靶向大鼠CTGF的shRNA表達載體的構(gòu)建和作用分析

1、靶向大鼠CTGF的shRNA表達載體的構(gòu)建和作用分析 作者：郎明健，曾秋棠，郭敏，楊漢東，閔新文 【摘要】 目的: 構(gòu)建并篩選靶向大鼠結(jié)締組織生長因子（CTGF）的shRNA表達載體. 方法: 根據(jù)大鼠CTGF mRNA序列設(shè)計并構(gòu)建4個靶向大鼠CTGF基因的shRNA干擾質(zhì)粒；然后以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大鼠心肌成纖維細胞，流式細胞技術(shù)分選出成功轉(zhuǎn)染的陽性細胞. 通過RTPCR和Western Blot技術(shù)對成功構(gòu)建的4個shRNA干擾質(zhì)粒進行有效性篩選，分析其CTGF mRNA及蛋白表達水平. 結(jié)果: 酶切證實轉(zhuǎn)錄shRNA的目的基因片段已成功克隆入載體，經(jīng)測序證明與設(shè)計的相同；在

2、轉(zhuǎn)染成纖維細胞48 h后，與空白對照組比較，有3組細胞CTGF mRNA及蛋白表達水平明顯降低；而轉(zhuǎn)染非特異陰性質(zhì)粒對照組CTGF mRNA及蛋白表達水平無明顯變化. 結(jié)論: 成功構(gòu)建并篩選出靶向大鼠CTGF的shRNA真核表達質(zhì)粒重組體，為進一步進行體內(nèi)外心肌纖維化的RNA干擾研究奠定了基礎(chǔ). 【關(guān)鍵詞】 結(jié)締組織生長因子;RNA干擾;質(zhì)粒;轉(zhuǎn)染;心內(nèi)膜；心肌纖維化 【Abstract】 AIM: To construct and screen out the potent shorthairpin RNA (shRNA)expressing plasmids which target to

3、 rat connective tissue growth factor (CTGF). METHODS: Four shRNA2 / 22expressing plasmids targeting to rat CTGF mRNA (Accession No: NM_022266) were designed and constructed based on the sequence of rat CTGF mRNA. The recombinant plasmids were identified by restriction enzyme assay and nucleotide seq

4、uence analysis. Then the plasmids were transfected into rat cardiac fibroblasts using lipofectamine2000 reagent, and the positive cells were sorted by fluorescence active cell sorting (FACS) technique. The mRNA and protein expressions of CTGF were analyzed by RTPCR and Western Blot technique, and co

5、mpared with thatof nontransfection group and negative control plasmid. RESULTS: The 4 recombinant plasmid vectors expressing CTGFtargeting shRNA were identified by restriction enzyme assay and sequence analysis. Fortyeight hours posttransfection, the mRNA and protein expressions of CTGF decreased in

6、 3 experimental groups compared with that in nontransfection group, but no changes occurred in negative control plasmid and lipofectamine2000 group. CONCLUSION: Four recombinant plasmids targeting to rat CTGF are successfully constructed, and 3 potent recombinant plasmids are screened out. This lays

7、 a foundation for further researches of RNA interference on cardiac fibrosis in vivo and in vitro. 【Keywords】 connective tissue growth factor; RNA interference; plasmid; transfect; cardiac fibrosis0引言 結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor, CTGF）是一種促組織纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵細胞因子，在多種器質(zhì)性纖維化疾病如腎間質(zhì)纖維化、肝硬化、皮膚瘢痕的形成等

8、中均起關(guān)鍵作用1-3. 近年來也有研究提示CTGF可能參與了心肌纖維化的發(fā)生4-5. RNA干擾（RNA interference, RNAi）是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默技術(shù)，是比基因敲除、反義寡核苷酸干擾更有前途的作用于mRNA水平的干擾技術(shù)，具有相對簡單、抑制作用更為完全、特異性高等特點，在高通量研究基因功能、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及進行靶向基因靜默治療等方面廣泛應(yīng)用. 本研究通過構(gòu)建并篩選CTGF靶向特異性的shRNA（shorthairpin RNA）真核表達載體，為今后通過RNAi技術(shù)抑制CTGF表達、從基因與蛋白質(zhì)水平探索CTGF在促心肌纖維化的作用打下基礎(chǔ). 1材料和方法 1.1材料真核表達載

