畢赤酵母常用培養(yǎng)基與載體(共5頁)

1、畢赤酵母常用培養(yǎng)基與載體一、畢赤酵母表達(dá)常用載體： 典型的巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體載體包含醇氧化酶1（AOX1）基因的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子（5'AOX1和3'AOX1），它們被多克隆位點(diǎn)（MCS）分開，外源基因可以在此插入。此載體還包含組氨醇脫氫酶基因（HIS4）選擇標(biāo)記及3'AOX1區(qū)。當(dāng)整合型載體轉(zhuǎn)化受體時，它的5'AOX1和3'AOX1能與染色體上的同源基因重組，從而使整個載體連同外源基因插入到受體染色體上，外源基因在5'AOX1啟動子控制下表達(dá)。畢赤酵母本身不分泌內(nèi)源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引導(dǎo)分泌的信號序列。而由89個氨基酸組成的釀酒

2、酵母的分泌信號交配因子(-factor)引導(dǎo)序列已經(jīng)成功地引導(dǎo)了幾種外源蛋白的分泌。分泌表達(dá)載體主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZ A，pYAM75P等。胞內(nèi)表達(dá)載體主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ， pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。畢赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71兩種，都具有HIS4營養(yǎng)缺陷標(biāo)記。其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位點(diǎn)

3、彼ARG4基因插入，表型為Muts，即甲醇利用緩慢型，兩種菌株都適用于一般的酵母轉(zhuǎn)化方法。多拷貝表達(dá)菌株的獲得方式： 與自主復(fù)制的質(zhì)粒型表達(dá)載體不同，整合型表達(dá)載體的拷貝數(shù)可以有很大的變化。含多拷貝外源基因的表達(dá)菌株合成蛋白的量也較多。體內(nèi)整合可通過高遺傳霉素抗性，篩選可能的多拷貝插入；而體外整合可通過連接產(chǎn)生外源基因的串聯(lián)插入。多拷貝表達(dá)菌株的獲得方式有兩種：一種是利用SDS-PAGE電泳、免疫雜交或菌落點(diǎn)雜交方法在大量的轉(zhuǎn)化子中進(jìn)行自然篩選。得到產(chǎn)量高的表達(dá)菌株。另一種在轉(zhuǎn)化前將多個表達(dá)盒拷貝插入到單個載體中，而后再通過交換整合到受體染色體上。表達(dá)蛋白純化方法： 酵母系統(tǒng)表達(dá)的蛋白一般都具

4、有活性，所以都采用較溫和的純化方式來純化目的蛋白，分泌型表達(dá)的蛋白有利于純化，可用硫酸銨沉淀，然后用離子交換，凝膠過濾層析，疏水層析等方法進(jìn)一步純化。具體的方法和操作應(yīng)按所處理的目的蛋白的性質(zhì)選擇。二畢赤酵母表達(dá)的培養(yǎng)基配制和用途2.1 LB（LuriaBertani）培養(yǎng)基： Trypton l Yeast Extract 0.5 NaCl l PH 7.0制作平板時加入 2瓊脂粉。121高壓滅菌 20min?？捎谑覝乇４妗Ｓ糜谂囵B(yǎng)pPICZA原核宿主菌TOP10F時可加入Zeocin 25ug / ml。2.2 LLB（Low Salt LB）培養(yǎng)基： Trypton l Yeast Ex

5、tract 0.5 NaCl 0.5 PH 7.0制作平板時加入 2瓊脂粉。121高壓滅菌 20min?？捎谑覝乇４鏀?shù)月。用于培養(yǎng)pPICZA原核宿主菌TOP10F時，加入Zeocin 25ug / ml，可以4條件下保存12周.2.3 YPD （又稱YEPD）Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培養(yǎng)基） Trypton 2%dextrose (glucose) 2%+agar 2%+Zeocin 100 µg/ml液體YPD培養(yǎng)基可常

6、溫保存,是畢赤酵母的最基本培養(yǎng)基，瓊脂YPD平板在4可保存幾個月。加入Zeocin 100ug / ml，成為YPDZ培養(yǎng)基，可以4條件下保存12周。2.4 BMGY培養(yǎng)基Yeast extract 1%Peptone 2%磷酸鉀緩沖液（pH6.0）100mmol/LYNB 1.34%Biotin （4×10 -5 ）%Glycerol 1%畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)前培養(yǎng)基，YNB和Biotin過濾除菌。培養(yǎng)24小時后，一般靜置過夜，待酵母沉淀后倒掉BMGY培養(yǎng)基，改換BMMY培養(yǎng)基，進(jìn)入誘導(dǎo)表達(dá)階段。2.5 BMMY培養(yǎng)基Yeast extract 1%Peptone 2%磷酸鉀緩沖液（p

