新型表達(dá)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2腺病毒真核細(xì)胞載體的構(gòu)建和鑒定

1、新型表達(dá)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2腺病毒真核細(xì)胞載體的構(gòu)建和鑒定 作者：張正，劉丹平，陳峻江，郭韜，張男【摘要】 目的 構(gòu)建同時(shí)表達(dá)具有抗原表位FLAG標(biāo)記的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)目的蛋白和報(bào)告分子綠色熒光蛋白(GFP)的新型腺病毒真核細(xì)胞表達(dá)載體。方法 將去除翻譯終止密碼子并添加新的酶切識(shí)別位點(diǎn)Xho的BMP2基因定向連入腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle CMV-IRES-hrGFP-1。攜帶BMP2+基因的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定、Pme酶切線性化后轉(zhuǎn)化BJ5183-AD-1大腸桿菌，利用細(xì)菌內(nèi)同源重組機(jī)制將BMP2+和GFP基因連同其順勢(shì)表達(dá)元件重組入腺病毒基因組質(zhì)粒。用Pac酶切去除其質(zhì)

2、粒成分，暴露腺病毒基因組的反向末端重復(fù)序列，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，進(jìn)行腺病毒的包裝，完成新型腺病毒載體Ad CMV-BMP2+-IRES-GFP-1的構(gòu)建。作為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)制備多年來(lái)廣為應(yīng)用的 BMP2腺病毒表達(dá)載體Ad CMV-BMP2。以兩種載體感染骨髓基質(zhì)細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR和熒光顯微鏡分別檢測(cè)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和綠色熒光蛋白表達(dá)情況;通過(guò)堿性磷酸酶活性檢測(cè)判斷BMP2誘導(dǎo)成骨分化作用 。結(jié)果 突變后骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因序列、重組腺病毒穿梭質(zhì)粒和重組腺病毒質(zhì)粒酶切圖譜符合預(yù)定設(shè)計(jì)。感染骨髓基質(zhì)細(xì)胞后，新型腺病毒載體可同時(shí)表達(dá)報(bào)告分子GFP和具有誘導(dǎo)成骨分化活性的BMP2。結(jié)論 成功構(gòu)建表達(dá)B

3、MP2的新型腺病毒載體。 1 / 23【關(guān)鍵詞】 骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因;綠色熒光蛋白;腺病毒載體;同源重組;成骨誘導(dǎo) Abstract: Objective To construct a novel recombinant adenovirus vector expressing the BMP2 fused to FLAG epitope and green fluorescent protein(GFP) as a reporter on the same transcript. Methods The basic pairs of BMP2 behind the translation

4、stopping codon TAG were removed and a Xhorestriction site was added following the end of the mutant. Then, the mutant of BMP2 gene (BMP2+ gene)was ligated into the multiple cloning sites of the adenovirus shuttle plasmid pShuttle CMV-IRES-hrGFP-1 by means of the directional cloning technology. Once

5、tested by restriction digestion, the shuttle plasmid was linearized with Pme I and transformed into BJ5183-AD-1 cells to recombine the genes of BMP2+ and GFP together with their cis-acting elements into adenoviral plasmid through a new simplified bacterial homologous recombinant method. To expose it

6、s inversted terminal repeats, the recombinant adenoviral plasmids were digested with Pac, and were then used to 293 transfected cells to generate the desired recombinant adenoviruses, Ad CMV-BMP2+-IRES-GFP-1. After the resultant viruses infected the bone marrow stromal cells (MSCs), the expression o

7、f BMP-2 gene was verified by RT-PCR, the osteoinduction activity of the expressed BMP2 was confirmed by alkaline phosphatase activity assay, and the expression of GFP gene was tested through fluorescence microscope. As a positive contrast, another recombinant adenovirus, AdCMV-BMP2, which has been u

8、sed extensively since many years ago, was also constructed.Results Either the sequence of BMP2 gene mutant or the restriction maps of the recombinant adenoviral shuttle plasmids and the recombinant adenoviral plasmids accorded with experimental project beforehand. The new recombinant adenovirus vect

