慢性活動性乙型肝炎外周血T細(xì)胞亞群上活化抗原的表達(dá)

1、慢性活動性乙型肝炎外周血T細(xì)胞亞群上活化抗原的表達(dá) 關(guān)鍵詞：慢性;乙型肝炎;T淋巴細(xì)胞;CD69;HLA-DR 摘要:目的探討慢性活動性乙型肝炎（CAHB）患者外周血活化抗原CD69、HLA-DR分子在T細(xì)胞表達(dá)的變化及其意義。方法以31例正常人作為對照，采用免疫熒光三色標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)，檢測30例CAHB患者外周血T細(xì)胞亞群及其CD69、HLA-DR抗原表達(dá);同時用熒光定量PCR檢測患者的病毒DNA載量。結(jié)果CAHB患者外周血CD3+T細(xì)胞的百分率（63.78%±9.70%）與正常對照組比較差異有顯著性（P<0.01），CD4+T細(xì)胞的百分率（45.88%±8

2、.51%）明顯低于正常對照組（P<0.001），CD8+T細(xì)胞的百分率（44.64%±7.10%）明顯高于正常對照組（P<0.001）;CD3+T細(xì)胞CD69的表達(dá)（6.85%±2.83%）與正常人對照組比較差異也有顯著性（P<0.01），其中CD4+T細(xì)胞CD69的表達(dá)（2.31%±0.94%）與正常對照組比較差異無顯著（P>0.05），CD8+T細(xì)胞表達(dá)CD69水平（3.87%±1.81%）明顯高于對照組（P<0.01）;CD3+T細(xì)胞上HLA-DR的表達(dá)（17.09%±

3、4.23%）與正常對照組之間差異有顯著性（P<0.001），其中CD4+T細(xì)胞中HLA-DR+細(xì)胞（7.97%±2.43%）和CD8+T細(xì)胞中HLA-DR+細(xì)胞（5.52%±1.48%）均比正常對照組顯著增高（P<0.01）（P<0.001）;CD8+CD69+、CD8+HLA-DR+細(xì)胞的數(shù)量與病毒DNA載量之間呈正相關(guān)。結(jié)論CAHB患者存在細(xì)胞免疫功能紊亂和淋巴細(xì)胞異常激活現(xiàn)象，T淋巴細(xì)胞的激活以CD8+T細(xì)胞為主，其在抗病毒感染中起著重要作用。 2 / 21 關(guān)鍵詞:慢性;乙型肝炎;T淋巴細(xì)胞;CD69;HLA-DR Thee

4、xpressionofactivatedantigensinperipheralbloodTlymphocytesubsetsinpatientswithchronicactivehepatitisB. Abstract:ObjectiveToinvestigatetheexpressionofspecialmarkerforactivationofperipheralbloodTlymphocytesinpatientswithchronichepatitisBvirusanditssignificance.MethodsImmunofluorescentthree-colorflowcyt

5、ometrywasusedtostudytheexpressionofCD69andHLA-DRonTlymphocytesin30patientswithchronicactivehepatitisBvirusand31normalcontrols.TheviralloadwasdeterminedbyfluorescencequantitativePCR.ResultsExpressionofCD3+Tcellsweresignificantlylowerinpa-tients（63.78%±9.70%）thanthatincontrols（P<0.01），mean

6、whiletheexpressionofCD4+Tcellswas45.88%±8.51%，significantlylowerthanthatofthecontrols（P<0.001）andtheexpressionofCD8+Tcellwas44.64%±7.10%，significantlyhigherthanthatofthecontrols（P<0.001）.DetectionofCD69onCD3+Tcellsinpatientswas6.85%±2.83%，significantlyhigherthanthatofthe

7、controls（P<0.01）.NOsignificantdifferenceintheexpressionofCD69onCD4+Tcellswasobservedbe-tweenpatientsandthecontrols（P>0.05），andtheexpressionofCD69onCD8+Tcellswas3.87%±1.81%，significantlydif-ferentfromthatofthecontrols（P<0.01）.TheexpressionofHLA-DRonCD3+Tcellsweresignificance

8、differencebetweenpa-tients（17.09%±4.23%）andthatincontrols（P<0.001）.ThepercentagesofCD4+TcellsexpressingHLA-DRinpatientswas7.97%±2.43%，significantlyhigherthanthatofthecontrols（P<0.01）.SignificantdifferencewasobservedintheexpressionofHLA-DRonCD8+Tcellsinpatients（5.52%±1.48