7、H6.0）100mmol/LYNB 1.34%Biotin （4×10 -5 ）%methanol 3%畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基，YNB和Biotion過濾除菌。搖瓶培養(yǎng)時每24小時之后加入3%的甲醇誘導(dǎo)，一般誘導(dǎo)72小時。2.6 YPDS + Zeocin 培養(yǎng)基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）：yeast extract 1%peptone 2%dextrose (glucose) 2%sorbitol 1 M+agar 2%+ Zeocin 100 µg/ml不管是液體YPDS培養(yǎng)基，還是YPDS + Zeocin 培養(yǎng)基，

8、都必須存放4條件下，有效期12周。2.7 MGY Minimal Glycerol Medium （最小甘油培養(yǎng)基）（34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。將800ml滅菌水、100ml的10*YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混勻即可，4保存，保存期為2個月。2.8 MGYHMinimal Glycerol Medium + Histidine （最小甘油培養(yǎng)基 + 0.004%組氨酸）在1000ml的MGY培養(yǎng)基中加入10ml的100*H母液混勻，4保存，保存期為2個月。2.9 RDRegeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生

9、培養(yǎng)基）（含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0.005%氨基酸）1. 將186g的山梨醇定容至700ml，高壓滅菌；2. 冷卻后于45水浴；3. 將100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液和88ml無菌水混勻，預(yù)熱至45后，與步驟2的山梨醇溶液混合。4保存。2.10 RDHRegeneration Dextrose Medium + Histidine （葡萄糖再生培養(yǎng)基 + 0.004%組氨酸）在RD培養(yǎng)基配制的第三步中，在加入10ml的100*H母液，同時無菌水的體積減少至78ml即可，其

10、余配制方法與RD相同。4保存。2.11 RD及RDH平板的制備1. 將186g的山梨醇和1520g瓊脂粉定容至700ml，高壓滅菌；冷卻后于60水?。?. 參照RD/RDH液體培養(yǎng)基配制的步驟4，將100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml無菌水混勻，預(yù)熱至45后，與步驟1的山梨醇/瓊脂液混勻；3. 迅速制備平板。4可保存數(shù)月。2.12 RD及RDH 的TOP 瓊脂的制備（常用于酵母菌的包被）1.將186g的山梨醇和7.510g瓊脂粉定容至700ml，高壓滅菌；冷卻后于60水??；2.參照RD/

11、RDH液體培養(yǎng)基配制的步驟4，將100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml無菌水混勻，預(yù)熱至45后，與步驟1的山梨醇/瓊脂液混勻；3.將該TOP瓊脂置于45水浴冷卻、保溫，備用。2.13 MD與MDHMinimal Dextrose Medium +（Histidine） 最小葡萄糖培養(yǎng)基 +（ 0.004 %組氨酸）（含有：1.34%YNB；4*10-5% 生物素；2%葡萄糖）1. 100ml的10*YNB；2ml的500*B和100ml10*D母液，用800ml的無菌水定容至1000ml即

12、可；2. 如配制MDH，可在上述的MD中加入10ml的100*H即可；3. 如配制平板，可無菌水的滅菌前，加入1520g的瓊脂。4可保存數(shù)月。2.14 SOC培養(yǎng)基： Trypton l Yeast Extract 0.5 NaCl 0.05 Glucose (1mol / L) 2%121高壓滅菌 20min，冷卻后，4保存。母液的配置注：10*YNB （含有硫酸銨、無氨基酸的13.4%酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基） 4保存。34g酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基（無硫酸銨）+100g硫酸銨，溶于1000ml水中，過濾除菌。500*B （0.02%生物素 Biotin） 4保存 保存期為1年。20mg的生物素溶于100ml水中，過濾除菌。100*H （0.4%Histidine 組氨酸） 4保存 保存期為1年。400mg的L-組氨酸溶于100ml水中，（加熱至50以促進(jìn)溶解），過濾除菌。10*D （20%Dextrose 葡萄糖） 保存期為1年。200g葡萄糖溶于1000ml水中，滅菌15min或過濾除菌。 10*M （5%Methanol 甲醇） 保存期為2個月。將5ml的甲醇與95ml水混勻，過濾除菌。10*GY （10%Glycerol 甘油） 保存期為1年以上。將100ml甘油和900ml水混勻后，高壓滅菌或過濾除菌。100*AA （0.5% of ea