9、ors could express both the gene of BMP2 and GFP at the same time. The expressed BMP2 had osteoinduction activity. Conclusions A novel recombinant adenovirus vector expressing the BMP2 fused to FLAG epitope and green fluorescent protein as a reporter on the same transcript were successfully construct

10、ed.Key words: bone morphogenetic protein 2 (BMP2) gene; green fluorescent protein (GFP); adenovirus vector; homologous recombination; osteoinduction重組腺病毒在基因治療中被作為一種高效基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)載體，廣泛用于將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞1。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2 ,BMP-2)是一種重要的成骨誘導(dǎo)分化細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)具有成骨分化潛能的間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，在骨的發(fā)生、發(fā)育、修復(fù)和再生過(guò)程中發(fā)

11、揮十分關(guān)鍵的作用。BMP-2轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)成骨可實(shí)現(xiàn)一定時(shí)間內(nèi)的BMP-2持續(xù)表達(dá)，近十年來(lái)受到廣泛關(guān)注。迄今為止，病毒型和非病毒型BMP-2表達(dá)載體都已被用于BMP-2基因轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)成骨研究，其中BMP-2腺病毒表達(dá)載體(BMP2-expressing recombinant adenoviral vector,Adv-BMP2)介導(dǎo)的BMP-2轉(zhuǎn)基因方法被認(rèn)為是其中最有效的手段2。為了方便基因的表達(dá)檢測(cè)，我們利用了一種新型的腺病毒載體構(gòu)建系統(tǒng)，使BMP2基因和綠色熒光蛋白(GFP)基因同時(shí)表達(dá)，并且通過(guò)對(duì)BMP2基因的突變，將FLAG抗原標(biāo)記附加于BMP2，構(gòu)建了一種新型的BMP2腺病毒表達(dá)載體

12、。1 材料和方法1.1 主要試劑限制性內(nèi)切酶:Not、Xba、Xho;高保真DNA聚合酶(TaKaRa PyrobestTMDNA Polymerase);大腸桿菌來(lái)源的堿性磷酸酶(Bacterial Alkaline phosphatases ,BAP);dNTP;T4DNA連接酶(T4DNA Ligase);DNA凝膠回收試劑盒;RT-PCR試劑盒和DNA Marker：DL1500、DL2000、Handdigest等購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司。限制性內(nèi)切酶Pme、Pac I購(gòu)于紐英倫(北京)生物技術(shù)有限公司。PCR提純?cè)噭┖?PCR Purification Kit)， 磷酸鈣轉(zhuǎn)染

13、試劑盒(MBS Mammalian Transfection Kit)為美國(guó)Stratagene公司產(chǎn)品。超純質(zhì)粒提純?cè)噭┖?MobiusTM 1000 Plasmid Kit )為德國(guó)Novagene公司產(chǎn)品。ALP檢測(cè)試劑盒(Alkaline/Acid Phosphatase Assay Kit)購(gòu)于美國(guó)upstate公司。1.2 質(zhì)粒和菌株pcDNA3-BMP2由第四軍醫(yī)大學(xué)生化教研室蒲勤教授提供，BMP2基因cDNA位于多克隆位點(diǎn)Not、Xho位點(diǎn)之間，后者在基因連入過(guò)程中已經(jīng)被破壞。pcDNA3-BMP2+(BMP2+代表攜帶去除翻譯終止密碼子并添加新的酶切識(shí)別位點(diǎn)Xho的BMP2基

14、因)、腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle CMV- BMP2+-IRES-hrGFP-1及pShuttle CMV- BMP2均由我們自己構(gòu)建和保存3。BJ5183-AD-1大腸桿菌為Stratagene公司產(chǎn)品。1.3 細(xì)胞及細(xì)胞系人胚腎293細(xì)胞系為American Type Culture Collection( ATCC)產(chǎn)品。骨髓基質(zhì)細(xì)胞由本院外科實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)、保存。1.4 細(xì)菌內(nèi)同源重組構(gòu)建腺病毒質(zhì)粒將含有pShuttle CMV-BMP2+-IRES-hrGFP-1質(zhì)粒和pShuttle CMV-BMP2質(zhì)粒的菌株分別化線接種于LB-Kanamycin Agar,37 倒置培養(yǎng)過(guò)夜;次

