質(zhì)譜定量的原則系列講座

1、質(zhì)譜定雖的原則系列講座（轉(zhuǎn)自分析測(cè)試白科叮當(dāng)空間）質(zhì)譜定量的原則01-目錄：1.質(zhì)譜定量的簡(jiǎn)介a）總離子流b）選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）c）選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM/MRM ）2 .開(kāi)發(fā)一個(gè) SRM方法3. 內(nèi)標(biāo)4. PK/LC/MS/MS 藥物代謝動(dòng)力學(xué)的LC/MS/MS的反相液相色譜的方法開(kāi)發(fā)5 .樣品制備6.標(biāo)準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)備a）做標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟b）標(biāo)準(zhǔn)曲線的稀釋方案Scheme的舉例c）標(biāo)準(zhǔn)曲線的運(yùn)行d）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的隨機(jī)化e）系統(tǒng)運(yùn)行的實(shí)用性f）“Q（®量控制7 .相關(guān)的PK資源8.定量的技巧Tips質(zhì)譜定量的原則02質(zhì)譜定量的簡(jiǎn)介和LC/MS監(jiān)測(cè)的模式簡(jiǎn)介本教程主要用于：使

2、用質(zhì)譜作小分子藥代動(dòng)力學(xué)分析，即 PK/MSo除此之外, 這些同樣的原則也可用于生物基質(zhì)中肽和蛋白的定量。傳統(tǒng)上，在使用現(xiàn)代質(zhì)譜定量之前，定量是用HPLC高效液相色譜和UV紫外檢 測(cè)器實(shí)現(xiàn)的。HPLC藥代動(dòng)力學(xué)分析建立在保留時(shí)間、峰面積和紫外光譜性質(zhì)的 基礎(chǔ)上的。HPLC方法的缺點(diǎn)是靈敏度不夠、缺乏特異性。我們已經(jīng)看到一些實(shí) 例，一個(gè)化合物的確已經(jīng)代謝了，然而保留時(shí)間和紫外光譜上，母離子和代謝物 無(wú)法區(qū)分。這種缺少特異性的分析時(shí)不時(shí)會(huì)誤導(dǎo)研究者。 所以在藥代動(dòng)力學(xué)分析 中，基丁質(zhì)譜的表征現(xiàn)在是一種新型的重要的工具。質(zhì)譜定量中已經(jīng)被廣泛接受的方式是 MS/MS定量。這種定量常通過(guò)三級(jí)四極桿 或離

3、子阱質(zhì)譜實(shí)現(xiàn)。要求使用 MS/MS的原因是：許多化合物有同樣的質(zhì)量。當(dāng) 使用第一個(gè)維度即單級(jí)質(zhì)譜 MS去定量時(shí)，也會(huì)缺乏特異性，尤其是對(duì)丁像血液 那樣的復(fù)雜的基質(zhì)。第二個(gè)維度的 MS （即MS/MS）在大多數(shù)情況下，能夠提 供唯一的斷裂。合并特異的母離子質(zhì)量和唯一的碎片離子信息， 可以選擇性地監(jiān) 測(cè)被定量的化合物。下面我們將討論獲得和可視化LC/MS數(shù)據(jù)的方法。獲得和可視化LC/MS的數(shù)據(jù)，或稱(chēng)為：質(zhì)譜數(shù)據(jù)如何在一個(gè) LC/MS實(shí)驗(yàn)中表 達(dá)？典型的方法，質(zhì)譜被設(shè)置為掃描特定的質(zhì)量范圍。 在全掃描分析中，質(zhì)量掃描范 圍較寬；在選擇離子監(jiān)測(cè) SIM時(shí)，質(zhì)量掃描范圍較窄。依賴(lài)丁掃描的類(lèi)型，一 個(gè)獨(dú)立

4、的質(zhì)量掃描時(shí)間可以從10 ms到5秒。在一次LC/MS分析中可獲得許多 個(gè)掃描。LC/MS數(shù)據(jù)的表示方法為：把每個(gè)質(zhì)量掃描的離子流信息疊加，畫(huà)出 隨時(shí)間變化的總離子流，橫軸是時(shí)間，縱軸是強(qiáng)度。總離子流圖非常像HPLC的 紫外圖，見(jiàn)圖1。下面我們將討論各種掃描的模式，和這些模式同質(zhì)譜定量的關(guān)系。最常見(jiàn)的LC/MS數(shù)據(jù)模式為：（1）總離子流圖（2）選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）（3）選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）或多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM ） : MRM和SRM本質(zhì)上 是同樣的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?。從藥代分析中得到的全質(zhì)量范圍的總離子流圖（TIC）非常像HPLC UV圖，除 了 ：質(zhì)譜能檢測(cè)到更多的化合物，尤其是沒(méi)有紫外吸收的化合

