亞洲帶絳蟲(chóng)膜聯(lián)蛋白B2基因的表達(dá)、純化及免疫學(xué)分析

1、亞洲帶絳蟲(chóng)膜聯(lián)蛋白B2基因的表達(dá)、純化及免疫學(xué)分析 作者：白婧，李亞軍，謝鵬，牟軍【摘要】 目的對(duì)亞洲帶絳蟲(chóng)膜聯(lián)蛋白B2(Annexins B2)進(jìn)行克隆表達(dá)及免疫學(xué)初步研究。方法利用在線生物信息學(xué)工具從亞洲帶絳蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)中篩選出Annexins B2基因，并將該基因克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)中，在大腸埃希菌BL21/DE3中誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定，重組后的蛋白用His-鎳蛋白純化柱純化，純化的重組蛋白用Western blotting進(jìn)行免疫學(xué)分析。結(jié)果PCR、雙酶切及重組質(zhì)粒DNA測(cè)序均顯示重組體構(gòu)建成功，并得到

2、高純度的蛋白，且該重組蛋白可被亞洲帶絳蟲(chóng)、豬帶絳蟲(chóng)及牛帶絳蟲(chóng)患者的血清識(shí)別。結(jié)論亞洲帶絳蟲(chóng)成蟲(chóng)Annexins B2基因可在原核表達(dá)系統(tǒng)中獲得具有免疫活性的高效表達(dá)。 【關(guān)鍵詞】 亞洲帶絳蟲(chóng);膜聯(lián)蛋白B2;基因克隆;免疫反應(yīng)性ABSTRACT: ObjectiveTo clone and express the gene named as Annexins B2 of Taenia saginata asitica so as to analyze the immunogenicity of its recombinant protein.MethodsBy online analysis o

3、f the gene at bioinfomatics websites to identify the gene from the Taenia saginata asiatica full-length cDNA plasmid library, the gene was cloned into prokaryotic expression vector pET-28a(+) and then transformed to E.coli BL21 with IPTG induction. Thereafter, the gene product was analyzed by SDS-PA

4、GE and purified by Ni-NTA affinity chromatography. In addition, the immunoreactivity of the purified recombinant proteins was analyzed by Western blotting.ResultsAs demonstrated by PCR, double enzyme digestion and DNA sequencing indicated that the recombinant plasmid was successfully constructed and

5、 highly expressed. The recombinant protein tested with Western blotting analysis could react with Taenia asiatica and Taeniarhynchus saginatus infected patient serum.ConclusionThe Annexins B2 of Taenia saginata asitica has been cloned and expressed in the prokaryotic expression system and the purifi

6、ed protein has been confirmed with immunogenicity.2 / 13KEY WORDS: Taenia saginata asiatica; Annexins B2; gene cloning; immunoreactivity鑒于亞洲帶絳蟲(chóng)與豬帶絳蟲(chóng)及牛帶絳蟲(chóng)在起源、分類學(xué)地位存在的差異1-2，本課題組率先構(gòu)建亞洲帶絳蟲(chóng)成蟲(chóng)全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒文庫(kù)，并對(duì)該蟲(chóng)進(jìn)行功能基因組的研究工作3。本文利用生物信息學(xué)工具從文庫(kù)中篩選到了一個(gè)膜聯(lián)蛋白B2(Annexins B2)的同源基因，構(gòu)建了原核表達(dá)載體，并對(duì)其原核表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行免疫學(xué)方面的初步研究。1材料與方法1

7、.1材料1.1.1血清、載體與菌株3種人體帶絳蟲(chóng)患者血清取自糞檢陽(yáng)性的帶絳蟲(chóng)患者。原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)及大腸埃希菌BL-21/DE3由中山大學(xué)熱帶病防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。1.1.2主要試劑和工具酶Ex Taq酶(含dNTP)，BamH，Xho，T4 DNA連接酶 (大連寶生物工程公司);異丙硫代-D半乳糖苷(IPTG)(美國(guó)Promega公司);質(zhì)粒純化試劑盒(廣州東盛科技公司);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗豬IgG二抗、兔抗人二抗、3，3二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);氯化鈣、氯化鈉等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?.2方法1.2.1Annexins B2基

8、因的識(shí)別及擴(kuò)增將獲得的亞洲帶絳蟲(chóng)Annexins B2基因進(jìn)行BLASTX分析。并根據(jù)已獲得的該基因全長(zhǎng)編碼序列的開(kāi)放閱讀框，利用軟件設(shè)計(jì)引物(引物由上海聯(lián)合基因公司合成)，分別帶上BamH和Xho的酶切位點(diǎn)進(jìn)行PCR反應(yīng)。1.2.2重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定PCR產(chǎn)物和pET-28a(+)載體分別用BamH和Xho雙酶切，回收、連接后轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL-21/DE3感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)陽(yáng)性克隆依次進(jìn)行質(zhì)粒的提取、雙酶切和PCR鑒定，并進(jìn)行重組質(zhì)粒DNA測(cè)序鑒定(測(cè)序由英俊科技股份有限公司完成)。1.2.3重組蛋白的表達(dá)及純化按照常規(guī)方法進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，考馬斯亮蘭蛋白染色液染色觀察蛋白表達(dá)情況。

