yè)/共42頁(yè)固定包埋切片切片撈片、展片撈片、展片流程流程37蒸餾水蒸餾水載玻片置于37-42 的烘片臺(tái)（平面）上樣品切樣品切片片切片借助水的表面張力展開(kāi)至平整吸除多余水分，37 烤片過(guò)夜,備用做好樣品ID的標(biāo)記第29頁(yè)/共42頁(yè)流程流程烤片機(jī)烤片機(jī)37 烤片過(guò)夜，防止脫片烤片過(guò)夜，防止脫片展片溫水槽展片溫水槽溫度設(shè)定：溫度設(shè)定：37-42左右左右固定包埋切片切片撈片、展片、烤片撈片、展片、烤片第30頁(yè)/共42頁(yè)第31頁(yè)/共42頁(yè)流程流程 脫蠟親水脫蠟親水100% EtOH浸泡2次 10m

13、in/次95% EtOH 5min90% EtOH 5min80% EtOH 5min70% EtOH 5min蒸餾水浸洗3次， 5min/次Xylene1Xylene3Xylene2Xylene4脫蠟脫蠟親水親水（非一次性使用，可反復(fù)多次使用）二甲苯浸泡4次 5min/次第32頁(yè)/共42頁(yè)流程流程 染色染色在鹽酸酒精溶液內(nèi)浸一下至變成接近紅色，此步驟稱為“鹽酸分化”(1%鹽酸酒精溶液：指染色缸中70酒精中含1%鹽酸)將切片 在自來(lái)水龍頭下流水沖洗15-20分鐘，至切片呈理想的紫藍(lán)色，此步驟稱“藍(lán)化”（顏色的適宜度取決于染色者的經(jīng)驗(yàn)）蒸餾水中涮洗一下切片在Eosin溶液中染5min自來(lái)水涮洗至

14、水接近無(wú)色蒸餾水涮洗一下切片在 Hematoxylin 溶液中浸泡 10min自來(lái)水中涮洗2、3次至水接近無(wú)色蒸餾水中涮洗1次第33頁(yè)/共42頁(yè)流程流程 脫水封片脫水封片100% EtOH浸泡2次 10min/次脫脫水水二甲苯浸泡4次 5min/次Xylene1Xylene3Xylene2Xylene4透透明明（非一次性使用，可反復(fù)多次使用）70% EtOH short time80% EtOH short time90% EtOH short time樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察(以上幾步一方面是為了脫水，另一方面是為了脫去多余以上幾步一方面是為了脫水，另一方面是為了脫去多余的的Eosin顏色，所以，要注意觀察切片顏色的變化。顏色，所以，要注意觀察切片顏色的變化。70和和80的酒精只要稍稍浸一下即可，的酒精只要稍稍浸一下即可，90的酒精是調(diào)的酒精是調(diào)整顏色的關(guān)鍵步驟，在這一步要依靠染色者根據(jù)切片顏整顏色的關(guān)鍵步驟，在這一步要依靠染色者根據(jù)切片顏色自覺(jué)調(diào)整時(shí)間。新鮮的無(wú)水酒精沒(méi)有脫色作用色自覺(jué)調(diào)整時(shí)間。新鮮的無(wú)水酒精沒(méi)有脫色作用)第34頁(yè)/共42頁(yè)流程流程在樣品中