5、物?？傠x子流是一個(gè)疊加圖，疊加了每個(gè)質(zhì)量掃描的離子流。當(dāng)一個(gè)小分子或小肽流出HPLC色譜 柱時(shí)，相對(duì)強(qiáng)度上升，在 TIC圖上出現(xiàn)了一個(gè)峰，橫軸是時(shí)間。每個(gè)質(zhì)量的化 合物都被記錄在TIC圖上。找出感興趣的化合物可能是困難的，因?yàn)樵S多化合 物有相同的質(zhì)量?；衔锏奶烊毁|(zhì)量不是鑒定的唯一性數(shù)據(jù)。設(shè)置一個(gè)確定的質(zhì)量，可以畫(huà)出一個(gè)提取離子流圖，但這個(gè)圖的強(qiáng)度會(huì)比下面介紹的SIM實(shí)驗(yàn)中的強(qiáng)度低。（注意：TIC指的是在一段時(shí)間內(nèi)采集的質(zhì)量掃描數(shù)據(jù)， 不特指掃描范圍或質(zhì)譜 實(shí)驗(yàn)的類(lèi)型。例如，我們可以在 SIM或SRM實(shí)驗(yàn)中獲得TIC圖。然而，為簡(jiǎn)單 起見(jiàn)，我們將把這些圖稱(chēng)為 SIM和SRM圖，而不是SIM T

6、IC圖。）Selected Ion Monitoring 選擇離子監(jiān)測(cè)在選擇離子監(jiān)測(cè)中，質(zhì)譜被設(shè)置為掃描一個(gè)非常小的質(zhì)量范圍，典型的是一個(gè)質(zhì)量數(shù)的寬度。選擇的質(zhì)量寬度越窄，SIM的確定度越高。SIM圖就是從非常窄的 質(zhì)量范圍中得到的離子流圖。只有被該質(zhì)量范圍選擇的化合物才會(huì)被畫(huà)在SIM圖中。圖1和圖2是同一個(gè)樣品的譜圖，然而它們看起來(lái)很不相同。原因是在 SIM圖中，畫(huà)的是TIC圖中較少的組分。SIM圖是比TIC圖更確定的圖。Selected Ion Monitoring (SIM)然而，SIM圖仍顯示了許多峰，不能唯一地確認(rèn)我們感興趣的化合物。 一個(gè)復(fù)雜 的樣品（比如血活或血漿）中，這樣的圖是

7、一個(gè)典型的 SIM圖。許多化合物有 同樣的質(zhì)量，在ESI中還有多電荷峰也和我們感興趣的化合物有同樣的 m/z值。 SIM實(shí)驗(yàn)比全掃描實(shí)驗(yàn)更靈敏，因?yàn)橘|(zhì)譜在一個(gè)更小的質(zhì)量范圍上駐留（ dwell） 更長(zhǎng)的時(shí)間。Selected Reaction Monitorin蕤擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）SRM被大多數(shù)科學(xué)家在質(zhì)譜定量中使用，見(jiàn)圖 3。SRM中，可以監(jiān)測(cè)一個(gè)特征 的唯一的碎片離子，在很多非常復(fù)雜的基質(zhì)中進(jìn)行定量。 SRM圖非常簡(jiǎn)單，通 常只包含一個(gè)峰。這種特征性使 SRM圖成為靈敏度高且特異性強(qiáng)的理想的定量Selected Reaction Monitoting (SRM)SRM的過(guò)程：選擇一個(gè)特征

8、的母離子做 MS/MS ,在其碎片中選擇一個(gè)特征的子 離子作為監(jiān)測(cè)離子。可以把 SRM理解為碎片離子的SIM。這種特征性的實(shí)驗(yàn)被 成為“transition (躍遷)，可以表示為：母離子 t子離子，舉例：534 t 375質(zhì)譜定量的原則 03建立 個(gè)SRM Transition 534 t 375一個(gè)定量分析方法應(yīng)該是特征性的、高準(zhǔn)確度和高靈敏度的。在不犧牲上述特性 的前提下，建立方法應(yīng)該盡可能地快速，質(zhì)譜定量可以很好地滿(mǎn)足這些規(guī)則。在建立一個(gè)感興趣的化合物的 MS/MS碎片transition的時(shí)候，一種優(yōu)化transition 的方法是用注射泵進(jìn)樣(syringe pump)該化合物來(lái)優(yōu)化