9、確定蛋白表達(dá)后，進(jìn)行大量的誘導(dǎo)表達(dá)，并判斷重組蛋白的可溶性，再將樣品加入預(yù)先處理好的Ni-IDA His.Bind樹(shù)脂親和層析純化柱中，最后再用PBS 24h透析以去掉過(guò)柱時(shí)留下的咪唑。1.2.4Western blotting分析重組蛋白的免疫反應(yīng)性用3種人體帶絳蟲(chóng)患者及正常人血清與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗人IgG進(jìn)行Western blotting鑒定。2結(jié)果2.1Annexins B2基因的識(shí)別和序列分析該基因全長(zhǎng)922bp，編碼區(qū)為224686bp。其最大ORF為其完整編碼區(qū)。2.2原核重組質(zhì)粒的鑒定將重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，產(chǎn)物行0.8g/L瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示

10、在500bp左右有一清晰條帶，與目的基因大小基本相符。此外，重組質(zhì)粒的測(cè)序報(bào)告表明插入序列與理論序列一致，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖1)。2.2蛋白表達(dá)及純化結(jié)果將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL/DE3中，超聲裂解后SDS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示在大約25ku處出現(xiàn)高效表達(dá)條帶(圖2)，與目的蛋白基本相符。測(cè)得純化產(chǎn)物的蛋白濃度為0.526g/L。2.3Western blotting鑒定純化蛋白的免疫反應(yīng)性用感染亞洲帶絳蟲(chóng)、豬帶絳蟲(chóng)、感染牛帶絳蟲(chóng)的患者血清以及亞洲帶絳蟲(chóng)感染豬的血清與純化蛋白反應(yīng)的結(jié)果均顯示出較清晰的條帶，而陰性對(duì)照血清在相應(yīng)位置未識(shí)別出該蛋白條帶(圖3)，表明該表

11、達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫反應(yīng)性。圖1重組質(zhì)粒的PCR和雙酶切鑒定Fig.1 The identification of the pET-28a(+)-Ta Annexins B2 by PCR amplification and digestion with restriction enzymesM1：DNA標(biāo)準(zhǔn)(DL2000);1：PCR產(chǎn)物;2：pET-28a(+)質(zhì)粒雙酶切;3：pET-28a(+)-Annexins B2重組質(zhì)粒雙酶切;M2：DNA標(biāo)準(zhǔn)(DL 15000)。圖2100g/L SDS-PAGE分析pET-28a(+)-Ta Annexins B2在大腸埃希菌中的表達(dá)產(chǎn)物及其純

12、化產(chǎn)物Fig.2 100g/L SDS-PAGE analysis of the prokaryotic expression product and purified productM：蛋白Marker;1：pET-28a(+)IPTG未誘導(dǎo);2：pET-28a(+)IPTG誘導(dǎo);3：pET-28a(+)-Annexins B2 IPTG未誘導(dǎo);4：pET-28a(+)-Annexins B2 IPTG誘導(dǎo);5：pET-28a(+)-Annexins B2上清;6：pET-28a(+)-Annexins B2沉淀;7：pET-28a(+)-Annexins B2純化蛋白。3討論帶絳蟲(chóng)病的流行

13、在我國(guó)西部一直是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。每年由帶絳蟲(chóng)病造成的健康和畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)損失上百億，嚴(yán)重影響西部欠發(fā)達(dá)地區(qū)的社會(huì)發(fā)展。目前，亞洲帶絳蟲(chóng)病的防治研究的重點(diǎn)集中在診斷和疫苗候選抗原、藥物靶標(biāo)、致病的分子機(jī)制研究。圖3重組蛋白的Western blotting 鑒定Fig.3 Western blotting analysis of the recombinantsM：蛋白Marker;1：純化蛋白與亞洲帶絳蟲(chóng)患者血清的反應(yīng)結(jié)果;2：純化蛋白與牛帶絳蟲(chóng)患者血清的反應(yīng)結(jié)果;3：純化蛋白與豬帶患者血清的反應(yīng)結(jié)果;4：純化蛋白與亞洲帶絳蟲(chóng)感染豬血清的反應(yīng)結(jié)果;5：純化蛋白與正常人血清的反應(yīng)結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)