15、日挑選單克隆,分別接種于10 mL LB-Kanamycin Broth，37 、劇烈振蕩、過(guò)夜培養(yǎng);第二日上午用堿裂解法抽提質(zhì)粒抽提質(zhì)粒， Pme 酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，確保穿梭質(zhì)粒已經(jīng)被Pme 酶切線性化。乙醇精制以上酶切反應(yīng)體系，重新溶解于ddH2O中，使終濃度為50100 ng /L，備用。電穿孔儀設(shè)置在200 , 2.5 KV, 25 F條件下。冰上預(yù)冷0.2 cm gap電擊杯、電擊池和2只微量離心管。冰上解凍BJ5183-AD-1電感受態(tài)細(xì)胞。于2只微量離心管中各加入40 L電感受態(tài)細(xì)胞胞，分別加入1 L Pme 酶切線性化的pShuttle CMV-BMP2+-IRES

16、-hrGFP-1和pShuttle CMV-BMP2,混合均勻后加入2支0.2 cm gap電擊杯。將電擊杯置于電擊池內(nèi)，送入電穿孔儀分別電擊。電擊后迅速向每只電擊杯中加入500 L的LB-Broth，吸打混均，接種于LB-Kanamycin Agar,37 倒置培養(yǎng)過(guò)夜。次日挑選10個(gè)單克隆，分別接種于10 mL LB-Kanamycin Broth，37 、劇烈振蕩、過(guò)夜培養(yǎng)。取5 mL過(guò)夜培養(yǎng)物抽提質(zhì)粒， Pac 酶切，在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳鑒定，篩選重組成功的陽(yáng)性克隆。剩余的4mL置于4 冰箱保存。將保存的4 mL陽(yáng)性細(xì)菌克隆液體培養(yǎng)物接種于250 mL LB-Kanamycin

17、Broth，大量擴(kuò)增、用超純質(zhì)粒提純?cè)噭┖谐樘醦Ad CMV- BMP2+-IRES-hrGFP-1和 pAd CMV-BMP2。1.5 腺病毒載體包裝Pac酶切pAd CMV- BMP2+-IRES-hrGFP-1和 pAd CMV-BMP20.8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，確保酶切完全后，以PCR反應(yīng)提純?cè)噭┖芯旅盖蟹磻?yīng)液，以去除酶和緩沖液，并將DNA(腺病毒基因組)重溶于滅菌ddH2O ，使終濃度為5 g/225 L ，-20保存?zhèn)溆?。常?guī)復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前24 h在2支直徑6 cm培養(yǎng)皿內(nèi)分別植入(78) × 105細(xì)胞，加 4 mL含10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，

18、在37 ，5% CO2 條件下過(guò)夜培養(yǎng)至70%匯合。以5 g DNA/只培養(yǎng)皿比例，將上述制備的兩種腺病毒基因組DNA及轉(zhuǎn)染試劑按照商家說(shuō)明分別加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37 ，5% CO2溫育10 h，用磷酸鈣法將腺病毒基因組DNA轉(zhuǎn)染于293細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)710日，必要時(shí)換液，待出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變現(xiàn)象后收集細(xì)胞，反復(fù)凍-融三次裂解細(xì)胞，離心收集病毒并測(cè)定病毒滴度，完成腺病毒載體的包裝。1.6 BMP2和GFP表達(dá)檢測(cè)將MSC細(xì)胞以5×105/孔的密度接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后，吸棄上清。隨機(jī)選取2 孔感染腺病毒Ad-CMV - BMP2+-IRES-hrGFP-1 ，另取2