9、%）ascomparedwithcontrols（P<0.001）.TherewerepositivecorrelationsbetweenpercentagesofCD8+CD69+，CD8+HLA-DR+cellsandviralload.ConclusionThefindingssupportthatcellularimmunodeficiencyexistsinpatientsandthatTlymphocyteswereabnormallyactivatedinthepatients.TheactivationofperipheralbloodTlymphocytesi

10、npatientsmainlyinvolvesCD8+subsetanditmayplayanimportantroleintheimmuneresponsetoantiviralinfection. Keywords:Chronic，HepatitisB;T-lymphocytes;CD69;HLA-DR 乙型肝炎病毒（HBV）是一種嗜肝DNA病毒，主要侵犯肝臟并在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，但對肝細(xì)胞無明顯殺傷作用，當(dāng)機體針對HBV產(chǎn)生免疫反應(yīng)時，才會引起肝臟病變。細(xì)胞免疫在乙型肝炎發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，機體細(xì)胞免疫狀態(tài)的不同會導(dǎo)致不同的臨床結(jié)果出現(xiàn)1。此外，Rehermann2研究發(fā)現(xiàn)HBV

11、病毒感染可使機體免疫細(xì)胞異常激活和功能紊亂。T細(xì)胞是細(xì)胞免疫功能的主要執(zhí)行者，包括CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，目前國內(nèi)外有關(guān)T細(xì)胞亞群活化抗原的研究在乙型肝炎發(fā)病中的報道較少。為了探討T細(xì)胞及其亞群的激活在CAHB發(fā)病機制中的作用，現(xiàn)采用免疫熒光三色標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測30例CAHB患者外周血早期活化抗原CD69和晚期活化抗原HLA-DR在T細(xì)胞上表達(dá)的變化，并分析其意義。 1材料和方法 1.1材料 1.1.1研究對象依據(jù)2000年中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲病學(xué)會、肝病學(xué)分會聯(lián)合修訂的病毒性肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)3確診的30例患者，其中男23例，女7例，平均年齡34.8歲（2058歲），所有患者的HB

12、V血清標(biāo)志物（HBsAg、HbeAg、抗HBc）均呈陽性，血清HBVDNA定量>1×108拷貝/L，丙氨酸轉(zhuǎn)移酶（ALT）異常>正常3倍以上，檢測前1月未使用過糖皮質(zhì)激素類藥物或其他影響免疫功能的藥物治療;正常人31例，其中男21例，女10例;平均年齡33.6歲（1956歲），均排除有慢性傳染性疾病或感染性疾病，HBsAg陰性及丙氨酸轉(zhuǎn)移酶正常。 1.1.2試劑及儀器三色熒光標(biāo)記單克隆抗體CD8FITC/CD69PE/CD3PerCP，CD4FITC/CD69PE/CD3PerCP和陰性同型對照1FITC/1PE/CD3PerCP以及CD3PerCP，紅細(xì)

13、胞裂解液為BDFACSTMLysingsolution以上產(chǎn)品均購自美國BectonDickinson公司，HLA-DR-FITC、CD4-PCY5、CD8-PCY5單抗和同型對照IgG2b為法國Immunotech公司產(chǎn)品。FACSCalibur流式細(xì)胞儀為美國BD公司生產(chǎn)。HBV核酸擴增熒光定量PCR試劑盒為深圳匹基生物工程股份有限公司產(chǎn)品，PCR儀為Roche公司的lightcycler熒光定量核酸檢測儀。 1.2方法 1.2.1標(biāo)本收集取患者及正常人靜脈血5ml，分兩管，一管用肝素抗凝，用于流式細(xì)胞檢測，另一管不加抗凝劑，分離血清后用于肝功能和HBV-DNA病毒載量測定。 1.2.2流

14、式細(xì)胞術(shù)檢測外周血T淋巴細(xì)胞及其活化抗原肝素抗凝血分裝6管，每管加100l全血，再分別加入10l上述三種三色熒光標(biāo)記單抗試劑以及CD4-PCY5、CD8-PCY5、CD3PerCP和HLA-DRFITC單抗及同型對照IgG2b，4避光孵育20min，加紅細(xì)胞溶解液2ml混勻，室溫放置5min，離心棄上清，用PBS洗滌2次，將細(xì)胞重懸于1%多聚甲醛固定液500l中，用FACSCalibur流式細(xì)胞儀CellQuest軟件獲取收集30000個細(xì)胞/管，用前向散射角（FCS）及側(cè)向散射角（SSC）確定淋巴細(xì)胞群再以PerCP標(biāo)記CD3+的細(xì)胞射門并分析數(shù)據(jù)，以熒光抗體染色陽性細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的百