9、。先在全掃描方式中優(yōu)化母離子信號(hào)。因?yàn)?MS/MS的靈敏度將依賴(lài)丁化合物在全 掃描模式中是否響應(yīng)得好，要盡可能地優(yōu)化全掃描的、非 CID響應(yīng)的MS信號(hào)然后優(yōu)化碰撞能CE和碰撞氣體，給出豐度最高的碎片離子。不能使用太大的碰 撞能CE,因?yàn)樘蟮腃E會(huì)丟失穩(wěn)定的、有價(jià)值的碎片峰。我應(yīng)如何優(yōu)化碎片峰？”可以用注射泵進(jìn)樣化合物，進(jìn)行 MS/MS ,挑出一個(gè)穩(wěn)定的碎片峰，當(dāng)改變 碰撞能和碰撞氣體參數(shù)時(shí)監(jiān)測(cè)它的離子流。最后當(dāng)獲得最大的碎片離子峰響應(yīng)時(shí) 確定碰撞能和碰撞氣體參數(shù)。現(xiàn)代的三重四極桿質(zhì)譜都可以自動(dòng)優(yōu)化。MS/MS Framentiticin of 554從優(yōu)化好的MS/MS譜中，選擇一個(gè)合適的碎

10、片峰用于定量監(jiān)測(cè)。如圖 A所示， 母離子質(zhì)量為534,似乎從圖B中可以很容易選擇一個(gè)碎片峰做 Transitiono 一 個(gè)基本考慮是盡可能不要選擇離母離子太近的質(zhì)量。非常常見(jiàn)的，是化合物的失水峰或失氨（ammonia）峰，例如：534-517= 17。我們應(yīng)盡可能不要選擇失水 峰或失氨（ammonia）峰做SRM，因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致一個(gè)不是很特異的 transition0 這里，Transition 534 375是一個(gè)好的選擇。另外要注意的是：要選擇一個(gè)穩(wěn) 定的峰。當(dāng)直接進(jìn)樣化合物時(shí)，被選擇做 Transition的峰必須每次掃描響應(yīng)都一 致。提示：當(dāng)優(yōu)化MS條件時(shí)，最好能模擬實(shí)際做樣的條件。例

11、如：實(shí)際做樣時(shí)色譜 流速是400 ul/min,化合物在30%有機(jī)相時(shí)流出，用注射泵進(jìn)樣優(yōu)化 MS條件時(shí) 最好模擬這個(gè)條件，即設(shè)置 HPLC流速為400 ul/min , 30%有機(jī)相；然后用三通 注入化合物。同時(shí)，第一次優(yōu)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們可以選擇60/60的梯度，去表征化合物的疏水性， 從而得知它在C18反相柱上的色譜行為。如果你對(duì)所有的化合物都按這樣的方 法實(shí)驗(yàn)，你就可以建立一個(gè)洗脫數(shù)據(jù)庫(kù)，可以作為將來(lái)實(shí)驗(yàn)的參考。注：60/60梯度的意思是：梯度從近100%水相開(kāi)始，在60分鐘內(nèi)到達(dá)60% 有機(jī)相。質(zhì)譜定量的原則04內(nèi)標(biāo)在做MS定量時(shí)應(yīng)該使用內(nèi)標(biāo)。選擇一個(gè)合適的內(nèi)標(biāo)，將能減少因?yàn)闃悠诽崛　?

