地高辛標(biāo)記系統(tǒng)

1、探針的標(biāo)記地高辛標(biāo)記系統(tǒng)常用標(biāo)記物分類n放射性同位素標(biāo)記n非放射性標(biāo)記熒光素標(biāo)記生物素標(biāo)記地高辛標(biāo)記n地高辛（dig）是靈敏度高、非放射性核酸標(biāo)記檢測體系。dig檢測靈敏度接近同位素而無放射性危險、相比熒光則不需要特殊檢測設(shè)備，相比生物素則沒有樣本內(nèi)源干擾之苦，很適合用于核酸非放標(biāo)記檢測。 地高辛標(biāo)記的dutp地高辛標(biāo)記系統(tǒng)的特點n標(biāo)記和檢測技術(shù)安全n標(biāo)記的探針穩(wěn)定可以保存一年n雜交液可以反復(fù)使用數(shù)次與放射性同位素標(biāo)記方法相同之處n標(biāo)記和雜交技術(shù)相似n高靈敏度n低背景n可以標(biāo)記dna、rna 或oligonucleotides與放射性同位素標(biāo)記方法不同之處n無害,安全n產(chǎn)生的廢物不需特殊處理n

2、需要分析的時間短n探針穩(wěn)定地高辛標(biāo)記與檢測的原理n利用不同的方法將digoxigenin-11-dutp摻入到新合成的探針dna 或rna鏈中或寡核苷酸的末端n探針與目標(biāo)dna雜交后，用連接有堿性磷酸酶或其它偶聯(lián)物的地高辛的抗體檢測地高辛標(biāo)記的探針n根據(jù)地高辛抗體連接的偶合物不同，利用熒光檢測（anti-dig-fluorescein，rhodamine)、化學(xué)發(fā)光檢測(anti-dig-ap and cspd or cpd-star)或顯色（anti-dig-ap and nbt/bcip or other substrates)的方法將探針雜交的位置顯現(xiàn)出來n利用隨機引物標(biāo)記的方法將 di

3、goxigenin-11-dutp摻入到新合成的dna 鏈中。n反應(yīng)體系中包含六堿基隨機引物、dntp(含有堿性條件下不穩(wěn)定的digoxigenin-11-dutp，klenow 酶及反應(yīng)所需的buffer隨機引物標(biāo)記ndig-dutp:dttp的理想比例1：3n20-25bp 可插入一個dig-dutpn隨機引物法標(biāo)記的探針是基于模板的不同區(qū)段、不同長度的dna 片段n可以探測0.03-0.1pgdnadna的地高辛標(biāo)記和檢測步驟n探針dna 的標(biāo)記及標(biāo)記效率測定ndna的轉(zhuǎn)移和固定n雜交n免疫測定n洗去膜上探針再次雜交操作基本要求n工作環(huán)境及試劑要干凈：（1）試劑要高壓滅菌；（2）含有sd

4、s 的試劑要過濾滅菌；（3）tween20應(yīng)加到預(yù)先滅菌過的試劑中n用具要干凈：用之前一定要清洗得非常干凈n操作尼龍膜時要小心（1）戴無塵手套；（2）用干凈的鑷子夾取膜的邊緣探針模板dna的要求n質(zhì)粒dna純度要高。最好用高純度的質(zhì)粒dna 分離和純化試劑盒純化質(zhì)粒模板或用苯酚/氯仿抽提去除殘留的蛋白質(zhì)。純化后的模板用h2o 溶解n用作探針模板的dna應(yīng)是線型的，大于100bp，如果模板dna 5kb則應(yīng)用4堿基的限制性內(nèi)切酶切割成較小片段（切割后要純化）n模板的量：10ng-3g，如果要檢測復(fù)雜基因組中的單拷貝基因，標(biāo)記模板的最低量要300ng（探針濃度：25ng/ml雜交液）n如果做基因組