9、體pGenesil1質(zhì)粒和感受態(tài)大腸桿菌DH5購自武漢晶賽生物工程技術(shù)有限公司;限制性核酸內(nèi)切酶BamH I, Hind , Sal I, Pst I和T4多聚核苷酸激酶及其緩沖液均購自寶生物工程大連有限公司;T4 DNA連接酶及緩沖液購自New England Biolabs;凝膠回收試劑盒和小量質(zhì)粒提取試劑盒購自寧波中鼎生物技術(shù)有限公司;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000購于Invitrogen;山羊抗大鼠CTGF多克隆抗體購自Santa Cruz;HRP標記的兔抗山羊二抗及ECL試劑盒購于Pierce公司. 1.2方法 1.2.1CTGF靶向性shRNA序列的設(shè)計與合成CT

10、GF靶向性shRNA干擾序列的設(shè)計合成參見文獻6. 簡言之，從GenBank上選取大鼠CTGF的基因序列(序列號NM_022266)，用專業(yè)RNAi設(shè)計軟件結(jié)合個人經(jīng)驗優(yōu)選四段序列為靶序列，同時設(shè)計一對非特異性序列作為對照，并與大鼠基因組進行BLAST比對，驗證均為單一基因. 然后進行以上寡核苷酸DNA單鏈的合成，并退火連接形成雙鏈. 1.2.2靶向大鼠CTGF的 shRNA表達載體的重組構(gòu)建及鑒定CTGF靶向性干擾質(zhì)粒的克隆重組、限制性內(nèi)切酶分析及測序鑒定參見文獻6. 首先，線性化處理目的質(zhì)粒，再把基因片段與線性化質(zhì)粒連接從而克隆重組成新的靶質(zhì)粒，隨后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌DH5，在含Kana抗性（

11、終濃度為20 g/mL）的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，將提取得到的重組的陽性克隆質(zhì)粒用Pst I和Sal I進行酶切分析并進行測序鑒定. 1.2.3大鼠心肌成纖維細胞的分離培養(yǎng)取出生12 d的SD乳鼠(購自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心)消毒后無菌操作取心尖組織，剪碎成1 mm3大小，加入適量含0.8 g/L胰蛋白酶和0.5 g/L膠原酶混合液，37水浴下機械混勻，完全消化，加入含100 mL/L新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，離心棄上清，制備成細胞懸液接種到培養(yǎng)瓶，差速貼壁60 min去除心肌細胞，用含100 mL/L新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37, 50 mL

12、/L CO2培養(yǎng)環(huán)境中恒溫培養(yǎng). 以后每2 d換液1次，待細胞鋪滿瓶底后傳代繼續(xù)培養(yǎng). 取第3代細胞進行后續(xù)實驗. 1.2.4心肌成纖維細胞的基因轉(zhuǎn)染及流式分選將培養(yǎng)至第3代的心肌成纖維細胞以1.25 g/L胰酶消化離散，接種于6孔板繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞鋪板密度達90%左右時，進行轉(zhuǎn)染實驗. 實驗分為如下6組：空白對照組（即單純細胞組）,陰性對照HK質(zhì)粒組,1號質(zhì)粒組,2號質(zhì)粒組,3號質(zhì)粒組,4號質(zhì)粒組. 參照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000試劑盒操作說明轉(zhuǎn)染細胞. 為純化轉(zhuǎn)染成功的陽性細胞，于轉(zhuǎn)染后48 h后對所有質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（14號質(zhì)粒及陰性HK質(zhì)粒）進行流式細胞分選. 分選出的

13、5組細胞及空白對照細胞進入后續(xù)的篩選實驗. 1.2.5RNA的提取及半定量RTPCR檢測根據(jù)實驗分組，在刺激時相點結(jié)束后，加入TRIZOL提取細胞總RNA，以30 L去RNase水溶解，采用紫外分光光度儀測定濃度，利用瓊脂糖凝膠電泳檢驗RNA的質(zhì)量. RTPCR檢測采用兩步法進行. 逆轉(zhuǎn)錄過程以Random 9 mers為隨機引物，AMV為逆轉(zhuǎn)錄酶，反應(yīng)條件為：30保溫10 min,44聚合延伸30 min, 99滅活逆轉(zhuǎn)錄酶5 min, 5穩(wěn)定5 min. PCR過程以3磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參照. CTGF上下游引物序列分別為5GCTGGGGCTCACCTGAAGG3和5GGA