12、HPLC進(jìn)樣和離子化的多樣性造成的差異。在復(fù)雜基質(zhì)的分析中，在 SRM積分 圖上，在標(biāo)準(zhǔn)曲線的低端，常會(huì)見(jiàn)到：兩個(gè)不同的濃度水平，會(huì)給出近乎一致的 響應(yīng)。只有當(dāng)使用一種內(nèi)標(biāo)時(shí)，這兩個(gè)點(diǎn)才能被區(qū)分。一些研究者試圖在實(shí)驗(yàn)中 不用內(nèi)標(biāo)去做標(biāo)準(zhǔn)曲線，但成功率不高。我們?cè)跇?biāo)準(zhǔn)曲線上每個(gè)濃度水平都重復(fù) 進(jìn)樣3次。沒(méi)有內(nèi)標(biāo)的情況下，重現(xiàn)性 RSD常常會(huì)高于20%;而當(dāng)使用內(nèi)標(biāo) 時(shí)，%RSD能降低到近2%。我要如何選擇一個(gè)內(nèi)標(biāo)？最好的內(nèi)標(biāo)是待定量的化合物的同位素內(nèi)標(biāo)。同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)將和待測(cè)物有相 似的回收率、ESI離子化響應(yīng)，和相似的色譜保留時(shí)間。如果你運(yùn)行的不是臨床 藥代動(dòng)力學(xué)定量，可能很難判斷上述說(shuō)法，

13、因?yàn)樘厥獾暮铣梢粋€(gè)同位素標(biāo)記的內(nèi) 標(biāo)，是非常昂貴和耗時(shí)的。通常，如果你和一個(gè)醫(yī)學(xué)的化學(xué)家工作，他們會(huì)有一個(gè)化合物相似物庫(kù)，可以被 用作內(nèi)標(biāo)。這些類(lèi)似物，在化合物合成中被測(cè)試，和該化合物性質(zhì)相似可以被用 戶(hù)定量?jī)?nèi)標(biāo)，而且更重要的是，這些類(lèi)似物和該化合物的母離子質(zhì)量有微小的差 異。盡量不要使用去甲基化（一14）或者是氧化的（+ 16）的類(lèi)似物作內(nèi)標(biāo)，因?yàn)榇?測(cè)化合物的母離子常會(huì)發(fā)生同樣的代謝。常見(jiàn)的做內(nèi)標(biāo)的類(lèi)似物是氯代的化合物。氯代的化合物類(lèi)似物會(huì)和待測(cè)化合物有 相似的色譜保留時(shí)間，這是內(nèi)標(biāo)的一個(gè)重要特性。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)內(nèi)標(biāo)物的一個(gè)最 重要的特性是它和待測(cè)化合物共流出。我該如何使用內(nèi)標(biāo)？首先，內(nèi)標(biāo)添

14、加需在樣品測(cè)試方法的開(kāi)始階段，典型的，應(yīng)在血漿crash或固相萃取之前。內(nèi)標(biāo)應(yīng)用同一濃度水平添加（包括標(biāo)樣）。內(nèi)標(biāo)應(yīng)給出可靠的質(zhì)譜響 應(yīng)。應(yīng)該注意的是：內(nèi)標(biāo)的量應(yīng)添加得合適，應(yīng)高丁定量限，但不能過(guò)高，因?yàn)?過(guò)高的內(nèi)標(biāo)響應(yīng)會(huì)抑制被分析物的離子化。我應(yīng)該添加多少量的內(nèi)標(biāo)？ ”這是一 個(gè)重要的問(wèn)題。通過(guò)做一些試分析：早、中、晚的時(shí)間點(diǎn)，也許一個(gè)或兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn) 點(diǎn)，你應(yīng)該知道你的樣品中化合物的大概量。這些信息非常有價(jià)值，可以幫助建 立一個(gè)合適的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并知道應(yīng)添加多少量的內(nèi)標(biāo)。舉例來(lái)說(shuō)：如果待定量的 樣品濃度范圍是100 fg25 pg,檢測(cè)限是100 fg,你應(yīng)該添加510 pg的內(nèi) 標(biāo)。一個(gè)好的經(jīng)驗(yàn)

15、法則是：內(nèi)標(biāo)物的量大概是標(biāo)準(zhǔn)工作曲線濃度最高點(diǎn)的1/3。這將給出一個(gè)比較不錯(cuò)的響應(yīng)，并且不會(huì)抑制和干擾待測(cè)樣品的離子化。見(jiàn)圖 1圖1內(nèi)標(biāo)的量（內(nèi)標(biāo).gif）質(zhì)譜定量的原則05液相色譜申聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用藥代動(dòng)力學(xué)方法開(kāi)發(fā)更快就是更好！在每一個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)分析中更快就是更好！樣品組/系列包括：重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)品，QC質(zhì)控樣品，和樣品，加起來(lái)大概要進(jìn)行 300次分析。如果每個(gè)樣品實(shí)驗(yàn)耗時(shí)15分鐘，整套分析要75個(gè)小時(shí)。高要求的 實(shí)驗(yàn)（加上質(zhì)譜）總計(jì)要超過(guò) 3天時(shí)間。一些該領(lǐng)域的研究者可以只花 12分 鐘分析一個(gè)樣品；而大多數(shù)的PK/MS的實(shí)驗(yàn)室一般很容易做到花34分鐘分析一個(gè)樣品。如果對(duì)上面同樣的300個(gè)樣，4分