5、dna southern blotting, 應(yīng)將克隆倒載體上的dna 酶切后瓊脂糖電泳分離或pcr擴增，得到的片段都需要用試劑盒純化標(biāo)記步驟(20l)n將10ng-1g 模板dna用無菌去離子水補足至16 l。n沸水浴或干浴98 c 10分鐘，使dna變性成單鏈并迅速冰浴冷卻。n充分混勻dig-high primer （1#管），并取4 l至變性dna管，混勻并離心。n37 c溫育1小時或過夜（最大到不超過20小時）。n停止反應(yīng)，加2 l 0.2m edta（ph 8.0）或65 c加熱10分鐘。本次實驗標(biāo)記步驟(10l)n將300ng 模板dna用無菌去離子水補足至8 l。n沸水浴或干浴9

6、8 c 10分鐘，使dna變性成單鏈并迅速冰浴冷卻。n充分混勻dig-high primer （1#管），并取2 l至變性dna管，混勻并離心。n37 c溫育1小時或過夜（最大到不超過20小時）。n停止反應(yīng)，65 c加熱10分鐘。探針標(biāo)記效率檢測n目的是確定雜交中使用正確的探針量，探針用量太多會引起背景太深，用量太少則無雜交或雜交很弱（探針濃度：25ng/ml雜交液）檢測流程n將地高辛標(biāo)記好的探針系列稀釋，點到一條尼龍膜上，同時用地高辛標(biāo)記的control dna作對照標(biāo)準(zhǔn)，120c固定30分鐘；n用地高辛抗體免疫檢測，按bnt/bcip顯色步驟顯色；n比較顯色結(jié)果，選擇帶有可以接受的背景的最

7、高探針濃度做正式的雜交。試劑準(zhǔn)備（1）nwashing buffer: 0.1m maleic acid, 0.15m nacl; ph 7.5(20); 0.3%(v/v) tween20. 15-25 stable. removal of unbound antibody.nmaleic acid buffer: 0.1m maleic acid, 0.15m nacl; adjust with naoh(solid) to ph 7.5(20)0 15-25 stable. dilution of blocking solution.ndetection buffer: 0.1m tri

8、s-hcl, 0.1m nacl, ph 9.5(20). 15-25 stable. ajustment of ph to 9.5. nte buffer: 10mm tris-hcl, 1mm edta, ph 8.0. 15-25 stable. stopping color reaction.試劑準(zhǔn)備（2）nblocking solution :用maleic acid buffer 10稀釋試劑6#（10blocking solution ），成1的工作液，即每9ml maleic acid buffer中加入1ml 10blocking solution 混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。封閉膜上非

9、特異性結(jié)合位點nantibody solution(ab) solution : 將4#試劑離心，按1：5000或1：10000加入blocking solution，2-8 c可放12小時。（每10ml blocking solution 加1ul ab抗體即可）.與地高辛標(biāo)記的探針結(jié)合。ncolor-substrate solution（顯色液）：從試劑5#(nbt/bcip)中取100ul到5ml detection buffer，要避光，現(xiàn)配現(xiàn)用。顯示抗體結(jié)合的位點dig-high prime dna標(biāo)記及檢測試劑盒理想條件下標(biāo)記產(chǎn)量template dna1 h20 h10 ng45

10、 ng600 ng30 ng130 ng1050 ng100 ng270 ng1500 ng300 ng450 ng2000 ng1000 ng 850 ng2300 ng3000 ng1350 ng2650 ng探針定量n根據(jù)上表探針標(biāo)記的理想產(chǎn)量將標(biāo)記的探針稀釋到1ng/l. 例如：起始模板用1g，20l體系1h 后，查前表可知其理想標(biāo)記量是850ng，則探針的理想標(biāo)記濃度為850ng/20 l =42.5ng/l; 則取1l標(biāo)記產(chǎn)物+41.5l h2o 混勻后即得到1ng/l探針稀釋液. n將試劑盒提供的control dna稀釋到1ng/l (原始濃度是5ng /l)tube from