14、通過(guò)生物信息學(xué)方法從已經(jīng)構(gòu)建好的亞洲帶絳蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA質(zhì)粒文庫(kù)中篩選出了一個(gè)膜聯(lián)蛋白(Annexins B2)的同源基因，并且預(yù)測(cè)出該基因位于胞漿，無(wú)跨膜區(qū)，二級(jí)結(jié)構(gòu)基本上是以螺旋為主。這些都符合膜聯(lián)蛋白家族的共同特征4。根據(jù)膜聯(lián)蛋白家族分布廣泛，表達(dá)豐富且穩(wěn)定的特性，可以推測(cè)其在絳蟲(chóng)的生理活動(dòng)中可能起著重要的作用。膜聯(lián)蛋白是一個(gè)廣泛存在的蛋白家族，在所有真核基因組中廣泛表達(dá)。具有內(nèi)部重復(fù)單位和“G-X-G-T-(38residues)-D/E”基序5，即Ca2+結(jié)合區(qū)域的特征，用以結(jié)合帶有負(fù)電的脂質(zhì)。雖然它為鈣結(jié)合蛋白，但是在結(jié)構(gòu)上卻沒(méi)有EF手，而且在和Ca2+結(jié)合后，還可以與磷脂再次結(jié)合而

15、發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。例如，細(xì)胞的胞吞胞吐，離子通道的形成，調(diào)節(jié)磷脂酶A2的活性及細(xì)胞內(nèi)外Ca2+濃度、抗炎癥反應(yīng)等。在長(zhǎng)期的生物進(jìn)化過(guò)程中，膜聯(lián)蛋白家族各成員在生物學(xué)特性和生理功能方面表現(xiàn)出非常復(fù)雜的關(guān)系，且在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，annexins沒(méi)有信號(hào)肽，沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)，是一個(gè)典型的細(xì)胞內(nèi)蛋白。但是，卻有學(xué)者發(fā)現(xiàn)它可以與細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生作用。例如，抗炎6、抗凝7、抑制腫瘤8等。最新的研究報(bào)道，當(dāng)將其作為疫苗的候選因子時(shí)，可以消除一些寄生于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的寄生蟲(chóng)。此外，學(xué)者們認(rèn)為膜聯(lián)蛋白是維持細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的重要蛋白。并可能具有激活纖維蛋白酶原的功能，有助于破壞宿主的結(jié)締組織，使蟲(chóng)體抗原更加容

16、易進(jìn)入宿主機(jī)體，誘發(fā)免疫應(yīng)答。因此，對(duì)該基因的研究有助于進(jìn)一步了解它的生物學(xué)功能及開(kāi)辟預(yù)防治療寄生蟲(chóng)病的新途徑9-10。目前，Annexins B2已經(jīng)在豬囊尾蚴的研究被發(fā)現(xiàn)并命名，但是具體的生理功能還不清楚，且在亞洲帶絳蟲(chóng)研究領(lǐng)域還是空白。因此，本研究將亞洲帶絳蟲(chóng)成蟲(chóng)annexins克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，在大腸埃希菌BL-21/DE3中用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)SDS-PAGE電泳進(jìn)行鑒定。SDS-PAGE結(jié)果表明，該蛋白在全菌和沉淀中都有表達(dá)，上清中有微量的表達(dá)，說(shuō)明annexins主要表達(dá)在包涵體中。因此，進(jìn)一步溶解包涵體11，經(jīng)變性處理并親和層析

17、純化后，得到了大量較純的重組蛋白。此外，還嘗試性的用上清過(guò)柱純化并用蔗糖進(jìn)行蛋白濃縮，也得到部分有活性的蛋白。Western blotting就是以抗體-抗原沉淀反應(yīng)為基礎(chǔ)的，可用于不同抗原的比較和定量。其檢測(cè)結(jié)果表明所獲得的重組蛋白與豬帶絳蟲(chóng)、牛帶絳蟲(chóng)及亞洲帶絳蟲(chóng)有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)且在絳蟲(chóng)中的診斷特異性不高，推測(cè)其不能作為免疫診斷抗原的合適候選分子。但是，其具有免疫活性的高效表達(dá)。由此可推測(cè)它是一個(gè)具有開(kāi)發(fā)潛力的基因?？傊卷?xiàng)研究填補(bǔ)了該蛋白在亞洲帶絳蟲(chóng)研究領(lǐng)域的空白，也為進(jìn)一步研究該基因的生物學(xué)功能及在診斷尤其是疫苗研究方面奠定了基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1包懷恩. 我國(guó)亞洲帶絳蟲(chóng)研究的現(xiàn)狀和展

18、望 J. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志, 2002, 2(3):215-219.2張朝云，楊明，張科，等. 云貴州三地牛帶絳蟲(chóng)核糖體tRNA-ITS1序列分析 J.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2006, 31(4):291-295.3黃江，胡旭初，包懷恩，等. 亞洲帶絳蟲(chóng)成蟲(chóng)全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒文庫(kù)的構(gòu)建及EST測(cè)序 J. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 7(2):116-118.4MOSS SE, MORGAN RO. The annexins J. Genome Biol, 2004, 5:219-221.5CHOI SH, KWON SR, LEE EH, et al. Molecular cloning, functional characterization and localization of an annexin from a fish gill fluke microcotyle sebastis (Platyhelminthes: Monogenea) J. Mol &amp