15、分率記錄結(jié)果。 1.2.3病毒DNA載量檢測采用熒光實時定量PCR法，嚴(yán)格按操作說明書要求進(jìn)行檢測，將結(jié)果換算成對數(shù)值備用。 1.3統(tǒng)計學(xué)分析所有資料采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，各組間比較取均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）進(jìn)行t檢驗，各參數(shù)與病毒載量的相關(guān)性用Spearman相關(guān)分析。 2結(jié)果 2.1CAHB患者外周血T細(xì)胞亞群的分析患者外周血CD3+T細(xì)胞水平與正常對照組相比明顯降低（P<0.01）;患者外周血CD3+CD4+T細(xì)胞水平顯著低于正常對照組（P<0.001）;患者外周血CD3+CD8+T細(xì)胞水平顯著高于正常對照組（P<0.00

16、1）。CD4+T、CD8+T的百分率與病毒DNA載量之間無相關(guān)性。結(jié)果見表1。 表1CAHB患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的檢測（略） Tab1ExpressionofTlymphocytesubsetsonperipheralbloodinpatients 注:與對照組相比，P<0.01;P<0.001。 Note:Comparedwithnormalcontrolgroup，P<0.01;P<0.001。 2.2 CAHB患者T細(xì)胞上CD69表達(dá) 患者外周血CD3 + T細(xì)胞CD69的表達(dá)水平與正常人對照組比較差異有顯著性（P&lt

17、;0.01），其中CD4 + T細(xì)胞CD69的表達(dá)水平與正常人對照組比較差異無顯著性（P>0.05），CD8 + T細(xì)胞CD69的表達(dá)水平明顯高于對照組（P<0.01）;相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，CD8 + CD69 + T細(xì)胞的表達(dá)水平與病毒DNA載量之間正相關(guān)（r=0.413，P<0.05），CD4 + CD69 + T細(xì)胞的表達(dá)水平與病毒DNA載量之間無相關(guān)性（r=0.095，P>0.05）。結(jié)果見表2、圖1。 表2 CAHB患者外周血T細(xì)胞上CD69表達(dá)（略）Tab2 Expression of CD69 + on peripheral bl

18、ood lymphocytes in patients注:與對照組相比，*P<0.01。 Note:Compared with normal control group，*P<0.01。圖1 CD8 + CD69 + T細(xì)胞表達(dá)與病毒DNA載量相關(guān)性分析（略） Fig1 Analysis of correlations between the viral load and CD8 + CD69 + cells 2.3 CAHB患者T細(xì)胞上HLA-DR + 表達(dá) CD3 + T細(xì)胞中HLA-DR + 細(xì)胞與正常人對照組之間差異有顯著性（P<0.001），

19、其中CD4 + T細(xì)胞HLA-DR + 的表達(dá)與正常人對照組之間差異有顯著性（P<0.01），CD8 + T細(xì)胞中HLA-DR + 細(xì)胞比對照組顯著增高（P<0.001）;相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)CD8 + HLA-DR + 細(xì)胞的數(shù)量與病毒DNA載量之間正相關(guān)（r=0.536，P<0.01）CD4 + HLA-DR + 細(xì)胞的數(shù)量與病毒DNA載量之間無相關(guān)性（r=0.084，P>0.05）。結(jié)果見表3、圖2。 表3 CAHB患者外周血T細(xì)胞上HLA-DR + 的表達(dá)（略）Tab3 Expression of HLA-DR + on peripher

20、al blood lymphocytes in patients注:與對照組相比，P<0.01;P<0.001。 Note:Compared with normal control group，P<0.01;P<0.001。圖2 CD8 + HLA-DR + T細(xì)胞表達(dá)與病毒DNA載量相關(guān)性分析（略）Fig2 Analysis of correlations between the viral load and CD8 + HLA-DR + T cells 3 討論 人類正常的免疫過程有賴于免疫細(xì)胞，在各類病毒性肝炎中，T細(xì)胞在乙型肝炎病

21、變過程中的作用最為明顯，T細(xì)胞功能具有雙重性，在清除病毒和控制病毒擴散的同時，也與病情的加重有關(guān)。Sing 1 研究表明，各種乙型肝炎患者均存在不同程度的細(xì)胞免疫功能紊亂，其中T細(xì)胞亞群變化明顯的是慢性活動性乙肝，表現(xiàn)為外周血CD4 + T細(xì)胞數(shù)量降低，CD8 + T數(shù)量增高，與本文檢測的檢測結(jié)果一致，說明慢性肝炎活動期隨著肝臟病變加重，細(xì)胞免疫損傷嚴(yán)重，成熟T細(xì)胞遭到破壞，造成CD4 + T細(xì)胞數(shù)量減少，而CD8 + T細(xì)胞作為主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的增加與病毒的清除有關(guān)，CD8 + T細(xì)胞在清除病毒的同時也造成肝細(xì)胞大量破壞，引起臨床上血清ALT持續(xù)升高，患者癥狀加重。 CD69抗原又稱早