14、TGACCTTGCCCACAGCC3，擴增長度499 bp; GAPDH上下游引物序列分別為5CCTGACCCAACTATGATGC3和5CCCTTACTCCCTGGCTTT3，擴增長度為343 bp. 引物均用Primer5.0設(shè)計，送上海生物工程有限公司合成. PCR反應(yīng)條件如下：95變性5 min； 然后95變性1 min,55退火1 min,72延伸1 min,共計30個循環(huán)；最后72延伸7 min. PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，拍照并經(jīng)過凝膠成像分析系統(tǒng)對電泳帶進行分析，測定各目的基因和GAPDH擴增產(chǎn)物的吸光值，分別計算其比值. 1.2.6蛋白提取及Western B

15、lot檢測根據(jù)實驗分組，以冰PBS洗滌細胞，按照5×106個細胞加入50uL蛋白裂解液提取細胞總蛋白，蛋白提取液在4條件下以12 000 g離心20 min，取上清，采用紫外分光光度儀用Bradford方法測定蛋白濃度后分裝，-70保存. 取上述細胞蛋白提取液進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）. 將電泳分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，置于50 g/L脫脂奶粉的PBS中封閉3 h后分別加入CTGF（1400），F(xiàn)N（1500）多克隆抗體4孵育過夜后，硝酸纖維素膜用3 g/L的TweenPBS液反復(fù)沖洗3次，每次15 min. 將沖洗后的膜置于辣根過氧化物酶標記的IgG中，室

16、溫下?lián)u床上孵育2 h. 用3 g/L的TweenPBS液反復(fù)沖洗3次，每次15 min. 并以兔抗大鼠actin（1500）多克隆抗體同上操作，作為上樣對照. 抗原抗體復(fù)合物用增強化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence, ECL）法顯影，暗室X光膠片曝光，采用GELW4D軟件分析蛋白條帶的積分光密度值（integrated optical density, IOD=平均光密度×面積），以IOD靶蛋白/IODactin的比值反映靶蛋白相對水平. 統(tǒng)計學(xué)處理: 用SPSS12.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理, 數(shù)據(jù)以x±s表示，多個均數(shù)比較用單因素方差分

17、析,兩個均數(shù)比較用t檢驗. P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異. 2結(jié)果 2.1選定的靶序列及針對每條靶序列設(shè)計的雙鏈shRNA靶序列結(jié)構(gòu)模式：BamHI+Sense+Loop+Antisense+ 終止信號+SalI+HindIII CTGF1: AAGGGTCTCTTCTGCGACTTC; CTGF1A: 5GATCCGGGTCTCTTCTGCGACTTCTTCAAGACGGAAGTCGCAGAAGAGACCCTTTTTTGTCGACA3; CTGF1B: 3GCCCAGAGAAGACGCTGAAGAAGTTCTGCCTTCAGCGTCTTCTCTGGGAAAAAACAGCTGTTC

18、GA5; CTGF2: AAAGATGGTGCACCCTGTGTC; CTGF2A: 5GATCCAGATGGTGCACCCTGTGTCTTCAAGACGGACACAGGGTGCACCATCTTTTTTTGTCGACA3; CTGF2B: 3GTCTACCACGTGGGACACAGAAGTTCTGCCTGTGTCCCACGTGGTAGAAAAAAACAGCTGTTCGA5; CTGF3: GAGTCCTTCCAAAGCAGTT; CTGF3A: 5GATCCGAGTCCTTCCAAAGCAGTTCTATGGACAAACTGCTTTGGAAGGACTCTTTTTTGTCGACA3; CTGF3B