16、鐘一個(gè)實(shí)驗(yàn)的話，總分析時(shí)間可減 少到20個(gè)小時(shí)。所以，每分鐘都是很重要的！在 2m心3050mm反相短柱上 可以獲得快速的梯度和快速的平衡時(shí)間。LC/MS的非藥動(dòng)實(shí)驗(yàn)中，流速一般為 200 |/min.，而在LC/MS的藥動(dòng)實(shí)驗(yàn)中，流速一般設(shè)為 4001000 |/min 0更 快的流速有助于加速洗脫和平衡。下面是典型的LC/MS藥動(dòng)實(shí)驗(yàn)條件：LC/MS藥動(dòng)實(shí)驗(yàn)方法：色譜柱：2.1 X 50 mm, 5, 100 ? , C18柱溫：40 C流動(dòng)相：A為水相（0.1%甲酸），B為乙睛（0.1%甲酸） 流速：400(J/min梯度：Time(min.)%B0252802.125425Notes：

17、a）調(diào)節(jié)初始的 B使其適應(yīng)該化合物b）試著減少梯度時(shí)間到1分鐘以縮短方法時(shí)間優(yōu)化梯度：當(dāng)然你要對(duì)每個(gè)化合物特別的進(jìn)行方法優(yōu)化。我們推薦創(chuàng)建一個(gè)色譜數(shù)據(jù)庫(kù)，詳 細(xì)地記錄實(shí)驗(yàn)室接手的各個(gè)化合物的疏水性（可以運(yùn)行60/60方法完成）。當(dāng)你需要挑選一個(gè)相似疏水性的內(nèi)標(biāo)時(shí)，這樣的色譜數(shù)據(jù)庫(kù)將非常有用。在長(zhǎng)時(shí)間的 梯度中， B的起始值一旦明確，那么在縮短時(shí)間時(shí)，就把 B的值降10%。舉 例來(lái)說(shuō)，如果 B初始值是40%，那么在運(yùn)行液質(zhì)藥動(dòng)方法時(shí)，起始值 B就是 30%。這種方法將確保你的化合物可以留在你的柱子上。優(yōu)化柱子和流動(dòng)相：在上面舉例的液相條件中，一些化合物有可能響應(yīng)得不好。一些化合物可能要求 不同的

18、有機(jī)改性試劑或有機(jī)相。一般，磷酸鹽不適用于質(zhì)譜。有些人用1020mM 低濃度的醋酸鉉作A相緩沖鹽。另一些人合并甲醇和乙睛在 B相中。如果你的 化合物峰形不好，需要改變幾個(gè)或者所有的實(shí)驗(yàn)參數(shù)。必須選用合適的柱子去獲 得好的回收和好的峰形。幫助提示：1）一個(gè)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)室可能要整日忙著做色譜方法開(kāi)發(fā)，尤其是如果這個(gè)實(shí)驗(yàn)室每 周要接510個(gè)新化合物樣品。在組合化合物和它們的內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行組合的色譜方 法開(kāi)發(fā)方面我們頗有心得。并不是所有的化合物適用于這種方式，但是這個(gè)方法 為我們節(jié)省了大量的方法開(kāi)發(fā)的時(shí)間。當(dāng)我們發(fā)現(xiàn)做6個(gè)化合物混合樣的方法開(kāi) 發(fā)時(shí)間，和一個(gè)化合物的幾乎一樣時(shí)，這個(gè)在新的組合給藥（casset