11、 tube#dna (l)dna dilution buffer(l)dilution final concentration1diluted orginal1ng/l2121981:10010 pg/l3215351:3.33 pg/l425451:101 pg/l535451:100.3 pg/l645451:100.1 pg/l755451:100.03 pg/l865451:100.01 pg/l9-050-0步驟n將上述稀釋的2-9 號管的control dna 及探針dna各取1l點膜n120c固定30分鐘或紫外交鏈n將膜放入裝有20ml maleic acid buffer 的塑

12、料器皿中，室溫2分鐘n將膜放入10ml blocking solution中室溫溫育30分鐘n將膜放入10ml antibody solution 中室溫溫育30分鐘n用10ml washing buffer 洗2次，每次15分鐘n在10ml detection buffer 平衡2-5分鐘n將膜放入2ml 新配制的color substrate solution 中暗室條件下顯色。顯色過程中不要搖動。n當(dāng)斑點或帶顯示出來后，用50ml滅菌的雙蒸水洗膜5分鐘，照相定量結(jié)果分析染色至0.1pg的control dna出現(xiàn)斑點，比較標(biāo)記的探針與control dna 染色情況計算出地高辛標(biāo)記的dn

13、a 的量。u如果0.1pg的探針及對照稀釋點都顯色，則探針標(biāo)記理想u如果0.1pg的對照顯色， 0.1pg的標(biāo)記探針沒顯色，但0.3pg顯色，則計算探針濃度（約為理想濃度的1/3）以確定雜交時加多少探針（25ng探針/ml雜交液）u如果0.1pg的對照顯色，但標(biāo)記探針0.3pg的斑點沒顯色，則應(yīng)重新標(biāo)記探針探針標(biāo)記效率低的原因及解決辦法1. 標(biāo)記條件不合適u重新標(biāo)記，但將標(biāo)記時間延長至過夜u用相同量的模板標(biāo)記，但體系放大，體系中的其它成分相應(yīng)放大u模板放在沸水中變性2. 模板不純只用高純度模板用推薦的試劑盒準(zhǔn)備模板純化模板：用苯酚/氯仿抽提后用酒精沉淀dna 的轉(zhuǎn)移和固定n固定：2 的ssc短

14、暫洗滌膜后 120c 30 min 或80c 2h；或者將膜放在用10 的ssc 浸濕的濾紙中uv-crosslinkeringn不馬上使用的尼龍膜放在2-8 c干燥保存預(yù)雜交注意事項n預(yù)雜交的目的是用非特異性dna分子（鮭精dna）及其它高分子化合物（封閉劑）將待雜交膜中的非特異性位點封閉，從而減少雜交背景。n預(yù)雜交及雜交時保證buffer覆蓋膜n如果尼龍膜要多次探測，務(wù)必保證在任何時候都不要讓尼龍膜干燥雜交液組成雜交液組成5ssc (nacl，檸檬酸鈉，檸檬酸鈉)50mm pb (nah2po4，na2hpo4)5denhardt (多聚蔗糖，聚乙烯比咯烷酮，多聚蔗糖，聚乙烯比咯烷酮，bs

15、a)2.5mmedta （有（有/無）無）100ug/ml ss dna (鮭精鮭精dna)0.1%sds10%硫酸葡聚糖（硫酸葡聚糖（dextran sulfate）雜交液的準(zhǔn)備和雜交溫度的計算ndig easy hyb：將64ml 無菌去離子水分兩部分倒入試劑7#瓶（dig easy hyb granules)，37 c搖動溶解5分鐘n計算雜交溫度：通常為37 c -42 cntm=49.82+0.41(%g+c)- (600/i)(i=length of hybrid in base pairs)。ntopt.=tm-20 to 25 c雜交n預(yù)熱一定體積的dig easy hyb（10