19、: 3GCTCAGGAAGGTTTCGTCAAGATACCTGTTTGACGAAACCTTCCTGAGAAAAAACAGCTGTTCGA5; CTGF4: CCGATGGCGAGATCATGAA; CTGF4A: 5GATCCGCCGATGGCGAGATCATGAATTCAAGACGTTCATGATCTCGCCATCGGTTTTTTGTCGACA3; CTGF4B: 3GCGGCTACCGCTCTAGTACTTAAGTTCTGCAAGTACTAGAGCGGTAGCCAAAAAACAGCTGTTCGA5. 以上各序列中畫橫線部分為正義及反義序列，斜體加粗部分為shRNA的環(huán)區(qū)序列，兩端的框中為B

20、amHI和Hind部分酶切殘基，退火成雙鏈后能夠形成酶切位點的粘性末端，可與工具質(zhì)粒相應(yīng)的黏性末端連接；其余部分為終止信號+SalI. 構(gòu)建好的質(zhì)粒重組體分別命名為CTGF14. 2.2心肌成纖維細胞瞬時轉(zhuǎn)染以Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染心肌成纖維細胞2448 h后，倒置熒光顯微鏡下可見各轉(zhuǎn)染組心肌成纖維細胞在成功轉(zhuǎn)染后可被激發(fā)出亮綠色熒光，粗略估測轉(zhuǎn)染效率約30%40%（圖1）. 圖1熒光顯微鏡下瞬時轉(zhuǎn)染效果×100 2.3心肌成纖維細胞的流式分選流式細胞分選表明，以Lipofectamine2000進行心肌成纖維細胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，瞬時轉(zhuǎn)染效率僅約為30%（圖2）. M1:

21、成功轉(zhuǎn)染的細胞比率; A:陰性對照; B:陽性轉(zhuǎn)染細胞. 圖2心肌成纖維細胞流式分選結(jié)果 2.4不同實驗組心肌成纖維細胞CTGF mRNA的表達半定量RTPCR結(jié)果顯示，序列非特異性的陰性對照質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染心肌成纖維細胞后對細胞CTGF基因表達無下調(diào)效應(yīng).4個待篩選的目標質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，表現(xiàn)出不同的抑制效應(yīng)，其中在轉(zhuǎn)染1號質(zhì)粒的細胞未表現(xiàn)出抑制效果，轉(zhuǎn)染2, 3, 4號質(zhì)粒后有明顯抑制效應(yīng)，尤其以3號質(zhì)?；虺聊饔米顝姡▓D3）. 2.5不同實驗組心肌成纖維細胞的CTGF蛋白表達水平結(jié)果顯示，序列非特異性的陰性對照質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染后對細胞CTGF蛋白表達無下調(diào)效應(yīng)；4個待篩選的目標質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后， 1號質(zhì)粒

22、未表現(xiàn)出任何抑制效果，2, 3, 4號質(zhì)粒有明顯抑制效應(yīng)，尤其以3號質(zhì)粒抑制作用最強，約75%（圖4）. 3討論 CTGF是近年來國內(nèi)外研究的熱點之一， 它可能是TGF1促纖維化活性的下游信號介質(zhì)，刺激細胞增殖及細胞外基質(zhì)的形成，在組織纖維化中有重要作用. 研究發(fā)現(xiàn)在高血壓、粥樣硬化病變中以及心肌梗死灶中CTGF表達明顯增高，并與纖維化指標正相關(guān)，提示CTGF可能是致心肌纖維化的關(guān)鍵性中間環(huán)節(jié)7-9. 通過靶向抑制CTGF從而抑制纖維化的發(fā)生和發(fā)展理論上是抗纖維化的有效方式，已有研究應(yīng)用抗CTGF的單克隆抗體FG3019或針對CTGF的反義寡核苷酸用于抑制腎間質(zhì)纖維化、肺纖維化并取得一定進展1

23、0-11. RNA干擾（RNAi）是作用于mRNA水平的基因沉默技術(shù),其機制可能是細胞內(nèi)雙鏈RNA在Dicer酶的作用下，可形成2123 bp大小的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，精確降解與siRNA序列相同的mRNA，抑制了該基因在細胞內(nèi)的翻譯和表達從而達到轉(zhuǎn)錄后水平的基因靜默12-15. 由于siRNA表達載體成功轉(zhuǎn)染后可進行瞬時或穩(wěn)定的基因沉默，因此相較于化學(xué)合成的siRNA更有應(yīng)用價值和前景. 本研究應(yīng)用OptiRNA設(shè)計軟件結(jié)合個人經(jīng)驗設(shè)計了4條針對大鼠CTGF基因的靶向干擾序列，經(jīng)BLAST證實與大鼠基因組其他基因無同源性，因此具備了靶向特異