19、te dosing方 法開(kāi)發(fā)中，該方法就變得非常有用。注：cassette dosing是一種新的給藥方法，稱(chēng)為盒式給藥法，乂稱(chēng)為組合給藥技 術(shù)，由Ber- man等提出，即給動(dòng)物同時(shí)服用幾種藥物，按常規(guī)取樣時(shí)間取血， 運(yùn)用HPLC聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行樣品處理分析。2）加速方法開(kāi)發(fā)。許多常見(jiàn)化合物如布洛芬已經(jīng)有人建立了方法，檢索一下文 獻(xiàn)、互聯(lián)網(wǎng)和USP的出版物，查到這些方法。不要浪費(fèi)時(shí)間從頭開(kāi)始 ！3）組合給藥技術(shù)常常加速化合物篩選過(guò)程。許多研究者不愿做組合實(shí)驗(yàn)技術(shù)， 是因?yàn)楹ε滤幬?藥物相互作用。一種可取的方式是給藥后合并化合物。合并上 述的方法開(kāi)發(fā)方法，可以為任務(wù)重的實(shí)驗(yàn)室節(jié)省大量的時(shí)間。4）H

20、PLC自動(dòng)進(jìn)樣器往往是出奇的慢，記得在平衡時(shí)間里考慮自動(dòng)進(jìn)樣器，因?yàn)楫?dāng)自動(dòng)進(jìn)樣器工作時(shí)，柱子是在初始化（initial）條件下被活洗的，必須在平衡 時(shí)間里考慮這個(gè)時(shí)間。你可以從方法里砍掉3060秒的平衡時(shí)間。要分秒必爭(zhēng)嘛！從300個(gè)樣品分析中，每個(gè)砍掉3060秒，就是5個(gè)小時(shí)啊！ 質(zhì)譜定量的原則06一樣品的制備（適用丁液質(zhì)藥動(dòng)分析的樣品制備）樣品一般在血漿或血活中。離心去除血液里的血細(xì)胞獲得血漿。血液凝固后 去除固體得到血活樣品。凝固血液活除血液細(xì)胞和凝血因子。血活比血漿易丁處 理，因?yàn)槟蜃右呀?jīng)被去除。當(dāng)使用儲(chǔ)存的血漿時(shí)，常會(huì)發(fā)現(xiàn)蓬蓬的凝塊物， 使樣品很難進(jìn)入吸液管pipette不管是血活

21、還是血漿，在進(jìn)入反相柱分析前都要 作進(jìn)一步的處理。下面會(huì)討論幾種的方法用以制備可以用作液質(zhì)藥動(dòng)分析的血漿 和血活樣品。血漿破碎（crash （有時(shí)稱(chēng)蛋白沉降）血漿破碎/蛋白沉降是最常用的方法，因?yàn)樗话悴灰筇厥獾膬x器。用乙 睛或甲醇沉淀去除豐度的白蛋白。一個(gè)典型的方法描述如下：前處理血漿蛋白沉淀.jpg （26.75 KB）血漿破碎（crasD /蛋白沉降方法：1）放50?l血漿或血活在0.5毫升管中2）加10?l內(nèi)標(biāo)3）添加140?l冷（凍）的有機(jī)溶劑（乙睛或甲醇）然后渦旋4）冷凍樣品2小時(shí)5）稍稍離心樣品，分離出沉淀的蛋白6）取150?l上活液至一干凈管，加150?l液相的A相（水相）.

22、在這時(shí)，樣品里含的有機(jī)相大概為 38%。如果你的化合物要求更低的有機(jī) 相，來(lái)保留在色譜柱上，應(yīng)增加第 6）步添加的水相的量。7）把6）項(xiàng)的樣品，進(jìn)行HPLC進(jìn)樣做液質(zhì)聯(lián)用的藥動(dòng)分析。固相萃取：許多人首選固相萃取法 SPE。在SPE中，血漿或血活被直接加入一個(gè)疏水 的固相中，一般是 C18小柱。加入后，用有機(jī)相淋洗小柱，則感興趣的小分子 會(huì)被洗脫下來(lái)。SPE可以是手動(dòng)的，也可以是小批量的。手動(dòng)的SPE制備方法限制了樣品的通量?？梢杂?6孔板做自動(dòng)化。一些人認(rèn)為96孔板非常貴，一個(gè) 96孔板大約為100美元，但是痕量成本時(shí)應(yīng)該考慮易用性和最終產(chǎn)品的貢獻(xiàn)。 一些人發(fā)現(xiàn)：用丁液質(zhì)聯(lián)用藥動(dòng)分析的最終洗提