19、孔感染Ad CMV-BMP2作為陽(yáng)性對(duì)照，感染復(fù)數(shù)(MOI)均為50，留下2孔作為陰性對(duì)照。37 孵育1 h，換成DMEM+10%胎牛血清培養(yǎng)基，在體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、37 飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)72 h,熒光顯微鏡下檢測(cè)GFP,然后按商家產(chǎn)品說(shuō)明,用RNA提純?cè)噭┖谐樘峒?xì)胞總mRNA。置于-80 冰箱保存待用。取3 種RNA 各約80 ng加入3 支反應(yīng)管內(nèi)，以8.5 L去RNA酶ddH2O稀釋，75 變性5 min，冰上冷卻。按商家說(shuō)明建立反應(yīng)體系，反轉(zhuǎn)錄BMP2基因cDNA第一鏈。反應(yīng)結(jié)束后冰上冷卻5 min備用。設(shè)計(jì)合成BMP2基因cDNA特異引物： 5-CGTGACTCTGTCTT

20、CTAG-3 ;5/-GCACACTCGAGGCGACAC-3。PCR擴(kuò)增BMP2 cDNA，取10 L在以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。BMP2基因在三組細(xì)胞內(nèi)的mRNA 表達(dá)情況。1.7 堿性磷酸酶活性檢測(cè)將第二代MSC細(xì)胞以1×103/孔的密度接種于96 孔板，在完全培養(yǎng)基內(nèi)， 5%CO2、37 、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。隨機(jī)選取32孔作為實(shí)驗(yàn)組(感染腺病毒Ad-CMV - BMP2+-IRES-hrGFP-1， MOI=50);另選32孔作為陽(yáng)性對(duì)照組(感染Ad CMV-BMP2， MOI=50);其余32孔作為陰性對(duì)照組(不予感染腺病毒載體)。37 孵育1 h，小心吸除個(gè)孔內(nèi)

21、的液體，用PBS清洗實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組各孔兩次，然后用完全培養(yǎng)基繼續(xù)在5%CO2、37、飽和濕度條件下培養(yǎng)各組細(xì)胞。分別于感染載體后第6、8、10、12日收集各組細(xì)胞，每次各組均收集8孔，調(diào)整各孔細(xì)胞濃度為1×105cells/mL,各取1 mL用于ALP活性檢測(cè)。繪制ALP活性曲線;對(duì)三組細(xì)胞6、8、10、12日4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的ALP活性采用發(fā)樣本均數(shù)兩兩比較q檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05的差異具有顯著性。1.8 采用重復(fù)測(cè)量的方差分析。2 結(jié) 果2.1 腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建 見(jiàn)圖1、2。2.2 ALP活性檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表1。表1 不同時(shí)間3 組細(xì)胞間ALP活性比較注：

22、三組比較F值=4.32，P<0.05;q1.3=4.67，P<0.01;q2.3=4.64，P<0.01;q1.2=0.47，P>0.053 討 論3.1 新型BMP2腺病毒載體的構(gòu)建細(xì)菌內(nèi)同源重組法是一種高效構(gòu)建腺病毒載體的方法4，這種方法首先需要構(gòu)建帶有目的基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒，然后將其與腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)BJ5183大腸桿菌，通過(guò)細(xì)菌內(nèi)同源重組機(jī)制將目的基因及其在真核細(xì)胞中表達(dá)所必需的順勢(shì)表達(dá)元件插入腺病毒基因組。pShuttle CMV -IRES-hrGFP-1是美國(guó)Stratagene公司開(kāi)發(fā)的一種新型腺病毒穿梭質(zhì)粒，具有CM

23、V啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)和PolyA信號(hào)區(qū)等真核基因表達(dá)所必需的順勢(shì)調(diào)控元件和同源重組序列。并且在多克隆位點(diǎn)后依次設(shè)計(jì)安排了FLAG抗原表位(FLAG epitope, FLAG為人工合成抗原表位，其氨基酸殘基序列為DYKDDDDK)基因、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site ,IRES)和GFP基因。由于IRES的存在，使插入多克隆位點(diǎn)的目的基因能與GFP基因以雙順?lè)醋拥男问酵瑫r(shí)表達(dá)。雙基因表達(dá)載體是載體構(gòu)建新的發(fā)展方向，以雙順?lè)醋有问奖磉_(dá)GFP報(bào)告基因和BMP2目的基因，同時(shí)能夠?qū)MP2進(jìn)行抗原表位標(biāo)記的腺病毒表達(dá)載體可極大的方便BMP2蛋白表達(dá)檢測(cè)，