24、性的特點. 我們構(gòu)建的CTGFshRNA質(zhì)粒重組體使用了U6啟動子啟動shRNA的轉(zhuǎn)錄以及Pol識別的終止信號終止轉(zhuǎn)錄，符合siRNA表達載體的設(shè)計要求；通過酶切實驗和基因測序也證實目標質(zhì)粒構(gòu)建成功. 另外，本質(zhì)粒含有增強型綠色熒光蛋白編碼基因，成功轉(zhuǎn)染后能在細胞內(nèi)借助U6啟動子轉(zhuǎn)錄出綠色熒光蛋白，通過熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡或流式細胞儀可非常方便的評估轉(zhuǎn)染效率或進行細胞分選，為成功的RNA干擾實驗提供支撐. 由于我們早期進行的預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000對心肌成纖維細胞進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染其轉(zhuǎn)染效率僅有30%40%，達不到進行理想的基因干擾實驗的要求. 因此，為了

25、提高篩選結(jié)果的準確性和可信度，本實驗對轉(zhuǎn)染細胞進行了流式分選. 由于分選出的陽性細胞基本上都是已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒的心肌成纖維細胞，因此最大限度減少了篩選實驗假陰性結(jié)果的發(fā)生. 通過檢測CTGF mRNA與蛋白的表達水平，我們比較了4個目標質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞與非轉(zhuǎn)染細胞的表達差異. 結(jié)果表明，CTGF2,3,4號干擾質(zhì)粒均可有效地抑制CTGF mRNA及蛋白的表達，尤其以3號干擾質(zhì)粒基因沉默效果更為顯著，抑制效率可達75%以上，說明CTGF shRNA可高效特異抑制CTGF的表達. 而CTGF1干擾質(zhì)粒無明顯抑制效率，說明并非所有設(shè)計的siRNA均可有效地抑制靶基因的表達，因此，RN

26、A干擾實驗要求通常一個基因需要設(shè)計多個靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列. 陰性對照組與空白對照組相比CTGF mRNA表達無明顯改變，排除了質(zhì)粒載體本身、非特異性的靶基因?qū)TGF基因表達的影響. 綜上所述，本研究成功設(shè)計并構(gòu)建了4個靶向CTGF的shRNA質(zhì)粒，并通過篩選實驗獲得了高效及靶向特異的目標質(zhì)粒. 為后續(xù)心肌纖維化的體內(nèi)外RNA干擾研究及進一步探索CTGF在心肌纖維化及心臟的組織重塑中的地位與作用奠定了基礎(chǔ).【參考文獻】 1 Duncan MR, Frazier KS, Abramson S, et al. Connective tissue growth fact

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28、rming growth factor beta in persistent fibrosis: A mouse fibrosis modelJ.J Cell Physiol,1999,181(1):153.4 Ahmed MS, Oie E, Vinge LE, et al. Connective tissue growth factora novel mediator of angiotensin IIstimulated cardiac fibroblast activation in heart failure in ratsJ. J Mol Cell Cardiol, 2004, 3

29、6: 393-404.5 Kemp TJ, Aggeli IK, Sugden PH, et al. Phenylephrine and endothelin1 upregulate connective tissue growth factor in neonatal rat cardiac myocyteJ. J Mol Cell Cardiol, 2004,37(2):603-606.6 郎明健,曾秋棠,郭敏,等.大鼠結(jié)締組織生長因子短發(fā)夾RNA干擾質(zhì)粒重組體的構(gòu)建和鑒定J. 臨床心血管病雜志,2007,23（1）：51-55.7 Chen M, Lam A, Abraham JA, et al. CTGF expression is induced by TGFbetal in cardiac fibroblasts and cardiomyocytes: A potential role in heart fibrosis J. J Mol Cell Cadiol, 2000,32(10): 1805-1819.8 Piet F, Kaija I, Juhani A, et al. Angiotension II induces connective tissue growth factor gene expression via