16、ml/100cm2膜）至雜交溫度37-42 c 。n預(yù)雜交30分鐘。在不加探針的情況下，僅將膜放在雜交液中42 c下充分潤濕。（此過程可以延長至數(shù)小時）n變性：dig標(biāo)記的探針（約25ng/ml）加50l h2o置沸水浴或98 c干浴鍋中5分鐘后迅速放在冰上冷卻。（不能用堿變性?。﹏將變性的探針加入預(yù)熱的dig easy hyb（3.5ml/100cm2）中，混勻，避免泡沫。n倒出預(yù)雜交液，加入探針和dig easy hyb混合液。n繼續(xù)在42 c下雜交6h 至過夜（單拷貝探針）。備注：n含有探針的dig easy hyb雜交液可重復(fù)利用，雜交結(jié)束后放入離心管中于-20 c保存，可重復(fù)使用幾次

17、，只需在使用前于68 c處理10分鐘即可n不要煮沸dig easy hyb雜交液雜交時注意事項n使用正確的雜交溫度（使用dig easyhyb，dna：dna3742c，rna：rna 68c，rna：dna 50c）n為防止尼龍膜干燥，在準(zhǔn)備好下一步處理用試劑之前不要倒掉正在用的溶液n使用合適的探針濃度n探針用之前68c 變性洗膜n2ssc，0.1%sds室溫下洗滌5分鐘，洗2次。n0.5ssc，0.1%sds 65-68溫和搖動15分鐘，洗2次。雜交后洗膜時注意事項n如果探針與靶dna 的同源性低于80%，熱洗時應(yīng)使用較低的溫度（如60c）n熱洗之前應(yīng)將洗膜液預(yù)熱到熱洗所需溫度免疫檢測n試

18、劑準(zhǔn)備同探針標(biāo)記效率測定n所有反應(yīng)在15-25c進行并輕輕搖動，n如果膜需再次使用，任何時候都不要讓膜干燥試劑準(zhǔn)備（1）nwashing buffer: 0.1m maleic acid, 0.15m nacl; ph 7.5(20); 0.3%(v/v) tween20. 15-25 stable. removal of unbound antibody.nmaleic acid buffer: 0.1m maleic acid, 0.15m nacl; adjust with naoh(solid) to ph 7.5(20)0 15-25 stable. dilution of bloc

19、king solution.ndetection buffer: 0.1m tris-hcl, 0.1m nacl, ph 9.5(20). 15-25 stable. ajustment of ph to 9.5. nte buffer: 10mm tris-hcl, 1mm edta, ph 8.0. 15-25 stable. stopping color reaction.試劑準(zhǔn)備（2）nblocking solution :用maleic acid buffer 10稀釋試劑6#（10blocking solution ），成1的工作液，即每9ml 1maleic acid buff

20、er中加入1ml 10blocking solution 混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。封閉膜上非特異性結(jié)合位點nantibody solution(ab) solution : 將4#試劑(anti-digoxigenin-ap conjugate)離心，按1：5000或1：10000加入blocking solution，2-8 c可放12小時。（每10ml 1blocking solution 加1ul ab抗體即可）.與地高辛標(biāo)記的探針結(jié)合。ncolor-substrate solution（顯色液）：從試劑5#(nbt/bcip)中取100ul到5ml detection buffer，要避光，現(xiàn)

21、配現(xiàn)用。顯示抗體結(jié)合的位點操作步驟（室溫下進行）n1雜交和洗膜后，用washing buffer( buffer1)浸泡1-5分鐘n2在50-100ml 1block solution（buffer2）中處理30分鐘n3用1block solution（buffer2）稀釋抗體dig-抗原偶聯(lián)物至150mu/ml（1:5000）n4用20ml antibody solution處理膜30分鐘n5用50-100ml washing buffer( buffer1)洗膜15分鐘，洗2次n6在20ml detection buffer（buffer3）中平衡2-5分鐘n7在10ml 新鮮配制的color substrate solution中處理膜5分鐘，放在塑料袋或盒