24、目前尚未見(jiàn)報(bào)道，是一種新的嘗試。實(shí)驗(yàn)通過(guò)PCR技術(shù)突變?nèi)コ齪cDNA3-BMP2所攜帶的BMP2基因序列中翻譯終止密碼子后的堿基序列，在其后添加X(jué)ho位點(diǎn)。添加X(jué)ho位點(diǎn)后使基因能夠定向連接于pShuttle CMV -IRES-hrGFP-1多克隆位點(diǎn)中的Not和Xho之間。去除翻譯終止密碼子之后堿基的BMP2基因序列從翻譯起始密碼子到FLAG抗原表位基因的堿基序列長(zhǎng)度為1194bp，不會(huì)導(dǎo)致FLAG抗原表位基因的框移突變，而且由于去除了BMP2基因的終止密碼子，導(dǎo)致兩個(gè)基因的通讀，使兩種蛋白融合表達(dá)。重組腺病毒穿梭載體制備成功后，利用BJ5183細(xì)菌內(nèi)的同源重組機(jī)制，構(gòu)建了腺病毒質(zhì)粒Ad

25、CMV-BMP2+-IRES-rhGFP-1和Ad CMV-BMP2。Pac酶切圖譜表明在不同BJ5183重組陽(yáng)性克隆內(nèi)，由于穿梭質(zhì)粒和腺病毒質(zhì)粒均存在DNA原核復(fù)制起點(diǎn)Ori序列，重組成功的腺病毒質(zhì)粒經(jīng)Pac酶切后應(yīng)該產(chǎn)生一個(gè)大于23kb的DNA 片段和約3.0kb或4.5kb的小片段兩種均可以接受的情況。在已經(jīng)鑒定的Ad CMV-BMP2+-IRES-rhGFP-1陽(yáng)性克隆中，這兩種情況均已出現(xiàn)。而已鑒定的Ad CMV-BMP2陽(yáng)性克隆， Pac酶切僅產(chǎn)生23kb和3.0kb兩種長(zhǎng)度的DNA酶切片段(圖1、圖2)。實(shí)驗(yàn)中采用了先進(jìn)的細(xì)菌內(nèi)同源重組法來(lái)構(gòu)建腺病毒載體，從而大大節(jié)省了時(shí)間與費(fèi)用

26、。與目前普遍采用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)同源重組法相比，這種方法具有簡(jiǎn)便、快捷、經(jīng)濟(jì)和高效等優(yōu)勢(shì)。前者在293等包裝細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行同源重組，細(xì)胞的狀態(tài)對(duì)重組效率影響很大，通常要求傳代次數(shù)不得超過(guò)45代，因此有時(shí)不得不重復(fù)引進(jìn)代數(shù)較低的293細(xì)胞;另外，293細(xì)胞既是同源重組的場(chǎng)所，又是病毒的包裝的場(chǎng)所，包裝后的病毒需要經(jīng)過(guò)反復(fù)的篩選、鑒定和純化5。后者是對(duì)細(xì)菌操作，其培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化和重組克隆的篩選遠(yuǎn)較細(xì)胞方便、快捷和經(jīng)濟(jì)，技術(shù)也較成熟，從質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到重組克隆的出現(xiàn)僅需1220 h，加上篩選的時(shí)間也不過(guò)36 h;最重要的是，重組DNA(腺病毒質(zhì)粒)經(jīng)鑒定后在293細(xì)胞內(nèi)包裝，不需要再對(duì)病毒進(jìn)行篩選和鑒定，病毒滴度