23、液（eluant）質(zhì)量更好，反相柱的附著物和質(zhì)譜信號(hào)的滾動(dòng)（roll-off）發(fā)生在較低的速率。液液萃取：必須承認(rèn)我們?cè)谶@方面沒(méi)有很多經(jīng)驗(yàn)。這里是我所知道的。液液萃取只工作 在那些可以分隔進(jìn)入有機(jī)相的化合物。它可能是一種樣品凈化的有效方法。然 后，這種技術(shù)很難自動(dòng)化。藥代的各種樣品處理波液林（LLE）固相萃職（SPE）蛋白沉降（PPT11職部分樣品乙添加內(nèi)標(biāo)加入緩神袱加入甲基叔丁基醒振揮1盼鐘離心移走oue3-蓄發(fā)至干重溶1C轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣瓶1進(jìn)樣1瑕部分樣品2. 添加內(nèi)標(biāo)3. 加隘酸4. 活化吸附劑加樣品到吸附劑中6. 神洗7. MS3,重溶9. 轉(zhuǎn)移到進(jìn)祥瓶10. 進(jìn)樣1. 職部分樣品2. 添

24、加內(nèi)標(biāo)3. 加入乙睛4 -離心5, 移走6, 重溶了，轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣瓶8.進(jìn)祥這是一個(gè)補(bǔ)充的圖，一種列表的方式，介紹各種前處理。各課題組，都根據(jù)自己的需要選擇方式。夢(mèng)想的方法是：簡(jiǎn)單的沉淀、離心蛋白法。這時(shí)候可能有堵的問(wèn)題，因?yàn)樘幚矸?常簡(jiǎn)單，也許會(huì)堵。所以各個(gè)用戶(hù)買(mǎi)液質(zhì)的時(shí)候會(huì)問(wèn)賣(mài)液質(zhì)的銷(xiāo)售一個(gè)sillyquestion：你們的儀器是不是可以直接做沉淀蛋白的，而不堵啊？問(wèn)的可愛(ài)，答的精彩”！質(zhì)譜定量的原則07質(zhì)譜藥動(dòng)定量分析的標(biāo)準(zhǔn)物和創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線簡(jiǎn)介完整的定量分析依賴(lài)丁參考標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量。一種合格的參考標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)能通過(guò)（pasS> 一系歹0定性參考標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)試。參考標(biāo)準(zhǔn)的定性測(cè)試要設(shè)計(jì)為：充分地表

25、征參考標(biāo) 準(zhǔn)的質(zhì)量和含量。如果參考標(biāo)準(zhǔn)的含量不對(duì)，那么建立在其上的定量分析一定是 錯(cuò)的。然而，當(dāng)進(jìn)行 研究性藥動(dòng)”時(shí)，可能沒(méi)有足夠的時(shí)間去充分地表征化合物， 因?yàn)楹芎?jiǎn)單，在一周內(nèi)，實(shí)驗(yàn)室要做三種新化合物。所以，當(dāng)面臨開(kāi)發(fā)一種研究型藥動(dòng)”方法時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)努力建立一個(gè)假定的參考標(biāo)準(zhǔn)，在做整套化合物實(shí) 驗(yàn)室保持不變，而且實(shí)驗(yàn)室能夠永久地獲得該假定參考標(biāo)準(zhǔn)，用丁日后的參考。這個(gè)步驟能確保：每個(gè)相對(duì)丁這個(gè)假定的參考標(biāo)準(zhǔn)的藥動(dòng)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虮粶y(cè)量。創(chuàng)建 標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟在定量分析中也至關(guān)重要。為了使分析可靠，這個(gè)參考標(biāo)準(zhǔn)必須可靠，在創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線上的每一點(diǎn)時(shí)，每一 次稱(chēng)重和取液都必須準(zhǔn)確無(wú)誤。下面我們介紹，在液質(zhì)藥

26、動(dòng)定量分析中典型的創(chuàng) 建標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法。創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線匯集所有可能知道的關(guān)丁未知樣品濃度范圍的信息，可以有計(jì)劃地繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線。以前曾介紹過(guò)一個(gè)快速的估算方法，早、中、晚的時(shí)間點(diǎn)伴隨著低、中、高 濃度的標(biāo)準(zhǔn)。鬼峰將允許創(chuàng)建一個(gè)更適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)曲線范圍，并會(huì)告訴你應(yīng)注入多少量的樣品。這些步驟可以使你免丁重復(fù)長(zhǎng)時(shí)間的開(kāi)發(fā)。 有些時(shí)間點(diǎn)可能包含高 濃度的目標(biāo)化合物。這個(gè)初步的分析可以告訴你是否稀釋?zhuān)?例如，最早的時(shí)間點(diǎn) 乘以10倍，讓你建立一個(gè)更合適的標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋方法舉例（你用的實(shí)際步驟可能與此區(qū)別很大，只把這個(gè)例子作 為參考）在下表中的稀釋步驟描述了一個(gè) 3X, （3X50 1）制備過(guò)程，以表