22、期激活抗原（EA-1），活化誘導(dǎo)分子（AIM），是表達(dá)于絲裂原或抗原刺激的各種激活T、B、NK細(xì)胞的最早期標(biāo)志之一。在正常情況下外周血循環(huán)中極少有表達(dá)CD69的T細(xì)胞，但在特異性抗原或促有絲分裂原刺激下12h細(xì)胞表面CD69的表達(dá)即可測出并迅速達(dá)到高峰，表達(dá)可持續(xù)72h。CD69的功能是上調(diào)白介素2受體的p55鏈，產(chǎn)生Th1樣細(xì)胞因子，引發(fā)淋巴細(xì)胞增殖，起信號傳遞功能 4 。Goncalves 5 通過對HBV疫苗的研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞CD69表達(dá)與HBV感染關(guān)系密切，認(rèn)為T細(xì)胞CD69表達(dá)的降低是機體對HBV無反應(yīng)的結(jié)果。以流式細(xì)胞儀分析30例CAHB患者外周血T淋巴細(xì)胞CD69抗原的表達(dá)，結(jié)果顯

23、示機體受到HBV感染后，特異性抗原的刺激使患者免疫系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)性改變，T細(xì) 胞CD69表達(dá)增高。通過對患者T細(xì)胞亞群的研究發(fā)現(xiàn)，患者的CD8 + 殺傷性T細(xì)胞對HBV病毒的反應(yīng)一直處于高水平激活狀態(tài)，CD4 + 輔助性T細(xì)胞早期活化抗原處于低水平激活狀態(tài)，機體通過活化及產(chǎn)生的特異性抗病毒的細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL），從而達(dá)到清除病原體的目的。 人類主要組織相容性復(fù)合物（MHC）是人體細(xì)胞重要的表面抗原，而HLA-DR是MHC-類分子的主要抗原之一。正常情況下，它僅分布于B細(xì)胞、活化的T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和精子等，是免疫反應(yīng)中重要的參與者，HLA-DR在免疫應(yīng)答中的主要作用是與T細(xì)胞表面的

24、CD4 + 分子和/或抗原結(jié)合，促進(jìn)抗原傳遞，在抗原提呈中起著第一信號作用 6 ，HLA-DR在靜息的T細(xì)胞上表達(dá)很弱，T細(xì)胞激活時，其表達(dá)顯著升高。與CD69抗原不同，HLA-DR激活標(biāo)志在T細(xì)胞激活晚期表達(dá)且表達(dá)時間最長。實驗發(fā)現(xiàn)患者組CD3 + 細(xì)胞HLA-DR表達(dá)增高，與蔡莉靜結(jié)果一致 7 ，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HLA-DR在CD4 + 、CD8 + T細(xì)胞中均顯著增高，提示機體的免疫系統(tǒng)對病毒感染一直處于較高的應(yīng)答狀態(tài)，通過HLA-DR表達(dá)的增高，一方面調(diào)節(jié)機體免疫失調(diào)的狀況，另一方面可能與乙肝的自身免疫反應(yīng)有關(guān) 8 。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)CD8 + CD69 + T、CD8 + HLA-DR +

25、 T細(xì)胞的數(shù)量與病毒DNA載量呈正相關(guān)，可能是由于大量病毒抗原刺激機體免疫系統(tǒng)，機體試圖通過異常激活CTL，使CTL活性增強發(fā)揮其殺傷功能，從而有助于病毒的清除。 觀察T淋巴細(xì)胞表面分子及其不同亞群活化抗原的表達(dá)能較全面直觀地了解機體的免疫狀態(tài)。本文應(yīng)用熒光三色流式細(xì)胞術(shù)通過對CAHB患者外周血T細(xì)胞及其活化抗原表達(dá)的檢測，發(fā)現(xiàn)患者存在細(xì)胞免疫功能異常現(xiàn)象，尤其是CD8 + T細(xì)胞及其活化抗原的表達(dá)的增高表明它們在抗病毒感染過程中起重要作用，有關(guān)CD8 + T細(xì)胞活化抗原的表達(dá)能否反映病情及指導(dǎo)治療有待臨床進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn): 1Sing g，Butter-Worth L，Chen X.Composition of peripheral blood lympho-cyte populations during different stages of chronic infection with hepatitis B virusJ.J Viral Hepat，1998，5:8386. 2Rehermann B，F(xiàn)errari C，Pasquinelli C，et al.The hepatitis B virus persists for decades after patients，recovery from acute viral hepati