27、和純度都較高。3.2 新型BMP2腺病毒載體的表達(dá)分析為了檢測(cè)所構(gòu)建的新型載體表達(dá)GFP和BMP2情況，進(jìn)一步將其和陽(yáng)性對(duì)照載體分別轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞(MSCs)，同時(shí)用未轉(zhuǎn)染載體的MSCs作陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染3天后，首先在熒光顯微鏡下對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行觀測(cè)，結(jié)果顯示感染新型載體的細(xì)胞表達(dá)GFP(圖3)。然后分別收集裂解三種細(xì)胞，提取其RNA，設(shè)計(jì)合成BMP2基因特異的正、反向引物，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，從轉(zhuǎn)染兩種重組腺病毒載體的MSCs中，均擴(kuò)增出長(zhǎng)度一致的DNA片段，這一長(zhǎng)度符合預(yù)期設(shè)計(jì)(兩引物間跨度為1190bp)，而陰性對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增出任何DNA片段，從而在mRNA水平上證實(shí)

28、了載體表達(dá)BMP2基因的可行性(圖4)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證載體表達(dá)產(chǎn)物(BMP2)的成骨誘導(dǎo)效應(yīng)和初步了解其時(shí)間動(dòng)力學(xué)規(guī)律，實(shí)驗(yàn)中對(duì)MSCs感染載體前后的ALP活性進(jìn)行了檢驗(yàn)，并選用感染后6、8、10、12日幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行了連續(xù)觀測(cè)。ALP是成熟成骨細(xì)胞具有代表性的標(biāo)志酶，具有水解有機(jī)磷酸物質(zhì)，提高局部磷酸根濃度和水解破壞鈣化抑制劑等重要功能，在體內(nèi)外鈣化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，ALP升高是MSCs向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的靈敏指標(biāo)6。感染后第6日檢測(cè)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，新型載體和陽(yáng)性對(duì)照載體均可以顯著提高M(jìn)SCs的ALP活性水平(P< 0.01)，兩種載體效應(yīng)差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P&am

29、p;gt;0.05)，因而在表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)行為層次上也證明了新型載體表達(dá)BMP2基因的可行性(表1)。以連續(xù)觀測(cè)結(jié)果繪制的曲線圖(圖5)顯示，細(xì)胞感染載體后8日內(nèi)ALP活性升高幅度較大，說(shuō)明載體表達(dá)BMP2量或其生物活性是十分高的，短期內(nèi)即可發(fā)揮明顯的生物學(xué)效應(yīng);10天后上升速度明顯減慢，曲線趨于平緩，ALP活性維持在一個(gè)較高水平，這可能與此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化或BMP2作用已經(jīng)接近飽和有關(guān)，實(shí)驗(yàn)中我們觀察到，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)已經(jīng)鋪滿培養(yǎng)板各孔底部。從曲線圖中還可以看到，MSCs本身有一定的基礎(chǔ)表達(dá)，但水平較低，曲線基本上呈一條平滑的基線，這是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)所應(yīng)用的MSCs是基于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的帖壁特點(diǎn)獲

30、得的，并非單一的細(xì)胞類型，其中包含有少量具有分泌ALP能力的細(xì)胞類型，如成骨細(xì)胞和確定性成骨祖細(xì)胞(DOPC)等。實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的BMP2腺病毒表達(dá)載體與以往的BMP2腺病毒載體不同，它可以同時(shí)表達(dá)具有抗原表位標(biāo)記的目的蛋白BMP2和報(bào)告分子GFP，這使新載體比原有載體具有很大的優(yōu)勢(shì)。首先，引入報(bào)告分子GFP使檢測(cè)活細(xì)胞BMP2表達(dá)成為可能。因此，一方面可以即時(shí)監(jiān)測(cè)表達(dá)情況;另一方面，細(xì)胞經(jīng)檢測(cè)后仍然可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)7。其次，引入FLAG抗原標(biāo)記增加了對(duì)目的基因的檢測(cè)手段，這在缺乏目的基因特異性單克隆抗體的情況下尤為重要8。【參考文獻(xiàn)】 1 Romano G，Michell P，Pacilio C，et al. Latest developments in gene transfer technology: achievements, perspectives, and controversies over therapeutic applicationsJ.Stem Cells, 2000, 18(1):19-39.2 Alden TD, Varady P,et al. Bone morphogenetic protein gene therapyJ. Spine,2002 ,27(16 Suppl 1): 87-93.3 張正，劉丹平,等.腺病毒穿梭質(zhì)粒pSh