DB1302∕T 522-2020 生豬屠宰場（點(diǎn)）非洲豬瘟快速檢測技術(shù)規(guī)程

1、ICS 11.220CCS B 41DB1302唐山市地方標(biāo)準(zhǔn)DB1302/T 522-2020生豬屠宰場（點(diǎn)）非洲豬瘟快速檢測技術(shù)規(guī)程2020-12-28 發(fā)布2021-01-10 實(shí)施唐山市市場監(jiān)督管理局發(fā)布庫七七 標(biāo)準(zhǔn)下載DB1302/T 522-2020前言本文件按照GB/T 1.1-2020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。本文件由唐山市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提出并歸口。本文件起草單位：唐山市動物衛(wèi)生監(jiān)督所、唐山市動物疫病預(yù)防控制中心、唐山怡安生物工程有限 公司。本文件主要起草人：劉潤東、張玉新、李潤、李杏媛、韓澤雨、高英、劉志勇、楊思源、崔榮飛、 畢紅全、王大偉、梁

2、寶、李敬陽、代廣、張英杰、趙艷華、朱秋艷、徐麗、康曉曉、肖文同。IDB1302/T 5222020生豬屠宰場（點(diǎn)）非洲豬瘟快速檢測技術(shù)規(guī)程1 范圍本文件規(guī)定了生豬屠宰場(點(diǎn)）非洲豬瘟快速檢測活動的檢測室建設(shè)、采樣、檢測、生物安全和檔案管理等。本文件適用于生豬屠宰場(點(diǎn)）非洲豬瘟快速檢測，其它環(huán)節(jié)非洲豬瘟快速檢測也可參照執(zhí)行。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件， 僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。農(nóng)牧發(fā)20192 號生豬屠宰檢疫規(guī)程3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于

3、本文件。3.1非洲豬瘟快速檢測指利用實(shí)時(shí)熒光 PCR 的方法，核酸提取、擴(kuò)增檢測均在同一封閉、便攜式儀器上完成，樣本上機(jī)后至結(jié)果報(bào)告過程，無需任何手工操作，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的累計(jì)過程中熒光信號的變化， 在 90 min 內(nèi)完成對非洲豬瘟病毒特異性核酸片段的快速檢測。4 檢測室建設(shè)4.1 基本要求4.1.1 檢測室應(yīng)設(shè)在相對獨(dú)立的區(qū)域，與其它不相容的區(qū)域進(jìn)行有效隔離，防止交叉污染。4.1.2 檢測室應(yīng)分為試劑貯存和配制、樣品制備和擴(kuò)增 2 個獨(dú)立工作區(qū)域，有明晰的標(biāo)識，檢測操作和人流物流按照單一方向流動。4.1.3 應(yīng)配備給水、排水、電力、通風(fēng)、消毒及無害化處理設(shè)施。4.1.4 地

4、面平整防滑、墻面、頂棚平整，易清潔消毒。4.1.5 工作臺表面應(yīng)耐熱、耐腐蝕，可反復(fù)清洗消毒。4.2 儀器設(shè)備配置4.2.1 試劑貯存和配制區(qū)配備超凈工作臺（通風(fēng)櫥）、冰箱、微量移液器（10 µL、100 µL）。4.2.2 樣品制備和擴(kuò)增區(qū)1DB1302/T 5222020配備熒光定量 PCR 儀、二級生物安全柜（可選）、高速離心機(jī)（可選）、核酸提取儀（可選）、組織破碎儀、微量移液器（10 µL、100 µL、1000 µL）。4.3 檢測人員檢測人員應(yīng)取得健康合格證明并在省定點(diǎn)屠宰管理辦公室登記備案。5 采樣5.1 采樣人員采樣由經(jīng)過專業(yè)技

5、術(shù)機(jī)構(gòu)培訓(xùn)、掌握采樣技術(shù)的生豬屠宰場（點(diǎn)）人員實(shí)施。5.2 器具及試劑放血刀具（可選）、離心管（5 mL）、一次性混合血樣容器、一次性手套、 一次性注射器（10 mL）、攪拌棒、編號筆、消毒液容器、抗凝劑（檸檬酸鈉:水=1:10）、消毒劑等。5.3 抽樣5.3.1 屠宰生豬以運(yùn)輸車輛為批次全部采集血液樣品，每頭生豬采集血液 2 mL。5.3.2 生豬血樣采集在生豬入場前、待宰圈、放血后進(jìn)行，采樣部位為生豬耳緣靜脈或前腔靜脈。5.3.3 采樣人員戴一次性手套，使用容量為 5 mL 的離心管接取血液，倒入混合血樣容器內(nèi)。5.4 混樣5.4.1 生豬的血樣混合同批不高于 50 頭。5.4.2 混合血