27、達(dá)最能模擬未知樣 品制備的實(shí)際情況。這個(gè)表包括了：加入有機(jī)溶劑做蛋白沉降。標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備 和用丁分析的注入的體積，應(yīng)該反映未知樣品的分析工作。稱(chēng)出大約1毫克的參考標(biāo)準(zhǔn)，并重組為一個(gè)10 ug/毫升，稱(chēng)量不到1毫克可能增大 稱(chēng)重誤差的可能性并傳遞誤差。 一些疏水化合物可能要求兩步的重組。例如，一種疏水化合物可能不能溶丁含水量高的溶液。試著在少量的DMSO中溶解這種化合物，然后在含最低量有機(jī)溶劑的溶液（這時(shí)化合物是穩(wěn)定和可溶的）中重組。 供應(yīng)這些化合物用以評(píng)估的藥用化學(xué)家，常常給出你關(guān)丁溶解度和穩(wěn)定性的建 議。（警告：這種稀釋方法可能會(huì)出錯(cuò)，你必須驗(yàn)證它。）參考標(biāo)準(zhǔn)濃度=10國(guó)/毫升（在不含血活的

28、溶液中制備）溶液 A = 1 g/ml （100 l套考標(biāo)準(zhǔn)+ 900 h血活）溶液B = 100 pg/ml （10 l拳考標(biāo)準(zhǔn) + 990 "血活）溶液 C = 10 pg/ml （10 l后考標(biāo)準(zhǔn) + 9990 h血活）溶液D = 1 pg/ml （10 l浴液 B + 990加血活）序 導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)溶液Ifa#內(nèi)標(biāo)有祝溶劑XX30 pl+420 pl-and mixand mix15O0 fg/ml75 p) Sol D*75 pi30 pl+420 pl21 pg/mJ150 pl Sal D叩30 pl420 pl35pgfml75 pl SolC75 pl30 pl+420

29、pl410 pg/ml150 B SolCOpl30 pl+420 pl520pgJml30 pl Sol B120 Ml30 Ml420 pl650 pgfml-75 / SolB+75 Ml30.+420 pl780 pg/ml120 pl SqIB30 pl30+420 pl6100 pg/ml15 pl Sol A135 pl30 pl420 pl9200 pg/ml30 pfA-fr120 pl30 pl+420 pl10500 pg/ml75 pl Sot A+75 pl十420 pl111000 pg/ml150 pl S«l A*Opl30 pr+420 pl下載標(biāo)準(zhǔn)

30、曲線法 standardcurve.rar （4.23 KB）（注意這個(gè)稀釋程序可能有錯(cuò)，你必須驗(yàn)證它） 方法注意：1. 在加入有機(jī)物沉淀蛋白前，內(nèi)標(biāo)應(yīng)與樣品充分混合。盡可能地加入低濃度有機(jī)相的內(nèi)標(biāo)，這樣不會(huì)引起永久的沉淀。如果可能的話，用在血活中制備的內(nèi) 標(biāo)儲(chǔ)液最好。2. 溶液A , B, C和D應(yīng)該在血活中制備，這樣標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品更接近未知的、在基質(zhì)中的實(shí)際樣品。3. 當(dāng)創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，應(yīng)避免系歹U的稀釋。因?yàn)槿绻诘谝淮蜗♂寱r(shí)，如果 犯了一個(gè)錯(cuò)誤，那么系列的稀釋將造成錯(cuò)誤漫步在整個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線上。4. 在配置溶液時(shí)，不要吸取 L的液體，更小的體積將導(dǎo)致更大的誤差。并且，確保你的移液管是校正過(guò)的。105. 用丁這個(gè)步驟的血活總量是12.7 mL。運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線: 由丁標(biāo)準(zhǔn)曲線常?？缭饺齻€(gè)（濃度）數(shù)量級(jí)，通常，標(biāo)準(zhǔn)樣品從低濃度高濃度 依次做樣。這個(gè)步驟保證不受高濃度標(biāo)樣的色譜交義污染。 在