6、樣添加 10 mL 抗凝劑，殘豬、急宰豬按每頭 0.5 mL 添加抗凝劑，用攪拌棒攪拌均勻， 使用一次性注射器從混合均勻的血液中抽取 5 mL 血液送檢。5.5 編號、記錄、送樣5.5.1 對每個混合血樣進(jìn)行編號，同日內(nèi)所有混合血樣編號不得重復(fù)。用于檢測的樣品、備份留存的樣品應(yīng)統(tǒng)一用防水記號筆對應(yīng)編號，清晰標(biāo)記于采樣容器上，其編號應(yīng)與生豬的檢疫證明號碼相對應(yīng)。5.5.2 血液樣品抽取后做好采樣記錄，采樣記錄內(nèi)容包括采樣日期、采樣地點(diǎn)、采樣頭數(shù)、對應(yīng)檢疫 證號碼、樣品類型、樣品編號、采樣人員等。采樣記錄樣式見附錄 A。5.5.3 混合后的血樣應(yīng)立即送檢測室進(jìn)行檢測，特殊情況下混合血樣現(xiàn)場放置時(shí)間

7、不超過 30 min。5.6 樣品留存檢測樣品應(yīng)留存?zhèn)浞荩?20保存 1 個月以上。6 檢測6.1 檢測方法采用農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)的商品化試劑盒檢測，檢測操作步驟按照試劑盒及 PCR 儀操作說明書進(jìn)行。6.2 結(jié)果分析依據(jù)試劑盒操作說明書，通過 Ct 值判定：陽性/陰性。2DB1302/T 52220206.3 結(jié)果處置檢測結(jié)束后，如實(shí)填寫檢測報(bào)告，檢測報(bào)告樣式見附錄 B。結(jié)果處置按生豬屠宰檢疫規(guī)程中7.1 和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部實(shí)時(shí)發(fā)布的非洲豬瘟疫情防控相關(guān)文件執(zhí)行。7 生物安全7.1 采樣工具用流動的清水沖洗干凈，并用消毒劑消毒，取完一個批次的樣品后進(jìn)行更換、消毒；一 次性手套、離心管、混合血樣容器在取

8、完一個批次的樣品后更換，采樣產(chǎn)生的廢棄物放入密封、無滲漏 的容器內(nèi)，應(yīng)進(jìn)行無害化處理。 GB 19489 給出了無害化處理的方法。7.2 檢測室內(nèi)保持整潔干凈，嚴(yán)禁擺放與檢測無關(guān)的物品，不得在檢測室內(nèi)進(jìn)行與檢測無關(guān)的活動。7.3 檢測操作前開啟紫外燈至少照射 30 min，對室內(nèi)空間、工作臺面、地面及設(shè)備儀器等表面進(jìn)行消毒。7.4 檢測人員進(jìn)入檢測區(qū)域應(yīng)做好人員防護(hù)。7.5 檢測產(chǎn)生的廢棄物、剩余樣品及使用過的移液槍頭、一次性手套、口罩、帽子等應(yīng)進(jìn)行無害化處 理。 GB 19489 給出了無害化處理的方法。7.6 需樣品制備及核酸提取的，應(yīng)在二級生物安全柜中進(jìn)行。7.7 檢測結(jié)束后應(yīng)采取紫外照

9、射或消毒液噴灑等措施對環(huán)境進(jìn)行消毒。7.8 擴(kuò)增后裝有反應(yīng)產(chǎn)物的 PCR 反應(yīng)管禁止開蓋，立即消毒，檢測結(jié)束與其它高壓滅菌后的廢棄物送出檢測室。7.9 檢測室發(fā)現(xiàn)污染應(yīng)停止檢測活動。8 檔案管理8.1 應(yīng)建立人員培訓(xùn)、采樣檢測記錄、檢測報(bào)告等相關(guān)檔案。8.2 檔案保存不少于 12 個月。3DB1302/T 5222020附錄A(資料性）生豬屠宰場（點(diǎn)）非洲豬瘟檢測采樣記錄表表 A.1 給出了生豬屠宰場（點(diǎn)）非洲豬瘟檢測采樣記錄表的樣式表 A.1生豬屠宰場（點(diǎn)）非洲豬瘟檢測采樣記錄表編號：（年月日+3 位數(shù)順序號）序號日期采樣地點(diǎn)采樣頭數(shù)對應(yīng)檢疫證號碼樣品類型樣品編號采樣人（簽字）備注注：1、采樣地點(diǎn)填寫入場前、待宰圈或屠宰線；2、采樣頭數(shù)為 1 頭或多頭，相應(yīng)的樣品編號為 1 個號碼或號段；3、樣品類型為血樣、脾、淋巴結(jié)或腎等。4DB1302/T 5222020附錄B(資料性）生豬屠宰宰場（點(diǎn)）非洲豬瘟自檢報(bào)告表 B.1 給出了生豬屠宰場（點(diǎn)）非洲豬瘟自檢報(bào)告的樣式表 B.1生豬屠宰場（點(diǎn)）非洲豬瘟自檢報(bào)告編號：（年月日+3 位數(shù)順序號）采樣表編號檢測生豬數(shù)樣品編號對應(yīng)檢疫證號碼試劑名稱生產(chǎn)廠家有效期至混樣